CN109609384B - 一株小球藻Chlorella sorokinianaTX及其高密度快速培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株高产蛋白小球藻Chlorella sorokinianaTX及其高密度快速培养方法。本发明中保藏号为CGMCC No.16999的小球藻藻株，蛋白含量高达到68.9%，可以进行混养生长，在优化的培养基中培养4d，藻细胞浓度可达2.15×10⁸CFU/mL，开放条件下利用简易装置和自然光源培养4‑5d，藻细胞浓度可达9.9×10⁷CFU/mL。本发明的小球藻及其高密度快速培养方法，不仅能为水产养殖饵料提供优良的藻种资源，且该方法简单、易操作、成本低，可在生产上大规模推广应用，为水产养殖提供天然优质饵料，节约养殖成本。

Description

一株小球藻Chlorella sorokinianaTX及其高密度快速培养 方法

技术领域

本发明属于生物工程技术领域中的微生物发酵方法，涉及一株高蛋白含量小球藻Chlorella sorokinianaTX及其高密度快速培养方法。

背景技术

随着名优特水产品养殖业的迅速发展，在引种驯化、幼苗繁殖的过程中，幼苗的开口饵料生产是关键技术问题。小球藻由于蛋白质含量高，占干重的50%以上，含动物体所需的20种氨基酸、多种维生素和微量元素，以及亚麻酸、亚油酸、胡萝卜素等，营养成分丰富均衡，可直接作为鱼、虾、贝类的优质饵料，促进养殖生物生长及消化酶活性，还能降解养殖水体中亚硝酸盐、氨氮、硝酸盐和磷酸盐的含量，从而有效净化养殖水体。因此，小球藻备受养殖户的青睐，也被广泛应用于保健食品、天然产物类胡萝卜素、水产养殖饵料、畜牧饲料添加剂、生物质能源和污水处理等多个领域。但小球藻的生长周期相对较长，生物量低，限制了小球藻的规模生产和推广应用。通过优化小球藻生长所需的碳、氮、磷含量，可以提高小球藻的生长速率和生物量，但已有的研究大多是在实验室无菌条件下进行的，不适宜在生产上大规模推广应用。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一株高产蛋白小球藻Chlorella sorokiniana TX及高密度混养快速培养方法。本发明在自然环境中选育到一株蛋白含量高达68.9%的小球藻，并对其培养基配方进行了优化，发明了一种开放培养条件下的高密度快速培养方法，简化生产工艺，降低生产成本。

为实现上述目的，本发明公开了如下的技术内容：

本发明首先公布了一株小球藻藻株Chlorella sorokinianaTX，其保藏号CGMCCNo.16999。本发明从天津西青南美白对虾养殖池中分离到一株小球藻，并于2019年1月3日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地点：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，100101)经形态特征和18S rRNA鉴定其为Chlorella sorokiniana，按照国际命名规则命名为Chlorella sorokinianaTX。建议的分类命名：淡水小球藻Chlorella sorokiniana。

小球藻藻株Chlorella sorokinianaTX的生理、生化特性如下：

藻株为单细胞，球形，细胞直径为6-12μm，叶绿体占细胞大部分，能进行自养生长和混养生长，蛋白含量高达68.9%。

本发明第二方面公布了小球藻的快速培养方法，主要包括如下的内容：

1.小球藻无菌条件下快速培养方法（和现有研究比优化了培养基配方，进行混养培养）：

1）种子液的制备：无菌条件下挑取小球藻CGMCC No.16999单藻落到灭菌的本室改良的DS培养液中，培养至对数生长期，获得种子液，培养液的具体组成(g/L)如下：0.3g(NH₂)₂CO、0.05g KH₂PO₄、0.3g MgSO₄•7H₂O、0.008g FeSO₄•7H₂O、1.0g NaHCO₃、0.3g NH₄Cl；

2）培养基的优化：培养基中添加葡萄糖，并采用正交试验的方法对碳、氮、磷的含量进行优化，添加量为0.2-0.5g/L(NH₂)₂CO、0.03-0.06g/L KH₂PO₄、0.25-1.0g/LNaHCO₃、0.3-0.6g/L NH₄Cl、葡萄糖3-6g/L；

3）培养：将上述培养基灭菌，115℃灭菌20min，按10%接种，培养温度为25℃，光照强度为3500-4500Iux，光暗比14h:10h，每天定时摇动3次，培养4d后测藻液细胞浓度。

2.小球藻开放条件下的快速培养方法：

1）种子液的制备：无菌条件下挑取小球藻CGMCCNo.16999单藻落到灭菌的改良的DS培养液中，培养至对数生长期，获得种子液；

2）培养基优化：0.2g/L(NH₂)₂CO、0.03 g/L KH₂PO₄、0.75g/LNaHCO₃、0.5g/L NH₄Cl、0.1-0.9g/L葡萄糖、0.3g/L MgSO4•7H₂O、0.008g/L FeSO4•7H₂O；

3）培养：培养的容器可为玻璃缸、塑料袋等透光性强的容器，玻璃缸培养前用次氯酸钠消毒并冲洗干净，塑料袋建议用新的桶状塑料袋，水源用洁净的地下水或曝气后的自来水，接入10%藻种，利用自然光照敞口培养，培养4d后可收获。

本发明第三方面公布了快速培养方法在提高小球藻的生长速率和增加藻细胞浓度方面的应用。实验结果显示：采用本发明公开的快速培养方法，可以使小球藻的生长速率和藻细胞浓度实现了倍增，经过多次1000L规模的放大试验藻细胞浓度均达到了6.5×10⁷CFU/mL以上，培养时间4-5d，较传统的自养培养缩短一半。

本发明主要解决了小球藻生长周期长、生物量低的技术难题，重点考察了小球藻混养培养的培养基配方，主要的难点在于优化培养基配方使其在开放条件下能实现高密度规模培养。

本发明公开的一株小球藻Chlorella sorokinianaTX及其高密度快速培养方法与现有技术相比所具有的积极效果在于：

（1）本发明以混养的方式培养小球藻（能进行光合作用自养生长和利用葡萄糖进行异养生长就是混养生长），并优化了混养的液体培养基，使小球藻的生长速率和藻细胞浓度实现了倍增，藻细胞浓度达到2.15×10⁸CFU/mL，是优化前自养生长的26倍，发酵时间也从7d缩短到4d。

（2）本发明在无菌培养的基础上研发了一种开放培养的方法，生产工艺简单、培养时间短、成本低，培养后藻细胞浓度高，经过多次1000L规模的放大试验藻细胞浓度均达到了6.5×10⁷CFU/mL以上，培养时间4-5d，较传统的自养培养缩短一半。

附图说明

图1为开放条件下不同糖浓度对小球藻生长的影响。

具体实施方式

下面结合实施例说明本发明，这里所述实施例的方案，不限制本发明，本领域的专业人员按照本发明的精神可以对其进行改进和变化，所述的这些改进和变化都应视为在本发明的范围内。小球藻（中国普通微生物菌种保藏管理中心：CGMCC No.16999），藻种处于公开状态，科学工作者可以向保藏机构索取。本发明所用到的其他原料均有市售。

实施例1

小球藻在无菌条件下培养基优化

1）种子液的制备：无菌条件下挑取小球藻单藻落到灭菌的本室改良的DS培养液中，培养至对数生长期，获得种子液，培养液的具体组成(g/L)如下：0.3g (NH₂)₂CO、0.05gKH₂PO₄、0.3g MgSO₄•7H₂O、0.008g FeSO₄•7H₂O、1.0g NaHCO₃、0.3g NH₄Cl；

2）培养基的优化：培养基中添加葡萄糖，并采用正交试验的方法对碳、氮、磷的含量进行优化，每种物质设4个添加量，(NH₂)₂CO添加量为0.2、0.3、0.4、0.5g/L， KH₂PO₄添加量为0.03、0.04、0.05、0.06g/L，NaHCO₃添加量为0.25、0.50、0.75、1.0g/L、NH₄Cl添加量为0.3、0.4、0.5、0.6g/L，葡萄糖添加量为3、4、5、6g/L；

3）培养：将上述培养基灭菌，115℃灭菌20min，按10%接种，培养温度为25℃，光照强度为4500Iux左右，光暗比14h:10h，每天定时摇动3次。

4）测定：培养4d后将三角瓶置于摇床上200 r/min，25℃振荡30min，测藻液细胞浓度和吸光度值。

藻细胞浓度在（6.2-20.2）×10⁷CFU/mL之间，利于小球藻生长的最佳组合为A1B3C2D1E3，即当尿素的浓度为0.2g/L，氯化铵的浓度为0.5g/L，碳酸氢钠的浓度为0.75g/L，磷酸二氢钾的浓度为0.03g/L，葡萄糖的浓度为5g/L时利于小球藻生长。从极差大小分析，5个因子对小球藻的影响依次为葡萄糖﹥碳酸氢钠﹥尿素﹥氯化铵﹥磷酸二氢钾（表1）。方差分析（表2）可知，除磷酸二氢钾外其他4个因素对小球藻生物量均有显著影响。由于所选组合不在试验所设的16个组合内，对其进行了验证试验。结果表明，在优化的组合下培养4d后，小球藻藻细胞浓度达到2.15×10⁸ CFU/mL，为优化前的26倍，所选组合得到了成功验证。

表1 培养基优化直观分析结果（10⁷CFU/mL）

注：K1、K2、K3、K4分别为对应列指标的平均值，R为极差。

表2方差分析结果

实施例2

小球藻在开放条件下培养基优化

1）种子液的制备：无菌条件下挑取小球藻单藻落到灭菌的优化DS培养液中，培养至对数生长期，获得种子液；

2）培养基优化：0.2g/L(NH₂)₂CO、0.03g/L KH₂PO₄、0.75g/LNaHCO₃、0.5g/L NH₄Cl、0.3g/L MgSO4•7H₂O、0.008g/L FeSO4•7H₂O，葡萄糖的添加量共设9个处理，分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9g/L；

3）培养：将优化的小球藻培养基配方在开放条件下进行试验，即用250mL三角瓶装100 mL未灭菌的培养基，敞口培养，光照强度为4500Iux，光暗比14h:10h，每天定时摇动3次，培养4d后取样，测藻液细胞浓度和吸光度值。

从图1可知，在开放培养条件下，小球藻细胞浓度随葡萄糖含量呈先升后降的趋势，葡萄糖含量为0.3g/L时，藻细胞浓度达到9.9×10⁷CFU/mL，显著高于其它处理，为不加糖处理的12倍。培养基中的葡萄糖不仅能给小球藻提供碳源，同时也是多数细菌的优质碳源，在开放条件下培养基中添≥0.5g/L的葡萄糖，滋生的细菌对小球藻的生长产生一定的抑制作用，且随着时间推移会产生臭味。因此，开放培养葡萄糖的适宜添加量为0.3g/L。

实施例3

小球藻的规模扩培

3.5 L 玻璃缸扩培：筛选的小球藻开放培养配方在3.5L玻璃缸中放大培养，接种量为10%，光照强度为4500Iux，光暗比14 h:10 h，每天定时搅动3次，4 d后取样，藻细胞浓度达到6.5×10⁷CFU/mL。

65 L玻璃缸扩培：筛选的小球藻开放培养配方在65 L玻璃缸中放大培养，玻璃缸接种量为10%，自然光照，培养4个晴天后取样，藻细胞浓度达到7.2×10⁷CFU/mL。

1000 L玻璃槽和1000 L塑料袋扩培：将65 L玻璃缸中放大培养的藻液作为藻种，接种量为10%-15%，自然光照，培养4-6个晴天后取样，藻细胞浓度在（6.5-9.8）×10⁷CFU/mL之间，为不加糖的培养基中藻细胞浓度的10倍左右。此方法，无需特殊装置，无需灭菌，适合大面积推广应用，并在多个养殖场进行了多批次的成功放大试验。

Claims (4)

1.一株小球藻，分类为Chlorella sorokinianaTX，其保藏号CGMCC No.16999。

2.权利要求1所述的小球藻Chlorella sorokinianaTX无菌条件下快速培养方法，其特征在于按如下的步骤进行：

1）种子液的制备：无菌条件下挑取权利要求1中的小球藻CGMCCNo.16999单藻落到灭过菌的改良的DS培养液中，培养至对数生长期，获得种子液；所述改良的DS培养液具体组成(g/L)如下：0.3g (NH₂)₂CO₃、0.05g KH₂PO₄、0.3g MgSO₄•7H₂O、0.008g FeSO₄•7H₂O、1.0gNaHCO₃、0.3g NH₄Cl；

2）培养基的优化：培养基中添加葡萄糖，并采用正交试验的方法对碳、氮、磷的含量进行优化，优化后培养基的配方为：0.2g/L(NH₂)₂CO₃、0.03g/L KH₂PO₄、0.75g/LNaHCO₃、0.5g/LNH₄Cl、5g/L葡萄糖、0.3g/L MgSO4•7 H₂O、0.008g/L FeSO4•7 H₂O；光照强度为4500Iux，光暗比14h:10 h，每天定时摇动3次，培养4d后藻液细胞浓度达到2.15×10⁸CFU/mL。

3.权利要求1所述的小球藻Chlorella sorokinianaTX开放条件下的快速培养方法，其特征在于按如下的步骤进行：

1）种子液的制备：无菌条件下挑取权利要求1中的小球藻CGMCCNo.16999单藻落到灭菌的改良DS培养液中，培养至对数生长期，获得种子液；所述改良的DS培养液具体组成(g/L)如下：0.3g (NH₂)₂CO₃、0.05g KH₂PO₄、0.3g MgSO₄•7H₂O、0.008g FeSO₄•7H₂O、1.0g NaHCO₃、0.3g NH₄Cl；

2）培养基优化：优化后培养基组成为0.2g/L(NH₂)₂CO₃、0.03g/L KH₂PO₄、0.75g/LNaHCO₃、0.5g/LNH₄Cl、0.3g/L葡萄糖、0.3g/LMgSO4•7 H₂O、0.008g/L FeSO4•7 H₂O；

3）培养：培养的容器为玻璃缸、塑料袋透光性强的容器，玻璃缸培养前用次氯酸钠消毒并冲洗干净，水源用洁净的地下水或曝气后的自来水，接入10%藻种，利用自然光照敞口培养，培养4d后可收获。

4.权利要求2或3的快速培养方法在提高小球藻的生长速率和增加藻细胞浓度方面的应用。

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