CN105907687A - 一种利用水华藻类为基质培养光合细菌的方法 - Google Patents

一种利用水华藻类为基质培养光合细菌的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公布了一种利用水华藻类为基质培养光合细菌的方法，其步骤：A:水华藻类收集：将富营养化湖泊中藻类聚集区域的富藻水通过收藻机器采收，风干后制成干藻粉。B：光合细菌菌种获得：以野外水体为种源分离培养获得光合细菌菌种，保存于ATYP液体培养基。C：光合细菌培养：培养容器为透明玻璃管，将干藻粉以一定比例加入培养装置，添加蒸馏水或自来水或湖水制成光合细菌替代培养基质。接种少量光合细菌，构成完整的培养体系进行密闭光照培养。D：光合细菌收获：定期取样测定细菌光密度表征细菌生物量，光合细菌生物量达到生长稳定期开始收获。该方法具有产量高、操作简便、成本低，同时可用于实现水华藻类的资源化利用。

Description

一种利用水华藻类为基质培养光合细菌的方法
技术领域
本发明属于微生物技术领域，更具体涉及一种资源化利用水华藻类为基质培养光合细菌的方法，尤其适用于光合紫邑非硫细菌的大规模培养，可应用于蓝藻大规模暴发期蓝藻的后续处理及资源化利用。
背景技术
随着社会经济的发展和人口的增加，中国水环境污染问题日趋严重。许多湖泊水库均存在一定程度的富营养化问题，如巢湖、滇池、太湖等。大规模蓝藻爆发期，机械打捞是重要的应急处理方法。针对蓝藻打捞后难以处理并造成二次污染的问题，本发明拟用水华蓝藻作为基质应用于光合细菌的规模化培养，实现水华蓝藻资源化利用的同时降低蓝藻污染物释放的生态风险。
光合细菌可利用环境中的硫化物合成自身蛋白或将硫以胞外或胞内的形式储存。此外，光合细菌对氨有较强的耐受能力，显著降解部分有机物，对富营养限制元素磷也有较高的利用吸收能力。光合细菌以其独特多样的代谢模式广泛应用各种废水处理领域，如皮革工厂废水，啤酒废水，豆制品加工废水，养殖场废水处理。光合细菌含有丰富的蛋白，常被应用于水产养殖中鱼虾贝类的开口饵料。同时光合细菌繁殖产生有益的次生代谢产物，可提高动物的抗病能力。利用微生物生产环境友好型清洁能源成为近年来科研工作者的研究热点。光合紫细菌(沼泽红假单胞、球形红细菌、红螺菌)在其化能自养型代谢模式下产氢含量高，产出速率高。对数生长期后期及稳定期光合细菌积累聚β羟基丁酸酯(PHB)，可用于生产环境友好型热塑材料。
鉴于光合紫细菌应用广泛、应用价值高，寻找低廉高效的细菌富集方法以实现光合细菌的规模化生产及应用具有重要现实意义。目前常见的用于光合细菌培养的基质大部分为人工配置培养基(如CN201510691293.7、CN201510390687.9、CN201410129972.0、CN201210556700.X、CN200810137444.4、CN200310012620.8、CN201010546482.2、CN201010540835.8等)。需购买大量化合物，所需费用高。为节约成本，也有利用生物基质作为替代培养基，如指天椒茎秆、叶为原料(CN201510179689.3)、白玉米面为原料(CN201410523952.1)等)。本方法利用富营养化湖泊中频繁爆发的蓝藻水华作为培养基质，在资源化利用有害蓝藻的同时实现规模化富集光合细菌，降低蓝藻堆积区营养负荷及其造成二次污染的生态威胁。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种利用水华藻类为基质培养光合细菌的方法，利用富营养化水体频繁爆发的藻类水华为微生物培养基质实现光合细菌的大规模富集，并显著降低了大量藻类堆积可能造成的二次生态危害。能有效的用于光合细菌的富集且高效经济，简易可行。经发酵处理后，培养体系中氨态氮、总氮、总磷平均分别可降低至少50％、45％、95％，藻类释放的微囊藻毒素浓度3天后即可降至检出限。
为了达到上述的目的，本发明采用以下技术方案：
本发明的思路分析：藻体含有大量的可溶性糖、蛋白质等，堆积时可产生恶臭，其自然发酵产生的发酵液含有大量的有机物、氨氮、可溶性磷等，进入水体或土壤，对环境可造成二次环境威胁。光合细菌作为水处理中常用的益生菌对有机物有较强的利用能力、对高浓度氨态氮有一定的耐受能力，在菌体生长过程中将发酵液中可溶性磷、氮、有机质等转化为生物质能源。光合细菌的大规模富集过程最终实现了培养体系中营养负荷的降低，实现废物资源化同时降低生态风险。以此为基础建立的光合细菌大规模富集方法菌体产出高、操作简便、运行费用低、抗环境污染能力强，易于实现光合细菌的大规模培养及应用。
其技术构思是：一种利用水华藻类为基质培养光合细菌的方法，该方法是建立一种应用水华藻类为生物基质规模化富集光合细菌的技术，利用藻体发酵产生的小分子有机酸、可溶性氮、磷、维生素、微量元素等实现光合细菌的富集，变废为宝，同时降低大量藻类堆积产生的二次环境威胁。
一种利用水华藻类为基质培养光合细菌的方法，其步骤是：
A、水华藻类收集：藻类水华暴发期，在风力作用下大量藻类聚集于岸边表层水体。将富营养化湖泊中藻类聚集区域的富藻水通过收藻机器(可商购或租用大型收藻设备，如微滤收藻设备、振动斜筛过滤设备)进行采收浓缩(浓缩倍数需达到1000倍以上，收获物成藻泥状态)，浓缩后收获的藻泥(含水率低于95％)挂浆在载体上进行晾晒干燥或通风晾干(藻细胞中的营养物质完好保存而不被光降解)，最后收获干藻粉保存备用。
B、光合细菌菌种获得：用于扩大培养的光合细菌菌种来源为野外水体或沉积物，在光照条件下(光照度不低于1000Lux)经富集培养后，10倍梯度稀释接种于双层固体琼脂培养基进行分离。当培养基上有明显可见的细菌菌落出现时进行下一步的涂布培养，获得单菌落，保存于ATYP培养基。所述的光合细菌菌种本领域的普通技术人员均可培养或购买市售的较纯光合细菌菌种进行活化培养(本领域的普通技术人员不付出任何创造性劳动均能培养)。
C、光合细菌培养：培养容器为选择透光较好的容器(如玻璃管或塑料袋等透明容器)。将收获的野外蓝藻水华干藻粉以一定比例(藻粉用量不低于1g/L)加入玻璃管或塑料袋等透明容器中，添加自来水或湖水浸泡藻粉12-20h左右制成光合细菌替代培养基质，干藻粉浸泡后大量营养盐释放，完全满足光合细菌的规模化培养，营养盐含量见图1，接种少量光合细菌：初始接种量OD650nm不低于0.02，细胞数约为2×107个/mL以上，构成完整的培养体系进行密闭光照培养，在温度(25-35℃)和光照(光照度不低于1000Lux)条件下进行富集培养。培养周期7-15天依藻粉的添加量而定(不同藻体浓度下光合细菌生长曲线见图2)。
D、光合细菌收获：利用光密度值(OD650nm)、细菌叶绿素浓度或细菌干重表征光合细菌的生物量，当光合细菌生物量达到生长稳定期后开始收获。对经光合细菌光发酵处理过的培养液中氮、磷等营养物质含量的测定参照《水和废水监测分析方法(第四版)》。当培养液中氮、磷等营养盐物质含量急剧下降，总磷的去除率达到95％以上时停止培养或继续添加藻粉基质或P源进行连续培养。
收获的光合细菌密度高，生物量大；同时光合细菌总酯(Lips)、聚β羟丁酸(PHB)含量均较高；收获的光合细菌活性好，应用潜力大。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：
1)本方法经济可行，所需原材料为富营养化湖泊中藻类水华爆发期存在的大量藻类(主要为蓝藻)，实现藻类资源化利用的同时可降低光合细菌规模化生产成本。
2)本方法可显著降低藻类基质释放的大量氮、磷、有机物等含量，并经光发酵厌氧处理后，藻毒素同时被微生物降解。降低水华藻类直接堆积带来的二次污染。
3)本方法操作简便，实用性高，可以很好地实现光合细菌的大规模富集培养。
4)通过对不同藻粉基质用量、光照等条件对光合细菌生长的影响实验获得最佳的光合细菌生长条件，结果发现藻粉基质生物量最佳培养浓度为3-10g/L，培养周期1-2周达到生长稳定期，收获的光合细菌生物量随着藻体浓度的升高而升高，光合细菌光密度值大于1对应的藻体浓度为3.33g/L，当藻体浓度达到10g/L时，光合细菌光密度值大于5(见图2)；最佳的光照条件为光照度不低于1000Lux(见图3)；
5)探讨了培养体系内TN、TP等营养盐利用情况，结果表明可溶性TP可快速被利用，实验周期15天可利用95％以上，可溶性TN也降低40％以上(见表2)；
附图说明
图1为一种野外藻体与ATYP培养基体系中营养盐(TN、TP等)含量对比示意图。
野外藻体营养盐(TN、TP及COD等)含量除TP外，与光合细菌ATYP培养基体系中营养盐含量基本一致，完全满足光合细菌大量培养的营养盐需求。
图2为一种不同藻体浓度下一个培养周期内光合细菌光密度值(OD650nm)变化示意图。
不同藻体浓度下，一个培养周期内光合细菌生物量随着藻体浓度的升高而升高，光合细菌光密度值大于1对应的藻体浓度为3.33g/L，当藻体浓度达到10g/L时，光合细菌光密度值大于5。
图3不同光照条件下光合细菌生物量和Bchl a浓度的变化示意图。
不同光照强度条件下，光照越强，光合细菌生物量(OD650)也会相对高。弱光条件下光合细菌缓慢增长，稳定期可能会延长数天。低光有利于细菌的保存。出于经济及省时考虑，光照水平1000lux以上用于细菌的培养较合适。
具体实施方式
实施例1：
一种利用水华藻类为基质培养光合细菌的方法，其步骤如下：
A、水华蓝藻收集：水华蓝藻暴发期在风力作用下大量藻类聚集于岸边表层水体。将富营养化湖泊中藻类聚集区域的富藻水通过收藻机器进行采收浓缩(浓缩倍数需达到1000倍以上，收获物成藻泥状态)，浓缩后收获的藻泥挂浆在载体上进行晾晒干燥或通风晾干(藻细胞中的营养物质完好保存而不被光降解)，最后收获干藻粉保存备用。
B、光合细菌获得：采集武汉东湖沉积物，并将其与原位表层水样混合成泥浆作为菌种种源。利用富集培养基富集光合细菌至容器内壁可见明显的紫红邑微生物群。梯度稀释，涂布培养，获得单菌落。通过菌落PCR，初步确定为光合紫邑非硫细菌。划线分离至获得纯菌株，经克隆测序确定为红螺菌科红假单胞菌属的沼泽红假单胞菌Rhodopseudomonaspalustrisstrain PUF1(accession number KU886140)，保存于ATYP培养基。实验过程接种处于对数生长期光合细菌，初始接种量OD650nm 0.02以上，细胞数约为2×107个/mL。
C、光合细菌培养：小规模反应装置选择透光较好的250mL血清瓶，较大规模培养选择10L血清瓶。于培养装置中依次加入干藻粉(收获的野外蓝藻水华)、蒸馏水、菌种(沼泽红假单胞菌)，室内26度恒温静置培养。藻粉用量在0.84-10g/L，光合细菌初始量0.035(OD650nm)，在温度25或28或30或33或35℃和光照条件下进行富集培养。光照不低于3000lux。梯度实验表明藻粉的最低添加浓度为1.67g/L，当藻粉浓度低于0.84g/L时，细菌不生长或仅有微弱的生长。培养周期依藻粉的添加量而定。较低浓度藻体(1.67-3.33g/L)细菌7天即可达到稳定增长期；较高浓度藻体(6.67-10g/L)，达到稳定期时间较长，通常需10天以上。
D、光合细菌收获：利用光密度值(OD650nm)、细菌叶绿素浓度(Bchl a)及干重等指标表征光合细菌的生物量，当光合细菌生物量达到生长稳定期后开始收获。通过总酯(Lips)、聚β羟丁酸(PHB)含量评价藻粉方法富集光合细菌的品质(见表1)。发酵液中微囊藻毒素的测定采用PAD高效液相邑谱。藻毒素由受损的藻细胞在较短时间内释放到培养体系中，3天后检测浓度低于检出限。结果表明，厌氧发酵过程中藻毒素极容易被微生物生物降解。实验结束，培养体系中可溶性总氮、总磷、氨态氮的去除率均较高(见表2)，其中光合细菌对磷的去除率最高，5天即可达88％以上。
收获的光合细菌密度高，生物量大；同时光合细菌总酯(Lips)、聚β羟丁酸(PHB)含量均较高；收获的光合细菌活性好，应用潜力大。
本发明在实验室可控条件下开展了以下实验，并具有一定的积极效果：
1)通过对不同藻粉基质用量、光照等条件对光合细菌生长的影响实验获得最佳的光合细菌生长条件，结果发现藻粉基质生物量最佳培养浓度为3-10g/L，培养周期1-2周达到生长稳定期，收获的光合细菌生物量随着藻体浓度的升高而升高，光合细菌光密度值大于1对应的藻体浓度为3.33g/L，当藻体浓度达到10g/L时，光合细菌光密度值大于5(见图2)；最佳的光照条件为光照度不低于1000Lux(见图3)；
2)探讨了培养体系内TN、TP等营养盐利用情况，结果表明可溶性TP可快速被利用，实验周期15天可利用95％以上，可溶性TN也降低40％以上(见表2)；
表1培养光合细菌生物量、脂质、羟丁酸含量
表2不同藻体浓度下培养体系可溶性总氮、总磷、氨态氮的去除率

Claims (1)

1.一种利用水华藻类为基质培养光合细菌的方法，其步骤是：
水华藻类收集：藻类水华暴发期，在风力作用下大量藻类聚集于岸边表层水体，将富营养化湖泊中藻类聚集区域的富藻水通过收藻机器进行采收浓缩，浓缩后收获的藻泥挂浆在载体上进行晾晒干燥，或通风晾干，最后收获干藻粉保存备用；
光合细菌菌种获得：用于扩大培养的光合细菌菌种来源为野外水体或沉积物，在光照条件下经富集培养后，10倍梯度稀释接种于双层固体琼脂培养基进行分离，培养基上有细菌菌落出现时进行下一步的涂布培养，获得单菌落，保存于ATYP培养基；
3）光合细菌培养：培养容器选择透光的容器，将收获的野外蓝藻水华干藻粉用量不低于1 g/L，加入玻璃管或塑料袋透明容器中，添加自来水或湖水浸泡藻粉12－20h制成光合细菌替代培养基质，干藻粉浸泡后大量营养盐释放，满足光合细菌的规模化培养，初始接种量OD650 nm不低于0.02，光合细菌细胞数为2 × 107个/mL，构成完整的培养体系进行密闭光照培养，在温度和光照条件下进行富集培养，培养周期5-15天依藻粉的添加；
4）光合细菌收获：利用光密度值、细菌叶绿素浓度或细菌干重表征光合细菌的生物量，光合细菌生物量达到生长稳定期后开始收获，对经光合细菌光发酵处理过的培养液中氮、磷营养物质含量的测定，培养液中氮、磷营养盐物质含量下降，总磷的去除率达到95%时停止培养或继续添加藻粉或P源进行连续培养。
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