CN1528127A - 一种用生物反应器培养葛仙米的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用生物反应器培养葛仙米的方法，1.培养液配制，采用硫酸镁、氯化钙、柠檬酸、柠檬铁铵、乙二酸四乙酸二钠盐、碳酸钠、微量元素液A5、磷酸氢二钾按比例配制；2.藻种制备，二或三级培养物得到的球形体的培养物作为培养的接种种源；3.生物反应器培养，控制温度、光强、培养液通气条件；4.制备接种物；5.培养；6.监控；7.收获；8.提高葛仙米球形体的机械强度；9.干燥。本发明方法易行、设备简单、操作方便、产量高，产品质量好、无污染、安全性高、生长过程短，广泛适用于城乡大规模的工业化生产。

Description

一种用生物反应器培养葛仙米的方法

                        技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体涉及一种利用生物反应器生产培养葛仙米的方法。

                        背景技术

葛仙米是一种蓝藻，原名“天仙米”，学名拟球形念珠藻(Nostoc sphaeroides)，是蓝藻纲，念珠藻科，念珠藻属的一个种。葛仙米是席上珍品，食疗珍品，药膳珍品。它甚称天下佳肴，名贵山珍。我国人民食用蓝藻的文字记载是世界上历史最悠久的，对葛仙米的认识也以有2000年了。据世界名著《本草纲目》记载：“葛仙米，生湖广沿溪山穴石上，遇大雨冲开穴口，此米随流而出。土人捞取，初取时如小鲜木耳，紫绿色，以醋拌之，肥绝可食。土名天仙菜，干则天仙米……。晋葛洪(注：东晋人，医学家，炼丹家，道教伦理家)隐此乏粮，采以为食，故名”。据鄂西先民世代传颂的传说，晋朝葛洪南贬途径走马患疾，迫灾荒采葛仙米以食之，奇获身疾康复之功效。后，洪入朝歌，以此奉献皇上，体弱多病的太子食之，病除体壮，皇帝娘娘食之，四处求医无法治愈的夜盲症病除，皇感洪恩，随将“天仙米”赐名“葛仙米”。葛仙米营养丰富，蛋白质含量高(52-56％)，氨基酸组分齐全，含有丰富的生物活性多糖(8-12％)，维生素含量是猕猴桃的3倍以上，比柑橘高15倍，其含量接近鲜枣；富含不饱和脂肪酸和多种矿质元素如P.S.K.Ca.Fe.Se等十分丰富。因此，葛仙米具有强身健体和许多医疗保健等功效。据《全国中草药汇编》介绍：“葛仙米性寒、味淡，可以清热、收敛、益气、明目。主治夜盲症、脱肛，外用可治烧伤，烫伤。”由于葛仙米的生态生境比较特殊，葛仙米的生长对自然条件的选择极为严格。它的生长繁殖受生态条件所限制，因而在国内，仅在我国个别山区的少数稻田中生长。葛仙米要求的生长条件是多种多样的，如矿质营养，温度，光照，水的酸碱度，以及有无有害气体、农药、自然天敌等。全球气候变暖，环境变化和污染已不是短期内凭一部分人的意志可以改变的，欲求粮食的丰收，农药与化肥的使用也不可避免。于是矛盾就出来了，一方面是葛仙米产量下降，产品质量逐步降低；而人们的需求上升，另一方面是产地减少，加上大量采收，自然生态遭到破坏，使得本来就贫乏葛仙米的产量不断下降。

                          发明内容

本发明的目的在于提供一种利用生物反应器培养葛仙米的方法，此方法易行，操作方便，适宜工业化生产；解决了葛仙米生长快，产量高、成本低的问题。

为了达到上述目的，本发明采用了以下技术措施：

A、培养液配制：将称好或配制好的贮藏液加入水中的顺序是：按每升水中加入硫酸镁0.07-0.08g、氯化钙0.03-0.042g、柠檬酸0.005-0.007g、柠檬铁铵0.005-0.007g、乙二酸四乙酸二钠盐(EDTA)0.001-0.002g、碳酸钠0.03-0.05g、微量元素A51mL、磷酸氢二钾0.07-0.09g，即可得培养液。

B、葛仙米种子制备：

1)一级种子：由试管原种接到小三角瓶(150ml)，静止培养或通气培养；培养到出现细微小颗粒后转入二级种子培养。

2)二级种子：由一级种子接到500-1000ml培养瓶通气培养，达到微小圆珠状后进入三级种子培养。

3)三级种子：由二级种子接入到5-10L培养瓶进行养殖，葛仙米颗粒达到小颗粒状时，转入规模化养殖容器中(10L以上容器)进行生产。

4)二或三级培养物得到的球形体长到约直径0.8-1.2mm的培养物就可作为大量培养的接种种源；也可用收获物中通过筛滤出的直径在1-1.5mm的葛仙米小球体作为种子继续培养。

C、生物反应器培养(普通生物反应器)：

1)采用一般生物反应器：该装置可以控制温度、光强、营养液及通气条件等；控制温度28-30℃，光强80-100μE.m^-2.s^-1，容积180-240l/个。

2)培养场地与培养器：可在室内或塑料大棚中，有条件的地方也可在玻璃温室安置光生物反应器。并配备一个孔径约0.5cm的不锈钢筛，用来筛选合格的球形体。

3)接种与培养：按每升培养液0.5-2g湿重的比例接种于光生物反应器中。用空气充气泵通气(通气起到搅动和提供CO₂的作用)以5-10L/min的速度从通气口通气。为了减少气体对培养物的污染，进入反应器之前，将气体以棉花过滤。通气量由阀门控制。

D、监控：

建立的监控条件和标准。温度：25-30℃；光强700-800μE.m^-2.s^-1：pH：8.0-8.5；其它细菌(主要有粘细菌)、真菌(主要为霉菌类)和杂藻(主要有小球藻等单细胞绿藻)检测：(1)涂平板法：将培养液涂布在细菌培养的基本培养基上，37℃温培24小时后，观察是否由菌落出现；(2)显微观察：取少量培养液，加入DAPI(一种荧光染料)至终浓度1μg/ml染色5分钟，在荧光显微镜下用紫外光激发观察。若发现有蓝绿运动亮点，即为杂菌污染。(3)显微镜下直接观察是否有杂藻存在。营养盐浓度检测方法参看美国出版的Standard Methods for Water and Waste Water一书。

若检测的值不在上述范围内，则需通过相应的措施解决。如：温度可通过调节室内温度控制；光强度：光生物反应器内光强较稳定(700-800μE.m^-2.s^-1)；pH通过酸或碱调节。微生物污染严重时则需彻底更换培养液，并对反应器进行灭菌处理。营养不足时则注入新鲜培养液或添加营养盐等。

E、收获：将欲收获葛仙米培养物通孔略小于0.5cm的不锈钢筛子过筛。直径0.5cm左右的球形体留在筛子上，这些就是所要获得的葛仙米产品。筛下来的葛仙米小群体和培养液经处理后继续作种子培养。

F、提高葛仙米球形体的机械强度：将过筛后直径大于0.5cm的葛仙米球形体通过下面任一途径提高机械强度。一种是在培养液中加入1.5g/L的碳酸钠，将球形体转移到这种含有新鲜培养液中，以培养时的同样条件通气培养3-5天，收获即可；另一种是将合格的球形体静置于原培养液中，于低温下(1-10℃)静置10-15小时。并注意，在静止时，要将反应器置于少于10μE.m^-2.s^-1的光强下以防止球形体的裂解。

G、干燥：收获的球形体若不及时干燥，就会腐烂变质。干燥时，由于球形体胞外具有的多糖有高粘性，因此极易与盛放器皿黏结在一起。因此在干燥时把藻体放在绢布或丝网上就可避免黏结。干燥的方法有：筛干，风干或烘干。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：方法易行、设备简单、操作方便、产量高，产品质量好、无污染、安全性高、生长过程短，可广泛适用于城乡大规模的工业化生产。葛仙米培养的过程中吸收二氧化碳，并向大气中排放出氧气，可起到净化空气的作用，不产生有害或有毒物质，培养液盐度低，酸碱度接近于自然水体，可循环利用。生长过程短，葛仙米生长快，10天就可完成对数生长，效率高，适量接种的培养物，20天后产量可达2-2.5g(干重)/l，每立方米培养液可收获2kg干藻。

                       具体实施方式

利用生物反应器培养葛仙米方法的具体实施步骤如下：

1、培养液配制：将称好或配制好的贮藏液加入水中的顺序是：按每升水这加入硫酸镁0.075g、氯化钙0.036g、柠檬酸0.006g、柠檬铁铵0.006g、乙二酸四乙酸二钠盐(EDTA)0.001g、碳酸钠0.03g、微量元素A51ml、磷酸氢二钾0.07g。

2、葛仙米种子制备：

2.1一级种子制备：由试管原种接到小三角瓶(150ml)，放置在培养架(或箱)上，在光照10μE.m^-2.s^-1，温度28℃条件下静止培养或通气培养；培养到出现细微小颗粒后转如二级种子培养。

2.2二级种子制备：由一级种子接到500-1000ml培养瓶，放置在培养架(或箱)上，在光照50μE.m^-2.s^-1，温度28℃条件下通气培养，达到微小圆珠状后进入三级种子培养。

2.3三级种子制备：由二级种子接入到5-10L培养瓶进行养殖，在光照80μE.m^-2.s^-1，温度28℃条件下通气培养，葛仙米小颗粒达到约直径在1mm左右时，为制备好的规模化生产所用的种子。

3.接种培养(生物反应器培养)：

3.1生物反应器：可以控制温度、光强、营养液及通气条件等；控制温度28-30℃，光强100μE.m^-2.s^-1，容积180L/个。

3.2培养场地与培养器：可在室内或塑料大棚中，有条件的地方也可在玻璃温室安置光生物反应器。并配备一个孔径约0.5cm的不锈钢筛，用来筛选合格的球形体。

3.3接种与培养：按每升培养液0.5-2g湿重的比例接种于光生物反应中。用空气充气泵通气(通气起到搅动和提供CO₂的作用)以5-10L/min的速度从通气口通气。为了减少气体对培养物的污染，进入反应器之前，将气体以棉花过滤。通气量由阀门控制。

4、监控：

建立的监控条件和标准。温度：28℃；光强800μE.m^-2.s^-1：pH：8.0；其它微生物如细菌，真菌和杂藻检测：(1)涂平板法：将培养液涂布在细菌培养的基本培养基上，37℃温培24小时以上后，观察是否由菌落出现；(2)显微观察：取少量培养液，加入DAPI(一种荧光染料)至终浓度1μg/ml染色5分钟，在荧光显微镜下用紫外光激发观察。若发现有蓝绿运动亮点，即为污染微生物。(3)显微镜下直接观察是否有杂藻存在。营养盐浓度检测方法参看美国出版的Standard Methods for Water and Waste Water一书。若检测的值不在上述范围内，则需通过相应的措施解决。如：温度可通过调节室内温度控制；光强度：光生物反应器内光强较稳定(700-800μE.m^-2.s^-1)；pH通过酸或碱调节。微生物污染严重时则需彻底更换培养液，并对反应器进行灭菌处理。营养不足时则注入新鲜培养液或添加营养盐等等。

5、收获：将欲收获葛仙米培养物通孔略小于0.5cm的不锈钢筛子过筛。直径0.5cm左右的球形体留在筛子上，这些就是我们所要获得的葛仙米产品。筛下来的葛仙米小群体和培养液经处理后继续作种子培养。

6、提高葛仙米球形体的机械强度：将过筛后直径大于0.5cm的葛仙米球形体通过下面任一途径提高机械强度。一种是在培养液中加入1.5g/L的碳酸钠，将球形体转移到这种含有新鲜培养液中，以培养时的同样条件通气培养3-5天，收获即可；另一种是将合格的球形体静置于原培养液中，于低温下(1-10℃)静置10-15小时。并注意，在静止时，要将反应器置于少于10μE.m^-2.s^-1的光强下以防止球形体的裂解。

7、干燥：收获的球形体若不及时干燥，就会腐烂变质。干燥时，由于球形体胞外具有的多糖有高粘性，因此极易与盛放器皿黏结在一起。因此在干燥时把藻体放在绢布或丝网上就可避免黏结。干燥的方法有：筛干，风干或烘干。

Claims (1)

1、一种用生物反应器培养葛仙米的方法，包括下列步骤：

A、培养液配制：按每升水加入硫酸镁0.07-0.08g、氯化钙0.03-0.042g、0.001-0.002g、碳酸钠0.03-0.05g、微量元素A51ml、磷酸氢二钾0.07-0.09g；

B、葛仙米种子制备：一是一级种子制备，由试管原种接到三角瓶，放置在培养架上，在光照10μE.m^-2.s^-1，温度25-30℃条件下静止培养，培养到小颗粒后转二级种子培养；二是二级种子制备，由一级种子接到培养瓶，放置在培养架上，在光照10μE.m^-2.s^-1，温度25-30℃条件下通气培养，达到圆珠状后进入三级种子培养；三是三级种子制备，由二级种子接入到培养瓶进行养殖，在光照10μE.m^-2.s^-1，温度25-30℃条件下通气培养，葛仙米颗粒直径在0.8-1.2mm时，为制备好的规模化生产所用的种子；

C、生物反应器培养：一是采用生物反应器：控制温度28-30℃，光强80-100μE.m^-2.s^-1，容积180-240L/个；二是培养场地与培养器：在室内或塑料大棚中，有条件的地方也可在玻璃温室安置光生物反应器；三是接种与培养：按每升培养液0.5-2g湿重的比例接种于光生物反应中，用空气充气泵通气，以5-10L/min的速度从通气口通气，进入反应器之前，将气体灭菌以棉花过滤，通气量由配气阀门控制；

D、监控：建立的监控条件和标准为，温度：28-30℃，光强700-800μE.m^-2.s^-1，pH：8.0-8.5；

E、收获：将收获葛仙米培养物通孔小于0.5cm的不锈钢筛子过筛，直径0.5cm的球形体留在筛子上，为葛仙米产品，筛下来的葛仙米小群体和培养液经处理后继续作种子培养；

F、提高葛仙米球形体的机械强度：将过筛后直径为0.5cm的球形体在培养液中加入1.5g/L的碳酸钠，将球形体转移到含有新鲜培养液中，以培养时的同样条件通气培养3-5天，收获即可；

G、干燥：干燥时把藻体放在绢布或丝网上就可避免黏结，干燥有筛干，风干或烘干。