CN110791465B - 一种纳豆芽孢杆菌adt及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物环境领域，具体的说是一种从麦秸秆中提取的纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto）及其水生态修复中的应用。本发明提供的菌株命名为纳豆芽孢杆菌‑ADT，2019年09月保藏在于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2019762。将该菌株应用于水生态修复中，从水质指标来看，能够降解水中的有机物，有效降低水中的COD和氨氮，提升了水质状况及环境感观，具有良好的开发应用前景。

Description

一种纳豆芽孢杆菌ADT及其应用
技术领域
本发明属于微生物环境领域，具体的说是一种从麦秸秆中提取的纳豆芽孢杆菌ADT（Bacillus natto ADT）及其水生态修复中的应用。
背景技术
黑臭水体是近年来比较严重的环境问题，由于人类数量不断上升，城市的迅速发展，工业污水、生活污水的排放量不断增大，未经系统处理的污水直接排入河流，排放量远远超出了河道的原降解能力，使得水质恶化，透明度下降，水体呈现黑臭现象。水体中的生态系统遭到破坏，自我修复能力下降，随着污染物的不断排入，底泥和水质污染迅速恶化和积累，治理难度上升，严重影响居民的生活环境，危及居民的身体健康。现阶段我国河流面临严重的环境污染问题。
麦秸秆是麦类作物成熟收获后植物的残余部分，一般包含根、茎、叶、节等器官。从麦秸秆中提取纳豆芽孢杆菌的方法及将其用以水生态修复还未涉及。
发明内容
为解决以上问题，本发明的目的在于，提供一种纳豆芽孢杆菌的提取方法及其在水生态修复中的应用。
为实现上述目的，本发明采用技术方案为：
一种纳豆芽孢杆菌，纳豆芽孢杆菌ADT(Bacillus natto ADT)， 于2019年09月27日保藏于CCTCC-中国典型培养物保藏中心,保藏 地址：中国武汉，保藏编号：CCTCC M2019762。
所述菌株的提取步骤为：将麦秸秆用无菌的容器带回，使用盐渍法制取麦秸秆的样品液，取样品液梯度稀释，将不同浓度的培养液涂布于固体培养基上，37℃恒温培养24h，待其长出菌落后，挑取单菌落扩大培养，经现有方法逐步筛选分离。
所述菌株纳豆芽孢杆菌ADT的形态特征有菌落为灰白色，近圆形，表面干燥，不透明，有褶皱，无光泽，边缘不光滑成裂叶状，中央颜色深于边缘部分，在斜面上菌落成树状生长。该菌种是革兰氏阳性菌，分子生物学鉴定结果为：利用测序基因序列通过NCBI数据库进行16s rDNA序列比对，与纳豆芽孢杆菌关系最近。
一种纳豆芽孢杆菌ADT的应用，所述纳豆芽孢杆菌ADT（Bacillus natto ADT）在水生态修复中的应用。
所述水生态修复为河道、水库或湖泊的开放性水体的生态修复。
所述纳豆芽孢杆菌ADT（Bacillus natto ADT）在10-40℃下通过静置和/或曝气的方式对黑臭水体的水质进行改善同时降解水体中有机物。
一种修复水体的菌剂，菌剂为含有纳豆芽孢杆菌ADT的菌种培养液。
菌剂为纳豆芽孢杆菌ADT接种于LB液体培基中，30℃下120r/min经过24h制得的培养液。
本发明所具有的益处在于：
本发明纳豆芽孢杆菌ADT提取自麦秸秆，该菌株应用于水生态修复中，从水质指标来看，能够降解水中的有机物，有效降低水中的COD和氨氮，进一步的是对黑臭水体中的污染物有降解性，能够有效利用水体中的氨氮，黑臭水体中的COD能够降低，提升了水质状况及环境感观，具有安全性和稳定性，具有良好的开发应用前景。
本发明提供的纳豆芽孢杆菌ADT的提取原料及提取方法，其有益效果在于，经此方法得到的纳豆芽孢杆菌的质量更好，稳定性更高，在农业、水产养殖业和环境修复等应用中更安全，应用于水、土壤等自然环境中时适应性更强，积极参与自然界的碳循环和氮循环，在改善水质、改善土壤等方面效果更加显著，具有绿色环保的效应。大量推广应用可以减少对环境的不良影响，不产生二次污染。水生态修复是一个系统且复杂的过程。应围绕“外源阻断，内源控制，活水补源，生态修复”几个方面对河道进行生态治理。通过微生物降解河道里的污染物，虽然治理过程时间长，但是无二次污染，可持续性强。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的具体实施方式做进一步说明，应当指出的是，此处所描述的具体实施方式只是为了说明和解释本发明，并不局限于本发明。
实施例1：菌株的分离、筛选和鉴定
本发明提供的提取方法的原料：麦秸秆、无碘盐、高纯水之间的质量比例为10:2:3。
提取方法：将无碘盐分为两份，备用；将一份无碘盐和高纯水加入麦秸秆中，充分研磨，研磨后加入另一份无碘盐，温度调节到25-30℃培养24h，制得样品液；
取5ml的样品液加入已灭菌的LB培养基中，于37℃培养24h，取5ml培养液接种于新的已灭菌的LB培养基中，如此反复5代。取5代后的培养液按照梯度稀释，稀释浓度为10-3、10-4、10-5、10-6、10-7，将不同浓度稀释液涂布在分离培养基上，37℃恒温培养，待平板长出菌落后，挑取单菌落，于37℃培养24h，选取生长快，菌落大、数量多的菌落采用反复划线纯化后得到单菌落，并保存菌种。
菌株分离纯化过程中所用的培养基为LB培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，纯水1L，ph7-7.5，温度121℃灭菌20min。
分离培养基：称取蛋白胨 5.0g、牛肉膏 5g、尿素 0.85g、NaCl 2.3g、KCl 0.4g、CaCl2 0.3g、MgSO4 0.3g、K2HPO4 1.5g、葡萄糖5g,纯水1L，ph7-7.5，121℃灭菌20min。
菌株的形态特征：
纳豆芽孢杆菌（Bacillus subtilis）为革兰氏阳性菌，菌落为灰白色，近圆形，表面干燥，不透明，有褶皱，无光泽，边缘不光滑成裂叶状，中央颜色深于边缘部分，在斜面上菌落成树状生长。
菌种鉴定：将上述菌株进行测序，获得菌株的16s rDNA序列后，运用NCBI中的Blast程序与数据库中的细菌16s rDNA序列相似性进行比对，分析菌株为芽孢杆菌亚种-纳豆芽孢杆菌，而后将其于 2019年9月保藏于湖北省武汉市武昌区八一路，武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC M 2019762。
菌株的16s rDNA序列：
AAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCnACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGG
实例例2 某黑臭水体的应用
本实施例所用黑臭水体为济南某河道的水体，该河道内植被、动物的多样性差；河道内水体富营养化严重，水体发绿、表面漂浮有大量的蓝藻和绿藻，有些区域甚至出现死鱼现象。在有些河段淤泥较厚且黑臭。取样带回实验室检测,COD为133.86mg/L，氨氮为16.22mg/L,
将所述菌株由斜面培养基接至LB液体培养基，30℃下120r/min培养24小时制成种子液，取5ml所述的纳豆芽孢杆菌ADT（Bacillus natto ADT）的培养液施加于100ml该河道的样品液中，室温下放置。每过一段时间，测定COD和氨氮的浓度。结果如表1所示。
Figure DEST_PATH_IMAGE001
由表1可知，接种后的2天、4天、8天的COD，分别降低了42.91%、65.92%、75.25%；菌株接种2天、4天、8天后的氨氮分别降低了55.05%、76.76%和92.05%。降解效果较好。
序列表
<110> 中国科学院烟台海岸带研究所
青岛浩澳环保科技有限公司
<120> 一种纳豆芽孢杆菌 ADT及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 880
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
aagtcgagcg gacagatggg agcttgctcc ctgatgttag cggcggacgg gtgagtaaca 60
cgtgggtaac ctgcctgtaa gactgggata actccgggaa accggggcta ataccggatg 120
gttgtttgaa ccgcatggtt caaacataaa aggtggcttc ggctaccact tacagatgga 180
cccgcggcgc attagctagt tggtgaggta acggctcacc aaggcnacga tgcgtagccg 240
acctgagagg gtgatcggcc acactgggac tgagacacgg cccagactcc tacgggaggc 300
agcagtaggg aatcttccgc aatggacgaa agtctgacgg agcaacgccg cgtgagtgat 360
gaaggttttc ggatcgtaaa gctctgttgt tagggaagaa caagtaccgt tcgaataggg 420
cggtaccttg acggtaccta accagaaagc cacggctaac tacgtgccag cagccgcggt 480
aatacgtagg tggcaagcgt tgtccggaat tattgggcgt aaagggctcg caggcggttt 540
cttaagtctg atgtgaaagc ccccggctca accggggagg gtcattggaa actggggaac 600
ttgagtgcag aagaggagag tggaattcca cgtgtagcgg tgaaatgcgt agagatgtgg 660
aggaacacca gtggcgaagg cgactctctg gtctgtaact gacgctgagg agcgaaagcg 720
tggggagcga acaggattag ataccctggt agtccacgcc gtaaacgatg agtgctaagt 780
ggttaggggg tttccgcccc ttagtgctgc agctaacgca ttaagcactc cgcctgggga 840
gtacggtcgc aagactgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg 880

Claims (6)

1.一种纳豆芽孢杆菌，其特征在于：纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto）-ADT，于2019年09月27日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC M 2019762。
2.一种权利要求1所述的纳豆芽孢杆菌的应用，其特征在于：所述纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto）-ADT在水生态修复中的应用。
3.按权利要求2所述的纳豆芽孢杆菌的应用，其特征在于：所述水生态修复为河道、水库或湖泊的开放性水体的生态修复。
4.按权利要求2或3所述的纳豆芽孢杆菌的应用，其特征在于：所述纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto）-ADT在10-40℃下通过静置和/或曝气的方式对黑臭水体的水质进行改善同时降解水体中有机物。
5.一种修复水体的菌剂，其特征在于：菌剂为含有权利要求1所述纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto）-ADT的菌种培养液。
6.按权利要求5所述的修复水体的菌剂，其特征在于：菌剂为纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto）-ADT接种于LB液体培基中，30℃下120r/min经过24h制得的培养液。
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