CN107541477A - 一种利用乳酸菌发酵液培养光合细菌的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用乳酸菌发酵液培养光合细菌的方法，该方法不仅能够快速去除了乳酸菌废液中的总有机碳(TOC)和总氮(TN)，而且成功培养出了可以作为微生态制剂和微生物菌肥的细胞浓度高达40×108/mL以上的光合细菌，是乳酸菌发酵液高效资源化利用的一条有效途径。通过一系列不同的研究实验，证明这一技术性能稳定，能够应用于产业化。
Description
技术领域
本发明属于乳酸菌发酵废液资源化利用技术领域，涉及一种利用乳酸菌发酵液培养光合细菌的方法。
背景技术
乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)是指能够发酵糖类产生乳酸的一大类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称。乳酸菌至少可分为18个属，共有200多种，绝大部分都是人体内必不可少的且具有重要生理功能的菌群，人肠道乳酸菌与健康长寿有着非常密切的关系。乳酸菌在自然界分布广泛，具有丰富的物种多样性，不仅在分类、生化、遗传、分子生物学和基因工程研究方面具有重要的学术价值，而且在工业、农牧业、食品和医药等领域有广泛的应用价值，因此乳酸菌液体发酵培养规模和水平都在不断提高。
对于乳酸菌液体发酵，一般采用MRS或在其基础上改进的培养基，主要碳源成分有葡萄糖和蔗糖等，主要氮源成分有蛋白胨、牛肉粉和酵母粉等，培养温度37℃左右，培养时间1天左右。乳酸菌培养结束后一般采用离心等手段收获菌细胞，加入保护剂后进行冷冻干燥，制得的菌粉用于食品发酵或医药保健。对于离心收获乳酸菌细胞后的乳酸菌发酵上清液仍含有糖和蛋白等剩余成分及乳酸菌代谢产物有机酸如乳酸等，如果直接排放不仅会污染环境，而且导致糖、蛋白和有机酸等有用成分的浪费。随着人们生活水平的提高和对乳酸菌食品、保健食品和医药需求的增大，需要排放的乳酸菌发酵液量也在不断上升，由此造成的环境污染问题越来越突出。由于乳酸菌发酵液固形物含量低，因此难以采用喷雾干燥等传统干燥方式实现资源化回收利用。如果采用传统废水生物处理技术，虽然可以降解乳酸菌发酵废液中的有机物，但又造成了糖、蛋白和有机酸的浪费，因此如何高效资源化利用乳酸菌发酵液是解决这一问题的关键。尽管利用微生物发酵氨基酸废水生产饲料添加剂和有机复合肥方面有一些文献报道和技术，但在如何高效资源化利用乳酸菌发酵液方面尚未见有文献报道。
发明内容
本发明所要解决的关键问题是针对乳酸菌发酵液高效资源化利用技术的空白，提供利用乳酸菌发酵液培养光合细菌的方法，该方法不仅快速去除了乳酸菌废液中的总有机碳(TOC)和总氮(TN)，而且成功培养出了可以作为微生态制剂和微生物菌肥的光合细菌。通过一系列不同的研究实验，证明这一技术性能稳定，能够应用于产业化。
为此，本发明提供了一种利用乳酸菌发酵液培养光合细菌的方法，其以乳酸菌发酵液为培养基对光合细菌进行光照厌氧发酵培养。
本发明中，所述乳酸菌发酵液是乳酸菌类液体发酵培养物经离心收获细胞后的发酵上清液，所述乳酸菌包括乳酸球菌、乳酸杆菌和双歧杆菌中的一种或几种。
根据本发明的一些实施方式，本发明中利用乳酸菌发酵液培养光合细菌的方法包括将光合细菌菌种接种至乳酸菌发酵液培养基中进行光照厌氧发酵培养的步骤，其中，所述光合细菌菌种由相应的菌株经过种子培养获得。
在本发明的一些实施例中，所述乳酸菌发酵液培养基由乳酸菌发酵液经过灭菌或除菌后获得。
本发明中，所述光合细菌菌种的相应的菌株为保藏编号为CGMCC NO.1.2180的沼泽红假单胞菌菌株[Rhodopseudomonas palustris(Molisch)van Niel]或其他任何一种或几种光合细菌菌株。
在本发明的一些实施例中，所述乳酸菌发酵液培养基在接种前或接种后将pH值调至6.5-8.0；优选7.0-7.5。
根据本发明的一些实施方式，所述光合细菌菌种以种子液的形式接种到乳酸菌发酵液培养基，并且基于乳酸菌发酵液培养基总体积计，所述种子液的接种量为10％-30％(v/v)，优选为20％(v/v)。
在本发明的一些实施例中，所述种子液中的光合细菌细胞浓度为(30-50)×108/mL。
在本发明的一些实施例中，所述光照厌氧发酵培养的温度为30-45℃，优选为35-40℃。
在本发明的一些实施例中，所述光照厌氧发酵培养的光照强度为2000-8000Lx。
本发明对于光照的光源没有特别的限制，例如，用于光照的光源可以为二极管照明灯和/或白炽灯和/或太阳光。
本发明还提供了一种微生物菌肥，其由本发明中利用乳酸菌发酵液培养光合细菌的方法制得。
本发明还提供了一种微生态制剂，其由本发明中利用乳酸菌发酵液培养光合细菌的方法制得。
本发明方法以乳酸菌发酵液作为培养基培养光合细菌(即沼泽红假单胞菌)，经过光照厌氧发酵培养5天，可以获得40×108/mL以上细胞浓度的沼泽红假单胞菌，同时可以快速去除乳酸菌发酵液中70％以上的总有机碳(TOC)和60％以上的总氮(TN)，是一种将乳酸菌发酵液高效资源化利用的有效方式。通过一系列不同的研究实验，证明这一技术性能稳定，能够应用于产业化。
附图说明
图1显示了本发明的利用嗜酸乳杆菌发酵液培养沼泽红假单胞菌的结果。
图2显示了利用副干酪乳杆菌发酵液培养沼泽红假单胞菌的结果。
图3显示了利用鼠李糖乳杆菌发酵液培养沼泽红假单胞菌的结果。
具体实施方式
为使本发明更加容易理解，下面将结合附图和实施例来详细说明本发明，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。
如前所述，尽管利用微生物发酵氨基酸废水生产饲料添加剂和有机复合肥方面有一些文献报道和技术，但在如何高效资源化利用乳酸菌发酵液方面尚未见有文献报道。为填补此空白，本发明人进行了大量的研究。
光合细菌(Photosynthetic Bacteria)，是一大类能在厌氧光照条件下进行不产氧光合作用的原核生物的总称，属于革兰阴性菌，分为红螺菌科(Rhodospirillaceae)、着色菌科(Chromatiaceae)、绿菌科(Chlorobiaceae)和绿色丝状菌科(Chloroflexaceae)4个科，菌细胞主要分为杆状和球形2种不同形态，是地球生命起源的先锋物种之一，其中红假单胞菌(Rhodopseudomonas)和紫色无硫菌(Rhodospirillaceae)是产业化生产较多的光合细菌种类。光合细菌是代谢途径最广泛的一类微生物，目前一般的培养方式是光照厌氧异养培养，供其生长的主要碳源有糖和有机酸，氮源有蛋白和铵等，而这些营养成分在乳酸菌发酵液中都有大量存在，基于此发明人进一步探索了利用乳酸菌发酵液培养光合细菌的技术与方法。
本发明采用了嗜酸乳杆菌、副干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌3种人用乳酸菌发酵废水，测定其主要理化指标，结果见表1。从表1可以看出，3种乳酸菌废水都含有大量的TOC和TN，TOC范围从17到21.5g/L，而TN范围从2.3到3.0g/L，同时由于这3种乳酸菌均产乳酸等有机酸，因此pH均较低从3.8到4.3。如此高含TOC和TN的废水如果直接排放必然会造成水体污染并导致水体富营养化，引发蓝藻水华的暴发。同时因为乳酸菌发酵废水中富含残糖、蛋白和有机酸，如果直接排放，也会造成资源的浪费。
表1乳酸菌发酵废水的主要理化指标
| 乳酸菌发酵废水 | TOC(g/L) | TN(g/L) | pH |
| 嗜酸乳杆菌 | 21.5 | 3.0 | 4.0 |
| 副干酪乳杆菌 | 19.9 | 2.3 | 4.3 |
| 鼠李糖乳杆菌 | 17.0 | 2.6 | 3.8 |
本发明采用的光合细菌菌种为从中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)购买的沼泽红假单胞菌菌株[Rhodopseudomonas palustris(Molisch)van Niel]，保藏编号为CGMCC NO.1.2180(ATCC33872)。
本发明中以乳酸菌发酵液为培养基对光合细菌进行光照厌氧发酵培养的方法按照以下方式进行：
一、进行沼泽红假单胞菌种子培养。
本发明中，用于沼泽红假单胞菌种子培养的培养基以1L水计的组成如下：
在本发明的一些实施例中，利用上述培养基培养沼泽红假单胞菌菌种的培养步骤如下：
(1)按照上述培养基组成配制培养基，用500mL三角瓶装入配制好的液体培养基400mL，经封口膜密闭封口后在高温(121℃)高压(0.15MPa)下灭菌20min，然后在洁净工作台内紫外线照射灭菌20min后使用。
(2)在洁净工作台内，将沼泽红假单胞菌[Rhodopseudomonas palustris(Molisch)van Niel，保藏编号为CGMCC NO.1.2180]冻干粉约0.5克直接接种于500mL三角瓶内的400mL液体培养基中，封闭三角瓶口以保证厌氧状态，经充分震荡混合均匀后在温度35℃40W白炽灯光照下进行光照厌氧发酵培养。经5天培养后沼泽红假单胞菌细胞浓度达到(30-50)×108/mL，即可以作为沼泽红假单胞菌种子接种于乳酸菌发酵液中进行培养。同时通过20％(v/v)的比例将沼泽红假单胞菌种接种于上述新鲜的培养基中，培养5天左右可以重复制备出用于处理乳酸菌发酵液的沼泽红假单胞菌菌种。
二、以乳酸菌发酵液为培养基对光合细菌进行厌氧发酵培养。
在本发明的一些实施例中，按照20％(v/v)的比例将光合细菌菌种接种于经过灭菌或除菌后制成乳酸菌发酵液培养基中，通过添加碱溶液调节初始pH为7.0后，同样进行光照厌氧发酵培养。
根据本发明方法，所述发酵培养为静置培养，发酵菌种以种子液的形式接种到发酵培养基中，所述种子液的接种量为10％-30％(v/v)；优选种子液的接种量为20％(v/v)。
在本发明的一些实施例中，所述种子液中的沼泽红假单胞菌细胞浓度为(30-50)×108/mL。
根据本发明，所述发酵培养为光照厌氧异养发酵培养，这意味着如果采用有氧发酵就无法很好的实现沼泽红假单胞菌的生长。
应该了解的是，作为一种典型的光合细菌，沼泽红假单胞菌可以利用多种碳源如糖及有机酸和多种氮源如蛋白及铵等进行生长，因此乳酸菌发酵废水中的糖、有机酸、蛋白和铵等都可以作为沼泽红假单胞菌生长的碳氮源。对于沼泽红假单胞菌来说，一般其最适生长pH为7.0左右，而乳酸菌发酵液的pH都比较低，因此需要添加碱性化合物提高培养物的初始pH达到7.0左右。
在本发明的一些实施例中，所述调节乳酸菌发酵液pH的碱性化合物包括氢氧化钠、氢氧化钾、氨水、碳酸钠和磷酸氢二钾中的一种或几种。
在本发明的另一些实施例中，所述接种沼泽红假单胞菌后的乳酸菌发酵液培养基初始pH值为6.5-8.0；优选为7.0-7.5。
本发明人还对光照强度和发酵温度进行了考察，发现所述光照厌氧发酵培养的温度为30-45℃，优选为35-40℃。用于光照的光源可以为二极管照明灯和/或白炽灯和/或太阳光，所述光照厌氧发酵培养的光照强度为2000-8000Lx。
根据本发明方法以乳酸菌发酵液为培养基对光合细菌进行光照厌氧发酵培养，所获得的培养物中光合细菌细胞蛋白质含量高达60％左右，因为光合细菌可以固氮同时富含可以作为细胞代谢激活剂和天然抗氧化剂的辅酶Q10(泛醌)和番茄红素等，具有重要的营养和药用价值，可以用作微生态制剂或微生物菌肥。这可以理解为，本发明提供了一种利用光合细菌处理收获乳酸菌细胞后的发酵废水，培养光合细菌作为微生物菌肥或微生态制剂的方法。目前，光合细菌在作为微生物菌肥、微生态制剂、处理高浓度有机废水和水产养殖净化水质等方面都发挥了越来越重要的作用。因此，发明人认为利用乳酸菌发酵液培养光合细菌是高效资源化利用乳酸菌发酵液的一条有效途径。
发明用于培养基或发酵培养过程中的“水”，在没有特别指定的情况下，是指经0.22μ滤膜过滤获得的水。
本发明中TOC、TN、细胞浓度和pH采用以下方法测定：
1.TOC和TN的测定，采用附带可以测定TN的TOC仪(岛津TOC-VCPH+TNM1)，采用0.22μ滤膜过滤乳酸菌发酵液或利用乳酸菌发酵液培养沼泽红假单胞菌的培养物，经超纯水稀释一定倍数后直接注射进TOC仪中测定其中的TOC和TN浓度。
2.沼泽红假单胞菌细胞浓度的测定，取沼泽红假单胞菌培养物，经生理食盐水稀释一定倍数后，直接采用流式细胞仪(德国SYSMEX)测定其中的细胞浓度。
3.pH测定，采用pH计(S210SevenCompactTMpH计)将pH探头直接插入到乳酸菌发酵液中测定pH。
实施例
实施例1：利用嗜酸乳杆菌发酵液培养沼泽红假单胞菌。
1.沼泽红假单胞菌种子液的制备
(1)配制液体培养基：用于种子培养的液体培养基以1L水计的组成如下：
(2)接种及种子培养：按照20％(v/v)比例接种沼泽红假单胞菌培养物80毫升于400毫升灭菌后的培养基中，采用封口膜密闭后在温度35-40℃、光照2000-8000Lx条件下培养，5d后细胞浓度达到(30-50)×108/mL后作为利用乳酸菌发酵液培养沼泽红假单胞菌的种子。
2.配制利用嗜酸乳杆菌发酵液的培养基
取嗜酸乳杆菌发酵液400毫升于500毫升三角瓶中，在高温(121℃)高压(0.15MPa)下灭菌20min，接种80毫升沼泽红假单胞菌种子液，通过添加200g/L的氢氧化钠溶液调节初始pH为7.0，采用封口膜封闭瓶口后在温度35-40℃、光照强度2000-8000Lx条件下进行光照厌氧培养，图1显示了沼泽红假单胞菌细胞浓度增加及TOC和TN减少的结果。培养5天沼泽红假单胞菌细胞浓度从6×108/mL增加到48×108/mL，而TOC从18.5g/L减少到5g/L，同时TN从2.8g/L减少到0.9g/L，去除率分别为72.8％和67.9％，说明沼泽红假单胞菌可以利用嗜酸乳杆菌发酵液中的TOC和TN进行快速生长。
实施例2：利用副干酪乳杆菌发酵液培养沼泽红假单胞菌。
实施例2中沼泽红假单胞菌种子液的制备与实施例1相同。
实施例2中除副干酪乳杆菌发酵液采用直接添加碳酸钠调整初始pH值至7.2外，其他控制条件与实施例1相同。图2显示了沼泽红假单胞菌细胞增加及TOC和TN减少的结果。培养5天沼泽红假单胞菌细胞浓度从6×108/mL增加到45×108/mL，而TOC从16.8g/L减少到4.1g/L，同时TN从2.1g/L减少到0.6g/L，去除率分别为75.6％和71.4％，说明沼泽红假单胞菌可以同样利用副干酪乳杆菌发酵液中的TOC和TN进行快速生长。
实施例3：利用鼠李糖乳杆菌发酵液培养沼泽红假单胞菌。
实施例3中沼泽红假单胞菌种子液的制备与实施例1相同。
实施例3中除鼠李糖乳杆菌发酵液采用添加200g/L氢氧化钾溶液调整初始pH值至7.5外，其他控制条件与实施例1相同。图3显示了沼泽红假单胞菌细胞增加及TOC和TN减少的结果。培养5天沼泽红假单胞菌细胞浓度从6×108/mL增加到42×108/mL，而TOC从14.5g/L减少到3.5g/L，同时TN从2.5g/L减少到0.9g/L，去除率分别为75.9％和64.0％，说明沼泽红假单胞菌也可以同样利用鼠李糖乳杆菌发酵液中的TOC和TN进行快速生长。
综上所述，利用3种乳酸菌发酵液可以培养出细胞浓度达40×108/mL以上的沼泽红假单胞菌，同时可以去除乳酸菌发酵液中70％以上的TOC和60％以上的TN。
以上所述仅为本发明的利用乳酸菌发酵液培养沼泽红假单胞菌的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种利用乳酸菌发酵液培养光合细菌的方法，其以乳酸菌发酵液为培养基对光合细菌进行光照厌氧发酵培养。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述乳酸菌发酵液是乳酸菌类液体发酵培养物经离心收获细胞后的发酵上清液，所述乳酸菌包括乳酸球菌、乳酸杆菌和双歧杆菌中的一种或几种。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其包括将光合细菌菌种接种至乳酸菌发酵液培养基中进行光照厌氧发酵培养的步骤，其中，所述光合细菌菌种由相应的菌株经过种子培养获得。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述乳酸菌发酵液培养基由乳酸菌发酵液经过灭菌或除菌后获得。
5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述光合细菌菌种的相应的菌株为保藏编号为CGMCC NO.1.2180的沼泽红假单胞菌菌株或其他任何一种或几种光合细菌菌株。
6.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述乳酸菌发酵液培养基在接种前或接种后将pH值调至6.5-8.0；优选7.0-7.5。
7.根据权利要求3-6中任意一项所述的方法，其特征在于，所述光合细菌菌种以种子液的形式接种到乳酸菌发酵液培养基，并且基于乳酸菌发酵液培养基总体积计，所述种子液的接种量为10％-30％(v/v)；优选种子液的接种量为20％(v/v)；和/或所述种子液中的光合细菌细胞浓度为30-50×108/mL。
8.根据权利要求3-6中任意一项所述的方法，其特征在于，所述光照厌氧发酵培养的温度为30-45℃，优选为35-40℃；和/或，所述光照厌氧发酵培养的光照强度为2000-8000Lx；和/或用于光照的光源为二极管照明灯和/或白炽灯和/或太阳光。
9.一种微生物菌肥，其由权利要求1-8中任意一项所述的方法制得。
10.一种微生态制剂，其由权利要求1-8中任意一项所述的方法制得。
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