CN111793593A - 一种促进光合细菌生长的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种促进光合细菌生长的方法，该方法通过添加天冬氨酸实现光合细菌的高浓度培养。本发明通过在基本培养基中添加2.0g/L天冬氨酸培养5天，使沼泽红假单胞菌细胞浓度高达74×10⁸/mL，比对照37×10⁸/mL提高了1倍，是高效产业化培养沼泽红假单胞菌的一条有效途径。通过不同浓度的实验研究，证明这一技术性能稳定，能够应用于产业化。

Description

一种促进光合细菌生长的方法

技术领域

本发明属于微生物发酵技术领域，涉及一种促进光合细菌生长的方法，具体涉及一种利用天冬氨酸促进光合细菌生长的方法。

背景技术

光合细菌(Photosynthetic Bacteria，简称PSB)是地球上最早出现的具有原始光能合成系统、在厌氧条件下进行不放氧光合作用细菌的总称，在自然界的碳、氮、硫循环中起着重要的作用。光合细菌属于细菌门、真细菌纲、红螺菌目，分为红螺菌科、着色菌科、绿硫菌科，现已知的光合细菌包括19个属，约49个种。PSB广泛存在于江河、湖泊等能透光而又无氧的环境中，代谢途径多样，在废水处理、农业种植、水产养殖、医药健康方面都有重要应用价值，因此培养获得超高细胞浓度光合细菌不仅具有基础研究价值，而且具有重要的应用价值。

PSB可以利用糖、甘油和有机酸作为碳源，氨氮、亚硝酸、硝酸和尿素作为氮源，太阳光作为能源，有机物或硫化氢作为供氢体进行生长。沼泽红假单胞菌属于典型的光合细菌，生长条件广泛，在厌氧光照、好氧光照和好氧黑暗条件下都能快速增长，通常以光照厌氧培养为主，以有机酸作为碳源，铵、尿素作为氮源，生长条件为中性或弱碱性。PSB生长受碳源、氮源、温度、光照强度、pH、光源类型、溶氧量、接种量等诸多因素的影响，现有的关于光合细菌的高浓度培养主要从培养基中碳氮源选择及培养条件方面进行优化，但在某种氨基酸对光合细菌生长效应方面却鲜有文献报道。

作为多种氨基酸、嘌呤、嘧啶碱基合成前体，天冬氨酸是组成生物体蛋白质的20种氨基酸之一，是一种良好的营养增补剂，可改善心肌功能，在生命活动中发挥重要作用。另外，天冬氨酸是合成食品添加剂阿斯巴甜、必需氨基酸丙氨酸、以及聚天冬氨酸的主要原料、广泛应用于食品、化工、医药、农业、污水处理等领域。对大多数微生物来说，氨基酸可透过细胞膜被吸收，直接参与目标蛋白的合成及代谢。不同氨基酸对微生物的生长和活性物质的积累有不同的效应，但在天冬氨酸促进微生物生长方面的研究却鲜有报道，甚至有用天冬氨酸与牛乳复合培养保加利亚乳杆菌导致活菌数低的文献，而在天冬氨酸促进光合细菌生长方面却未见报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对光合细菌的培养技术，提供一种促进光合细菌生长的方法。该方法通过添加天冬氨酸促进光合细菌的生长，在短期内可培养获得高细胞浓度的光合细菌。通过一系列不同的研究实验，证明了这一技术性能稳定，能够应用于产业化。

为此，本发明提供了一种促进光合细菌生长的方法，其包括在培养基中添加天冬氨酸来对光合细菌进行光照厌氧发酵培养获得光合细菌发酵培养物。

本发明中，所述培养基包括种子培养基和/或发酵培养基；优选地，所述天冬氨酸的添加浓度为0.5-5.0g/L。

根据本发明的一些实施方式，所述促进光合细菌生长的方法包括将发酵菌种接种至含有天冬氨酸的发酵培养基中进行光照厌氧发酵培养，获得发酵培养物；其中，所述发酵菌种由所述光合细菌相应的菌株经过种子培养获得，所述光合细菌相应的菌株为保藏编号为CGMCC NO.1.2180的沼泽红假单胞菌菌株[Rhodopseudomonas palustris(Molisch)vanNiel]或其他任何一种或几种光合细菌菌株。

在本发明的一些实施例中，在所述发酵培养基中，所述天冬氨酸的含量为0.5-5.0g/L。

在本发明的一些优选的实施例中，所述发酵培养基在接种前或接种后将pH值调至6.5-8.0，优选7.0-7.5。

根据本发明的一些实施方式，所述种子培养包括将光合细菌相应的菌株的单克隆菌落接种到含有天冬氨酸的种子培养基中进行光照厌氧培养，获得种子液。

在本发明的一些实施例中，在所述种子培养基中，所述天冬氨酸的含量为0.5-5.0g/L。

在本发明的一些优选的实施例中，所述种子培养基在接种前或接种后将pH值调至6.5-8.0，优选7.0-7.5。

在本发明的一些实施例中，经过5天培养后所述种子液中的沼泽红假单胞菌细胞浓度为(30-50)×10⁸/mL。

本发明中，所述发酵菌种以种子液的形式接种到含天冬氨酸的发酵培养基中，并且基于含天冬氨酸的发酵培养基的总体积计，所述种子液的接种量为10％-30％(v/v)，优选为30％(v/v)。

在本发明的一些实施例中，所述种子液中的光合细菌细胞的浓度为(30-50)×10⁸/mL。

根据本发明方法，所述光照厌氧发酵培养的温度为30-45℃，优选为35-40℃。

在本发明的一些实施例中，所述光照厌氧发酵培养的光照强度为2000-8000Lx。

本发明中，用于光照的光源为二极管照明灯和/或白炽灯和/或太阳光。

在本发明的一些实施例中，经过5天光照厌氧发酵培养后，能够获得细胞浓度达到74×10⁸/mL的沼泽红假单胞菌菌液。

本发明方法在基本培养基中添加天冬氨酸培养光合细菌，经过光照厌氧发酵培养，不同浓度的天冬氨酸对光合细菌的促生长效果不同，在2.0g/L的最优浓度下培养5天，可以获得细胞浓度为74×10⁸/mL的沼泽红假单胞菌菌液，比不添加天冬氨酸的对照组提高了1倍。通过多次实验研究，证明天冬氨酸可显著促进光合细菌的生长，并且这一性能具有稳定性，能够应用于产业化生产。

附图说明

为使本发明容易理解，下面结合附图来说明本发明。

图1显示了不同天冬氨酸浓度对沼泽红假单胞菌生长的效应。

具体实施方式

为使本发明容易理解，下面将结合实施例详细说明本发明。但在详细描述本发明前，应当理解本发明不限于描述的具体实施方式。还应当理解，本文中使用的术语仅为了描述具体实施方式，而并不表示限制性的。

除非另有定义，本文中使用的所有术语与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解具有相同的意义。虽然与本文中描述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料也可以在本发明的实施或测试中使用，但是现在描述了优选的方法和材料。

本文所述用语“约”，“大约”，“基本上”和“主要”，当与浓度，温度或其它物理或化学性质或特性的范围结合使用时，覆盖可能存在于属性或特性的范围的上限和/或下限中的变化，包括例如由舍入，测量方法或其他统计变化导致的变化。如本文所述，与量，重量等相关的数值，被定义的“约”是每个特定值的所有数值加或减1％。例如，用语“约10％”应理解为“9％至11％”。

Ⅰ.术语

发明用于培养基或发酵培养过程中的“水”，在没有特别指定的情况下，是指经0.22μm滤膜过滤获得的无菌纯水。

Ⅱ.实施方案

如前所述，光合细菌应用广泛，有很大的市场需求，关于光合细菌的高浓度培养主要从培养基中碳氮源及培养条件方面进行优化，但在某种氨基酸对光合细菌生长效应方面却鲜有文献报道，为填补此空白，本发明人进行了大量的研究。

本发明人研究发现，通过在培养基中添加天冬氨酸可以明显促进光合细菌的快速生长，采用这种方式在短期内即可培养获得高细胞浓度的光合细菌，本发明正是基于上述发现完成的。

因此，本发明所涉及的促进光合细菌生长的方法包括在培养基中添加天冬氨酸来对光合细菌进行光照厌氧发酵培养获得光合细菌发酵培养物，因此，该方法可以理解为一种利用天冬氨酸促进光合细菌生长的方法。

本领域技术人员应该了解的是，本发明中所述在培养基中添加天冬氨酸既包括在种子培养基中加入天冬氨酸，也包括在发酵培养基中加入天冬氨酸，还包括分别独立地在种子培养基和发酵培养基中添加天冬氨酸，优选分别独立地在种子培养基和发酵培养基中添加天冬氨酸。

优选地，种子培养基和发酵培养基中，所述天冬氨酸的添加浓度为0.5-5.0g/L。

本发明中以含有天冬氨酸的培养基对光合细菌进行光照厌氧发酵培养的方法按照以下方式进行：

一、本发明采用的光合细菌菌种为从中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)购买的沼泽红假单胞菌菌株[Rhodopseudomonas palustris(Molisch)van Niel]，保藏编号为CGMCC NO.1.2180(ATCC33872)。

二、进行沼泽红假单胞菌种子培养。

所述种子培养包括将光合细菌相应的菌株的单克隆菌落接种到含有天冬氨酸的种子培养基中进行光照厌氧培养，获得种子液。

1、用于沼泽红假单胞菌种子培养的种子培养基以1L水计的组成如下：

2、利用上述培养基培养沼泽红假单胞菌的培养步骤如下：

(1)按照上述培养基组成配制种子培养基并在种子培养基中添加天门冬氨酸，天冬氨酸的添加量为0.5-5.0g/L，用500mL三角瓶装入配制好的液体培养基400mL，经封口膜密闭封口后在高温(121℃)高压(0.15MPa)下灭菌20min，然后在洁净工作台内紫外线照射灭菌20min后使用。

(2)在洁净工作台内，将沼泽红假单胞菌[Rhodopseudomonas palustris(Molisch)van Niel，保藏编号为CGMCC NO.1.2180]冻干粉约0.5克直接接种于500mL三角瓶内的400mL液体培养基中，封闭三角瓶口以保证厌氧状态，经充分震荡混合均匀后在温度35℃40W白炽灯光照下进行光照厌氧发酵培养。

研究发现，天冬氨酸的添加量为2.0g/L左右时，经5天培养后沼泽红假单胞菌细胞浓度达到(30-50)×10⁸/mL，即可以作为沼泽红假单胞菌种子接种于新鲜的培养基中进行培养。同时通过30％(v/v)的比例将沼泽红假单胞菌种接种于上述新鲜的培养基中，培养5天左右可以重复制备出用于发酵培养的沼泽红假单胞菌菌种。

三、以含有不同浓度天冬氨酸的培养基对光合细菌进行厌氧发酵培养。

本发明中所述发酵培养基的组成与上述种子培养基相同，在发酵培养基中添加天门冬氨酸，天冬氨酸的添加量为0.5-5.0g/L。

将发酵菌种以种子液的形式接种至含有天冬氨酸的发酵培养基中进行光照厌氧发酵培养，获得发酵培养物；所述种子液中的沼泽红假单胞菌细胞浓度为(30-50)×10⁸/mL。

按照10％-30％(v/v)(基于含天冬氨酸的发酵培养基的总体积计)，优选30％(v/v)的比例将光合细菌菌种(种子液)接种于经过高温(121℃)高压(0.15MPa)灭菌20min含有天冬氨酸的发酵培养基中，之后在一定温度和光照下进行光照厌氧发酵培养。

根据本发明，所述发酵培养为光照厌氧异养发酵培养，这意味着如果采用有氧发酵就无法很好的实现沼泽红假单胞菌的生长。

对于沼泽红假单胞菌来说，一般其最适生长pH为7.0左右，而天冬氨酸本身是酸性氨基酸，会改变培养基的pH，因此需要添加碱性化合物提高培养物的初始pH达到7.0左右。

例如，在一些优选的实施例中，所述种子培养基在接种前或接种后将pH值调至6.5-8.0，优选7.0-7.5。

又例如，在另一些优选的实施例中，所述发酵培养基在接种前或接种后将pH值调至6.5-8.0，优选7.0-7.5。

在本发明的实施例中，所述调节培养基pH的碱性化合物包括氢氧化钠、氢氧化钾、氨水、碳酸钠和磷酸氢二钾中的一种或几种。

本发明人还对光照强度和发酵温度进行了考察，发现所述光照厌氧发酵培养的温度为30-45℃，优选为35-40℃，进一步优选为35℃。用于光照的光源可以为二极管照明灯和/或白炽灯和/或太阳光，所述光照厌氧发酵培养的光照强度为2000-8000Lx，优选采用40W的白炽灯。

根据本发明方法，添加有天冬氨酸的培养基(种子培养基和发酵培养基)中沼泽红假单胞菌的生物量均有明显提高，例如，采用本发明方法，经过5天培养后所述种子液中的沼泽红假单胞菌细胞浓度为(30-50)×10⁸/mL；又例如，采用本发明方法，经过5天光照厌氧发酵培养后，能够获得细胞浓度达到74×10⁸/mL的沼泽红假单胞菌菌液。沼泽红假单胞菌不仅可直接利用氨基酸，还可以将氨基酸转化为大量的可溶性代谢产物，这些产物可被光合细菌重新利用。天冬氨酸在光合细菌中可通过斯提柯兰氏反应在光照厌氧条件下进行氧化脱氨生成乙酸盐和ATP，也可通过脱羧反应转化为丙氨酸，而丙氨酸又进一步降解为乙酸盐，可以作为光合细菌生长的碳源，进而促进光合细菌的生长。

本发明中细胞浓度和pH采用以下方法测定：

1.沼泽红假单胞菌细胞浓度的测定，取沼泽红假单胞菌培养物，经生理食盐水稀释一定倍数后，直接采用流式细胞仪(德国SYSMEX)测定其中的细胞浓度。

2.pH测定，采用pH计(S210 SevenCompact^TM pH计)将pH探头直接插入到沼泽红假单胞菌中测定pH。

Ⅲ.实施例

以下通过附图和具体实施例对于本发明进行具体说明。下文所述实验方法，如无特殊说明，均为实验室常规方法。下文所述实验材料，如无特别说明，均可由商业渠道获得。

本发明采用的光合细菌菌种为从中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)购买的沼泽红假单胞菌菌株[Rhodopseudomonas palustris(Molisch)van Niel]，保藏编号为CGMCC NO.1.2180(ATCC33872)。

实施例1：利用含天冬氨酸的培养基培养沼泽红假单胞菌。

1.沼泽红假单胞菌种子液的制备

(1)配制液体培养基：用于种子培养的液体培养基(种子培养基)以1L水计的组成如下：

向上述用于种子培养的液体培养基中加入天冬氨酸，天冬氨酸的添加量为2.0g/L。

(2)接种及种子培养：按照30％(v/v)比例接种沼泽红假单胞菌培养物120毫升于400毫升灭菌后的培养基中，采用封口膜密闭后在温度35-40℃、光照2000-8000Lx条件下培养，5天后细胞浓度达到(30-50)×10⁸/mL后作为沼泽红假单胞菌的种子液。

2.配制含不同浓度天冬氨酸的培养基

(1)配制含天冬氨酸的液体培养基：培养基以1L水计的组成如下：

(2)接种：取光合细菌培养基400毫升于500毫升三角瓶中，在高温(121℃)高压(0.15MPa)下灭菌20min，接种120毫升沼泽红假单胞菌种子液，通过添加200g/L的氢氧化钠溶液调节初始pH为7.0，采用封口膜封闭瓶口后在温度35-40℃、光照强度2000-8000Lx条件下进行光照厌氧培养。图1显示了沼泽红假单胞菌在不同浓度天冬氨酸培养基中的生长情况，培养5天沼泽红假单胞菌的生物量显著提高，其中天冬氨酸添加量为2.0g/L的实验组生物量提高了100％，添加了0.5g/L、1.0g/L、5.0g/L天冬氨酸实验组的生物量分别提高了21.0％、69.0％、92.9％，说明天冬氨酸可以显著促进沼泽红假单胞菌的生长，其中2.0g/L天冬氨酸下促进沼泽红假单胞菌生长效果最好。

以上所述仅为本发明利用天冬氨酸促进沼泽红假单胞菌生长的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种促进光合细菌生长的方法，其包括在培养基中添加天冬氨酸来对光合细菌进行光照厌氧发酵培养获得光合细菌发酵培养物。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述培养基包括种子培养基和/或发酵培养基；优选地，所述天冬氨酸的添加浓度为0.5-5.0g/L。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，

所述促进光合细菌生长的方法包括将发酵菌种接种至含有天冬氨酸的发酵培养基中进行光照厌氧发酵培养，获得发酵培养物；

其中，所述发酵菌种由所述光合细菌相应的菌株经过种子培养获得，所述光合细菌相应的菌株为保藏编号为CGMCC NO.1.2180的沼泽红假单胞菌菌株或其他任何一种或几种光合细菌菌株。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在所述发酵培养基中，所述天冬氨酸的含量为0.5-5.0g/L；优选地，所述发酵培养基在接种前或接种后将pH值调至6.5-8.0；优选7.0-7.5。

5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述种子培养包括将光合细菌相应的菌株的单克隆菌落接种到含有天冬氨酸的种子培养基中进行光照厌氧培养，获得种子液。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，在所述种子培养基中，所述天冬氨酸的含量为0.5-5.0g/L；优选地，所述种子培养基在接种前或接种后将pH值调至6.5-8.0；优选7.0-7.5。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，经过5天培养后所述种子液中的沼泽红假单胞菌细胞浓度为(30-50)×10⁸/mL。

8.根据权利要求3-7中任意一项所述的方法，其特征在于，所述发酵菌种以种子液的形式接种到含天冬氨酸的发酵培养基中，并且基于含天冬氨酸的发酵培养基的总体积计，所述种子液的接种量为10％-30％(v/v)，优选为30％(v/v)；和/或，所述种子液中的光合细菌细胞的浓度为(30-50)×10⁸/mL。

9.根据权利要求3-8中任意一项所述的方法，其特征在于，所述光照厌氧发酵培养的温度为30-45℃，优选为35-40℃；和/或，所述光照厌氧发酵培养的光照强度为2000-8000Lx；和/或，用于光照的光源为二极管照明灯和/或白炽灯和/或太阳光。

10.根据权利要求3-9中任意一项所述的方法，其特征在于，经过5天光照厌氧发酵培养后，能够获得细胞浓度达到74×10⁸/mL的沼泽红假单胞菌菌液。

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