CN1603403A

CN1603403A - 耐盐红螺菌剂的应用培养技术

Info

Publication number: CN1603403A
Application number: CN 200410060953
Authority: CN
Inventors: 邱宏端; 袁重桂; 林本兴; 林娟; 朱航; 郑杰华
Original assignee: Fuzhou University
Current assignee: Fuzhou University
Priority date: 2004-10-11
Filing date: 2004-10-11
Publication date: 2005-04-06

Abstract

本发明涉及一种应用海水养殖效果好、应用菌剂培养费用低的耐盐红螺菌剂的应用培养技术。耐盐红螺菌的选育为从海水中富集、平板分离、菌株功能选育、耐盐红螺菌功能优化菌株。应用培养技术包括培养基优化与应用培养工艺条件的改进。培养基优化是从碳源、氮源、无机盐及生长因子等成分进行优化，获得降低47％培养基成本的应用型配方。应用菌剂培养采用应用型配方，接种后置于白色塑料温棚下日光培养。本发明的耐盐红螺菌株可在0.1～4％NaCl浓度下生长，在淡水、海水养殖中均可收到良好的应用效果。其应用培养技术大大降低了光合细菌培养的成本与设备投入。耐盐红螺菌剂的应用培养在上述条件下达到每毫升亿个细胞的使用浓度要求。

Description

耐盐红螺菌剂的应用培养技术

技术领域：

本发明涉及耐盐红螺菌的选育，应用型培养基配方的筛选以及应用培养菌剂的方法。确切地说，它是提供了在淡水、海水养殖中都能应用的光合细菌菌剂，且提供了一种能大幅度降低培养基成本的应用型配方，和减少设备、降低能耗、培养操作工艺简单的低成本应用培养技术。

背景技术：

光合细菌是国内外致力于开发的微生物资源。在光合细菌类群中，红螺菌科光合细菌能在有氧、无氧下异养生长，因而在废水生物处理与水产养殖的应用中得以越来越广泛的关注。目前，我国水产养殖微生态菌剂多为红螺菌科细菌，如胶质红假单胞菌、沼泽红假单胞菌、荚膜红假单胞菌等。从菌剂的应用情况看，主要存在以下问题：(1)菌种耐盐性能差，现有光合细菌菌剂适应盐浓度多为0.1～2％，由于菌剂生长盐浓度范围较小，造成在较高盐度的海水养殖中应用难以发挥作用；(2)菌剂培养成本高，现有菌剂培养多采用经典培养基配方，培养基灭菌与灯光光源光照培养的技术，致使培养成本提高，菌剂售价偏高，影响了光合细菌在水产养殖中的推广应用。为此，筛选能在淡水、海水养殖中应用的耐盐红螺菌，开发能大幅度降低应用培养红螺菌剂的成本，和开发易于操作的培养技术，对推进光合细菌应用与促进水产无公害养殖、提高鱼虾等水产动物养殖的质量具有重要的意义。

红螺菌科光合细菌属于光能异养、兼性厌氧微生物。从营养成分看醋酸盐等小分子有机物是适宜的碳源，并适宜在30℃左右、光照强度为1000～3000LX下生长。培养光合细菌除需要碳源、氮源、无机盐营养物质外，还需要生长素。经典的光合细菌(红螺菌科)培养基配方成分有11～13种，培养过程常采用培养基灭菌与灯光光源光照培养的模式(有些菌株还采用光照厌氧培养)。

经检索，在微生物分类书籍及发表在《生物技术》1995年第3期、《哈尔滨师范大学自然科学学报》1999年第6期等资料中均提到光合细菌(红螺菌科)经典培养基配方为：CH₃COONa3.0g，CH₃CH₂COONa 0.3g，(NH₄)₂SO₄ 0.3g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，K₂HPO₄ 0.3g，KH₂PO₄ 0.5g，CaCl₂50mg，酵母膏0.1g，谷氨酸0.2mg，蛋白胨10mg，MnSO₄ 2.5mg，NaCl 1.0g FeSO₄ 5mg，H₂O 1L，pH7.4。由配方中可看出，培养基成分为13种，利用经典配方培养光合细菌应用菌剂，培养基成本较高。

发明内容：

本发明旨在从根本上解决红螺菌剂耐盐性能与应用海水养殖效果较差，以及应用菌剂培养费用高的问题，提供一种耐盐性能好、在淡水、海水养殖中均能发挥良好的功效、应用型培养基配方的成本低的耐盐红螺菌剂的应用培养技术。

本发明的技术方案如下：一株耐盐红螺菌剂的应用培养技术，其特征在于：涉及的微生物为耐盐红螺菌( )，保藏单位简称为CCTCC，菌种编号为CCTCCNo.M，

其应用型培养技术为：

1)分离选育获得耐盐红螺菌，该菌株可在0.1～4％盐浓度下生长；

2)耐盐红螺菌的应用培养基组分为：在每升水中含有醋酸钠3.0～3.5g，氯化铵或硫酸铵0.3～0.4g，酵母膏0.1g，钼酸钠与硼酸微量，pH7.4；

3)应用培养菌剂技术步骤：首先将试管菌株接种于配方为：CH₃COONa 3.0g，CH₃CH₂COONa0.3g，(NH₄)₂SO₄ 0.3g，MgSO₄·7H₂O0.2g，K₂HPO₄ 0.3g，KH₂PO₄ 0.5g，CaCl₂ 50mg，酵母膏0.1g，谷氨酸0.2mg，蛋白胨10mg，MnSO₄ 2.5mg，NaCl 1.0g FeSO₄ 5mg，H₂O 1L，pH7.4的光合细菌经典培养基中进行一级、二级种子扩大培养，后接种于应用培养基配方中进行三级种子扩大培养，最后进行菌剂生产应用培养；其中，前三级培养条件为置于白炽灯光照下培养5～7d，温度28～33℃，光照强度1000～1500LX；应用生产菌剂以养殖水源为基质，添加应用型配方，不灭菌，分装白色容器中，接种20～30％应用培养基扩培的三级种子，置于温度为25～35℃的白色塑料温棚下日光光照培养3～5d，获得每毫升亿个细胞的菌剂；后取70～80％菌剂量用于水产养殖，余20～30％量作为母种继续进行应用培养，即第一批接种扩培的种子，从第二批开始采用接种应用菌剂。

本发明的耐盐红螺菌剂养殖试验显示，添加光合细菌的养殖水体：溶氧提高，水质较好，鱼虾生长健壮，病害减少。经检测发现水体有害微生物如假单胞菌、气单胞菌等病原菌数量减少。通过养殖应用，表明应用培养技术能够实现质量要求，鱼苗的成活率以及鱼苗的个体增重率都提高了10％以上，耐盐红螺菌剂在淡水海水养殖中均能发挥良好的应用效果。

具体实施方式：

1、耐盐红螺菌：

1)耐盐红螺菌的菌株特性：该菌株是从海水、海泥中分离的光合细菌。耐盐红螺菌—荚膜红假单胞菌(Rps.capsulata)PSB-2已于2004年月日在中国典型培养物保藏中心保藏，其简称为CCTCC，保藏号为CCTCC No.M？：.耐盐红螺菌的形态、生理生化等特征参考(布坎南R E，吉本斯N E.伯杰细菌鉴定手册第八版[M].北京：科学出版社，1984：16-29.)。该菌为革兰氏阴性细菌，极生鞭毛，具有运动性；在光照或黑暗，厌氧、微好氧和好氧条件下均能生长。细胞形态呈短杆或卵形，大多单个；细胞大小为2.0～2.2μm×0.6～1.2μm。细胞厌氧液体培养物呈现红色、黄棕色等；可利用乙酸钠、丙酸钠、丙酮酸、苹果酸、琥珀酸、酵母膏、单糖、天氡氨酸与谷氨酸等，不能利用苯甲酸钠、硫代硫酸钠和苯甲酸等；氢化酶、接触酶阳性，不能液化明胶。最适生长温度30℃，最适生长pH7.5～8.0，但在pH6.5～9均生长良好。

2)耐盐红螺菌的选育：包括分离单菌落与菌种选育。其过程为：从海水海泥中富集红螺菌—→平板分离单菌落—→耐盐性能检测—→净化水质等功能检测—→耐盐红螺菌优化菌株。富集培养基：每升水中含氯化铵1g，磷酸氢二钠0.5g，硫酸镁或氯化镁0.2g，氯化钠2g，酵母膏或蛋白胨1～2g。溶解各组分后，121℃蒸汽灭菌20min，后加入过滤除菌的10％碳酸氢钠溶液50ml，乙醇或4％丙氨酸1.5～2.0ml，用0.1N磷酸调pH至7.0；富集培养液置于白炽灯光照下培养15～20天(温度25～30℃，光照强度1500～2000LX)，当培养物深红色后取培养液转入第二次富集培养，如此反复2～3次。后取红色培养液稀释，涂布固体培养基上，于厌氧光照下培养7～10天，挑起红色单菌落斜面培养。菌种选育以光合细菌培养基(CH₃COONa 3.0g，CH₃CH₂COONa 0.3g，(NH₄)₂SO₄ 0.3g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，K₂HPO₄ 0.3g，KH₂PO₄ 0.5g，CaCl₂ 50mg，酵母膏0.1g，谷氨酸0.2mg，蛋白胨10mg，MnSO₄ 2.5mg，NaCl 1.0gFeSO₄ 5mg，H₂O 1L，pH7.4)为基础，并改变配方中盐含量使配制成0.1～4％盐浓度的培养基，灭菌后接种光合细菌，在有氧条件下光照培养7天，测定各菌种在不同盐浓度下的生长力；净化水质以池塘水与模拟海水为基质，分别设置0.1～4％盐浓度，并在培养液中添加氯化铵、亚硝酸钠物质，灭菌接种后进行有氧光照培养1天，测定各菌种在不同盐浓度下对氨氮、亚硝基氮的降解能力。最后选育出能在0.1～4％盐浓度下良好生长、净化水质能力较强的耐盐红螺菌株。

2、应用型耐盐红螺菌的菌剂培养技术：

包括应用型培养基优化和降低能耗和设备投入简单的培养技术。应用培养基：通过筛选优化获得耐盐红螺菌应用型配方。应用型配方在每升水中含有醋酸钠3.0～3.5g，氯化铵或硫酸铵0.3～0.4g，酵母膏0.1g，钼盐、硼酸盐等微量，pH7.4。应用型配方可大大降低培养基成本，培养成本较经典配方下降40～47％(例培养1吨光合细菌菌剂，经典培养基配方成本120.12元，应用型配方56.32元)，并具有配制方便等特点。

培养技术流程为耐盐红螺菌种斜面→小三角瓶一级种子培养→大三角瓶二级种子培养→应用培养基三级种子培养→应用生产菌剂培养。应用培养菌剂技术：试管菌株先以经典培养基(CH₃COONa 3.0g，CH₃CH₂COONa 0.3g，(NH₄)₂SO₄ 0.3g，MgSO₄·7H₂O 0.2g，K₂HPO₄ 0.3g，KH₂PO₄ 0.5g，CaCl₂ 50mg，酵母膏0.1g，谷氨酸0.2mg，蛋白胨10mg，MnSO₄ 2.5mg，NaCl 1.0g FeSO₄ 5mg，H₂O 1L，pH7.4)进行一级、二级种子扩大培养，后接种于应用培养基配方中进行三级种子扩大培养，最后进行菌剂生产应用培养。其中，前三级培养条件为置于白炽灯光照下培养5～7d，温度28～33℃，光照强度1000～1500LX；应用生产菌剂以养殖水源(自来水除氯)过滤后添加应用型配方，分装白色容器中，接种20～30％应用培养的种子，置于白色塑料温棚中光照培养，培养温度25～35℃，时间2～7天(气温高培养2～3天，气温低培养时间延长)，耐盐红螺菌应用培养菌剂达到使用浓度后，取70～80％菌剂量用于水产养殖，余20～30％量作为母种继续进行应用培养，即第一批接种扩培种子，从第二批开始采用接种应用菌剂。

应用培养耐盐红螺菌剂，细胞浓度受菌种母液质量、气温、光照及接种的影响。如气温太高时需打开温棚门，气温较低时需关闭温棚门，使培养温度控制在25～35℃，在冬天气温太低温度达不到时，可采用适当措施(如夜晚灯源光照)来提高培养温度。应用培养菌剂颜色为均匀红色，表面无白膜，并具有一定香气。如培养过程出现颜色较淡或表面长白膜、有臭气，说明菌剂质量差或染菌。应用培养采用培养基不灭菌，除加大接种量外，还应对使用容器进行清洗消毒后使用。

耐盐红螺菌菌剂在上述应用培养条件下，每毫升可达到亿个细胞的使用浓度要求。

3、耐盐红螺菌剂应用培养及在淡水海水养殖中的应用：

2001年10月至12月(第一批)，2002年4月至6月(第二批)在福建漳州(诏安)进行菌剂应用培养与养殖试验。菌剂培养：利用诏安养殖海水(38‰盐度)添加应用型配方，以20L或50L白色塑料桶为容器，接种光合细菌培养母液，置于搭建的白色塑料棚中日光培养3-4d，光合细菌菌剂呈现紫红色，OD值达到1.0左右(每毫升亿个细胞浓度，下同)。菌剂用于养殖：将耐盐红螺菌培养液应用于10口南美白对虾池养殖(养殖池面积400m²)，养殖过程实验池每隔5-7d添加光合细菌培养菌剂10-100ppm，对照组不添加光合细菌。养殖结果为第一批虾苗(投苗约0.8cm)养殖2个月，增重率较对照池提高80％以上，第二批虾苗(约3cm)养殖2个月，增重率较对照池提高23％以上。

淡水养殖应用在福州市淡水育苗基地进行。2001年3月至4月(第一批)，2002年6月至7月(第二批)以闽江水源配料光合细菌应用型配方，分装白色塑料桶，接种后置于白色塑料温棚中日光培养3-4d，光合细菌培养菌液呈现紫红色，OD值达到1.0左右。第一批养殖用4口(5-10m²)水泥池进行斑点叉尾鮰、彭泽鲫鱼苗的养殖试验，两种鱼苗的实验池约每隔5d添加100ppm光合细菌培养液，养殖一个月，两种鱼苗的个体增重率较对照池提高12-17％；2002年6月在2口(1亩面积)养殖鱼池中分别投放18000尾斑点叉尾鮰(约0.5cm)，实验池约隔5d添加10ppm光合细菌菌剂，养殖一个月，斑点叉尾鮰苗成活率较对照池提高10％。

耐盐红螺菌剂养殖试验还显示，添加光合细菌的养殖水体：溶氧提高，水质较好，鱼虾生长健壮，病害减少。经检测发现水体有害微生物如假单胞菌、气单胞菌等病原菌数量减少。通过养殖应用，表明应用培养技术能够实现质量要求，耐盐红螺菌剂在淡水海水养殖中均能发挥良好的应用效果。

实施例：以下通过具体实例对本发明作进一步的详细描述。

(1)分离红螺菌 100ml量筒为容器。将海水、海泥培养于表层添加液体石蜡的光合细菌富集培养液中，于30℃，1500LX灯光光照下培养10天，吸取20～30ml红色培养液再转入100ml量筒富集培养液中继续培养。如此2至3次，后吸取红色培养液1ml，按10倍稀释法依次稀释，取10^-3、10^-4、10^-5、10^-6稀释管0.1ml涂布在光合细菌全成分平板上，置于厌氧罐中厌氧光照培养8天，在平板上挑取到36株单菌落斜面培养。

(2)耐盐红螺菌选育：配制0.1％、1％、2％、3％、4％NaCl浓度的光合细菌培养基，灭菌，将36株单菌落分别接种于试管培养液中(接种量5％)，在好氧下以灯光光源光照培养7天(光照强度1500LX，培养温度30℃)，用721分光光度计测定菌体生长量(OD_660nm)，从实验中选育出5株能在有氧条件下，在0.1～4％NaCl浓度下生长良好的菌株。后配制不同盐浓度和含有18mg/L、6mg/L氨氮与亚硝基氮的养殖水体培养基，灭菌，接种5％光合细菌，同上述光照培养1天，测定菌种在不同盐浓度下对水体氨氮、亚硝基氮的下降率。通过比较，筛选出2株能在不同盐浓度下净化养殖水质良好的耐盐红螺菌。在功能菌株选育中，考虑到养殖水体具有较高溶解氧浓度，为此，菌种选育均在好氧条件下实验，这样选育淘汰了只能在厌氧下生长，或好氧下生长差的菌株，使菌株具有耐盐性、生长快、净化水质功能较好与适应于养殖水体的溶氧环境。

(3)应用型培养基配方优化

以光合细菌经典配方为基础，一一设计各碳源、氮源、无机盐、生长素的添加或缺少对菌体生长的影响。试验按设计的配方配制培养基，121℃灭菌20min，后接种10％活化的耐盐红螺菌种，于30℃、1500LX光照强度下光照培养5天，以分光光度计法测定各配方的菌体生长量。在各成分添加与不添加的培养对比试验中，筛选影响菌种生长权重大的成分，淘汰对菌种生长影响小的成分。优化培养基经反复与经典培养基培养比较，确定其培养效果后作为应用培养基配方。试验结果优化的应用型配方为每升水中含有醋酸钠3.0～3.5g，氯化铵或硫酸铵0.3～0.4g，酵母膏0.1g，钼盐、硼酸盐等微量，pH7.4。在这些成分中，醋酸钠、硫酸铵(或氯化铵)、酵母膏是经典配方中影响菌体生长权重很大的成分。而无机盐中硼与钼盐较经典配方中的无机盐对菌体生长的影响要大，添加少量硼、钼对菌体保持活力，减缓衰亡期与提高其生长量具有良好的作用。因此，应用型配方中的无机盐为硼酸与钼酸钠。应用型配方培养成分5～6种，培养基成分成本下降47％，但其培养效果在同样条件下与采用经典培养基配方相近(表1)，

表1 光合细菌经典培养基与应用培养基培养效果比较(OD_660NM)

培养时间(天)	经典培养基	应用型培养
	经典培养基	应用型培养	OD	OD
	7	1.03	OD	OD	0.94

(4)应用型培养技术

应用生产菌剂采用应用型培养基，配制后不灭菌并加大接种量，在日光光照下培养与操作。具体过程为以养殖水体(自来水除氯、江水、海水过滤沉淀)为基质，添加应用型配方，于25L白色塑料桶分装20L培养液，接种5L扩培的耐盐红螺菌种子液，置于白色塑料温棚内(28℃)日光光照培养4～5天(每天搅拌一次)，待菌体呈现均匀红色(菌浓度达到10⁹个/m1)后，取20L菌剂应用于养殖，余5L菌剂作为母种添加应用型培养液，继续日光光照培养生产用于淡水海水养殖的耐盐红螺菌剂。

白色塑料温棚日光培养光合细菌，应使用白色容器(如白色玻璃、塑料桶，有机玻璃、塑料袋等)。培养过程每天搅拌1次，使菌种能更好吸收营养与快速生长。

Claims

1、一株耐盐红螺菌剂的应用培养技术，其特征在于：涉及的微生物为耐盐红螺菌( )，保藏单位简称为CCTCC，菌种编号为CCTCCNo.M ，其应用型培养技术为：

3)应用培养菌剂技术步骤：首先将试管菌株接种于配方为：CH₃COONa 3.0g，CH₃CH₂COONa0.3g，(NH₄)₂SO₄0.3g，MgSO₄.7H₂O0.2g，K₂HPO₄0.3g，KH₂PO₄0.5g，CaCl₂50mg，酵母膏0.1g，谷氨酸0.2mg，蛋白胨10mg，MnSO₄ 2.5mg，NaCl 1.0g FeSO₄ 5mg，H₂O 1L，pH7.4的光合细菌经典培养基中进行一级、二级种子扩大培养，后接种于应用培养基配方中进行三级种子扩大培养，最后进行菌剂生产应用培养；其中，前三级培养条件为置于白炽灯光照下培养5～7d，温度28～33℃，光照强度1000～1500LX；应用生产菌剂以养殖水源为基质，添加应用型配方，不灭菌，分装白色容器中，接种20～30％应用培养基扩培的三级种子，置于温度为25～35℃的白色塑料温棚下日光光照培养3～5d，获得每毫升亿个细胞的菌剂；后取70～80％菌剂量用于水产养殖，余20～30％量作为母种继续进行应用培养，即第一批接种扩培的种子，从第二批开始采用接种应用菌剂。