CN114940950A - 一种丁酸梭菌发酵废液资源化利用的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于发酵废液资源化利用技术领域，涉及一种丁酸梭菌发酵废液资源化利用的方法，其包括：步骤B，在丁酸梭菌发酵废液中接入酵母菌菌种进行好氧培养，分离处理，分别获得酵母菌体，以及酵母菌发酵废液；步骤C，向酵母菌发酵废液中接入光合细菌菌种进行光照厌氧培养，得到高细胞浓度光合细菌菌液。该方法能够充分利用丁酸梭菌发酵废液的营养成分，同时得到可用作微生物制剂的酵母及可用作微生物菌肥的含高细胞浓度光合细菌的菌液(细胞浓度可达1.5×10⁹cfu/mL以上)，是丁酸梭菌发酵液高效资源化利用的一条有效途径。通过一系列不同的研究实验，证明这一技术性能稳定，能够应用于产业化。

Description

一种丁酸梭菌发酵废液资源化利用的方法

技术领域

本发明属于发酵废液资源化利用技术领域，涉及一种丁酸梭菌发酵废液资源化利用的方法，具体涉及一种利用丁酸梭菌发酵废液序列培养酵母菌和光合细菌的方法。

背景技术

丁酸梭菌(Clostridium butyricum)，又称酪酸梭菌，是典型的严格厌氧芽孢杆菌。作为人和动物肠道内的正常菌群，它能促进生物体对脂肪和蛋白质等营养物质的吸收，同时还能抑制肠道中某些有害细菌的生长，因此在临床上用于治疗多种肠道疾病。目前丁酸梭菌也被开发成微生态制剂应用于畜牧、医药、化工等多个领域。相比于固态发酵，丁酸梭菌液体发酵生产的菌粉纯度更高、活菌数更多，因此在生产中被广泛采用。

丁酸梭菌液体发酵常以葡萄糖为碳源，酵母粉、牛肉粉和蛋白胨为氮源，产物主要为丁酸、乳酸、乙酸等有机酸。完成发酵后通过离心获得菌体，再经一定处理制成菌剂。剩余的发酵废液含有大量有机酸、糖和蛋白质等营养物质，其直接排放会造成环境污染，同时也是资源的浪费。随着丁酸梭菌制品商品化规模扩大，发酵废液的处理问题亟待解决。处理丁酸梭菌发酵废液的技术已有报道，专利CN113604380 A利用丁酸梭菌离心废液发酵生产复合菌剂，有一定应用成效。但该技术在发酵前将废液稀释成原液的50％，大大降低了废液的处理效率，并且还需将废液做消毒处理并额外添加大量营养物质，获取复合菌剂后会产生比原离心废液更多的废液。另有专利CN108541805 A为丁酸梭菌发酵废水再利用生产丁酸梭菌发酵饲料，实质是将丁酸梭菌废水中剩余丁酸梭菌当作菌种使用，同样也需在废水中添加大量营养物质以供后续二次半固体发酵，效率不高。

可见在丁酸梭菌发酵废液处理技术上还存在较多不足，而在丁酸梭菌发酵废液的高效生物资源化处理过程中得到酵母和含高细胞浓度光合细菌微生物菌肥的技术未见报道。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对现有技术中丁酸梭菌发酵废液高效资源化处理的技术空缺提供一种丁酸梭菌发酵废液资源化利用的方法，该方法利用丁酸梭菌发酵废液序列培养酵母菌和光合细菌，能够收获可作为微生物制剂的酵母菌体，同时得到含高细胞浓度光合细菌的微生物菌肥，特别是废液利用过程均无需灭菌、稀释和添加复杂的营养物质，无任何废弃物产生，实现了丁酸梭菌发酵废液的充分再利用。

为此，本发明提供了一种丁酸梭菌发酵废液资源化利用的方法，其包括：

步骤B，在丁酸梭菌发酵废液中接入酵母菌菌种进行好氧培养，分离处理后，分别获得酵母菌体，以及酵母菌发酵废液；

步骤C，向酵母菌发酵废液中接入光合细菌菌种进行光照厌氧培养，得到高细胞浓度光合细菌菌液。

本发明中，所述丁酸梭菌发酵废液是丁酸梭菌厌氧发酵后经分离处理移除丁酸梭菌菌体的上清液。

在本发明的一些实施例中，所述酵母菌发酵废液是酵母菌好氧发酵后经分离处理移除酵母菌体的上清液。

本发明中，所述分离处理包括离心分离和/或膜过滤。

根据本发明方法，所述丁酸梭菌发酵废液中还加入了NaHCO₃；优选地，NaHCO₃加入量为每升丁酸梭菌发酵废液5.0-7.0g。

根据本发明的一些实施方式，所述酵母菌菌种以种子液的形式接入到丁酸梭菌发酵废液中；优选地，基于丁酸梭菌发酵废液总体积计，酵母菌种子液的接种量为1％-4％，优选为2％-3％；进一步优选地，所述酵母菌种子液的细胞浓度为(5-6)×10⁸cfu/mL。

根据本发明的一些实施方式，所述光合细菌菌种以种子液的形式接入到酵母菌发酵废液中；优选地，基于酵母菌发酵废液总体积计，所述光合细菌菌种接种量为35％-45％，优选为35％-40％；进一步优选地，所述光合细菌种子液的细胞浓度为(4.5-5.5)×10⁸cfu/mL。

在本发明的一些实施例中，在步骤B中，所述好氧培养的温度为25-32℃，优选为28-30℃。

在本发明的一些实施例中，在步骤B中，所述好氧培养的时间为1-3天，优选为2-3天。

优选地，在步骤B中，所述好氧培养的摇床转速为150-220rpm，优选为180-200rpm。

在本发明的一些实施例中，在步骤C中，光照厌氧培养的温度为32-40℃，优选为35-37℃。

在本发明的一些实施例中，在步骤C中，所述光照厌氧发酵培养的时间为8-12天，优选为10-12天。

在本发明的一些实施例中，在步骤C中，所述光照厌氧发酵培养的光照强度为250-2500lux，优选为500-1000lux；进一步优选地，所述光照厌氧发酵培养的光源为LED灯或白炽灯。

优选地，在步骤B中，酵母菌体可用作微生物制剂。

优选地，在步骤C中，将含高细胞浓度光合细菌的菌液用作微生物菌肥。

本发明所提供的丁酸梭菌发酵废液资源化利用的方法以丁酸梭菌发酵废液为培养基，序列培养酵母和光合细菌。丁酸梭菌发酵废液先加入固体NaHCO₃(每升废液添加5.0-7.0g)，然后接入酵母菌种子液经好氧培养，浓度达到(8-9)×10⁸cfu/mL。离心收获酵母细胞后，上清液(即酵母菌发酵废液)接种光合细菌种子液，光照厌氧培养8-12天，可获得含1.5×10⁹cfu/mL以上高细胞浓度光合细菌的菌液。因此这是一种将丁酸梭菌发酵液高效资源化利用的有效方式。而且通过一系列不同的研究实验，证明这一技术性能稳定，能够应用于产业化。

附图说明

下面将结合附图来说明本发明。

图1示出丁酸梭菌发酵废液是否培养酵母以及酵母生长浓度对光合细菌生长的影响。

图2示出丁酸梭菌发酵废液添加不同NaHCO₃量或采用NaOH调节pH对培养酵母和光合细菌的影响。

图3示出光合细菌接种量对丁酸梭菌发酵液培养光合细菌的影响。

图4示出高浓度光合细菌菌液做微生物菌肥对紫花苜蓿鲜重(a)和粗蛋白(b)含量的影响。

具体实施方式

为使本发明容易理解，下面将结合附图来详细说明本发明。但在详细描述本发明前，应当理解本发明不限于描述的具体实施方式。还应当理解，本文中使用的术语仅为了描述具体实施方式，而并不表示限制性的。

除非另有定义，本文中使用的所有术语与本发明所属领域的普通技术人员的通常理解具有相同的意义。虽然与本文中描述的方法和材料类似或等同的任何方法和材料也可以在本发明的实施或测试中使用，但是现在描述了优选的方法和材料。

Ⅰ、术语

本发明所述用语“菌体”是指细菌的活细胞。

本发明所述用语“高细胞浓度光合细菌菌液”是指细胞浓度超过1.5×10⁹cfu/mL的光合细菌菌液，用作微生物菌肥。

本发明所述用语“丁酸梭菌发酵废液资源化利用”是指丁酸梭菌经液体发酵分离菌体后剩余的发酵上清液被用于培养酵母和光合细菌，所获得的酵母菌体可作为微生物制剂，所获得的含高细胞浓度光合细菌菌液可以作为微生物菌肥。

Ⅱ、实施方案

如前所述，丁酸梭菌液体发酵完成后剩余的发酵废液包含了大量有机酸、糖和蛋白质等营养物质，其直接排放会造成环境污染，同时也是资源的浪费。随着丁酸梭菌制品商品化规模扩大，发酵废液的处理问题也亟待解决，处理丁酸梭菌发酵废液的技术已有报道，但存在一些不足，例如，有的丁酸梭菌发酵废液处理技术发酵前需要将废液稀释成原液的50％，大大降低了废液的处理效率，并且还需将废液做消毒处理并额外添加大量营养物质，获取复合菌剂后会产生比原离心废液更多的废液；有的丁酸梭菌发酵废水再利用生产丁酸梭菌发酵饲料，实质是将丁酸梭菌废水中剩余丁酸梭菌当作菌种使用，同样也需在废水中添加大量营养物质以供后续二次半固体发酵，效率不高。鉴于此，本发明人对于丁酸梭菌发酵废液的生物资源化处理技术进行了大量研究。

酵母菌是生产生活中的一类常见微生物，种类丰富、分布广泛，生存能力强，培养方式简单。除在发酵酿酒方面的应用，因一些酵母菌株富含丰富的蛋白质、维生素等营养成分，在食品、饲料行业也有大量需求，毕赤酵母则是其中典型的一种。在溶氧充足的情况下酵母生长迅速，且能够利用多种碳源，包括葡萄糖、果糖等糖类物质。以往的技术研究中可将毕赤酵母菌泥通过一定处理制成微生物制剂，并在饲喂奶牛上有不错的效果(专利CN107022498A)。

光合细菌是一类代谢方式多样、适应能力较强的原核生物，在生物产氢、废水处理、增强动植物抗病性方面有较多的应用。常见的有球形红细菌、红假单胞菌，其中沼泽红假单胞菌最为典型。沼泽红假单胞菌常以乙酸、乳酸等小分子有机酸类物质为碳源，铵或氨基酸为氮源。但在糖类做碳源时厌氧培养不能很好地生长，且优先利用小分子氮源。沼泽红假单胞菌富含类胡萝卜素、辅酶Q10等生物活性物质，常作为微生物菌肥应用于农业生产中，其能有效提高种子发芽率、促进植株生长发育，以及改善作物品质，例如蛋白质、维生素和可溶性糖等物质的含量增加。

如前所述，丁酸梭菌发酵废液的生物资源化处理同时得到酵母和含高细胞浓度光合细菌的微生物菌肥技术尚未见报道。

本发明人经大量系统研究发现，利用丁酸梭菌发酵废液不能直接培养沼泽红假单胞菌，因为此时发酵液中多为沼泽红假单胞菌难以利用成分，如糖类、大分子蛋白等。先将丁酸梭菌发酵废液培养酵母菌，可以有效地处理发酵废液中剩余的葡萄糖，以及蛋白胨等复合氮源，将大分子蛋白转化成游离氨基酸，且产生维生素B等多种维生素。然后分离酵母菌泥，此时上清中糖类大量减少，余留有机酸类的碳源，氮源以氨基酸类的小分子为主，均为沼泽红假单胞菌可充分利用营养成分，而且酵母菌产生的多种维生素可有效促进沼泽红假单胞菌的生长。但丁酸梭菌发酵废液中的大量丁酸以及其它中链脂肪酸难以被沼泽红假单胞菌利用。推测因为沼泽红假单胞菌通过β氧化降解利用丁酸，相较于其他小分子有机酸的代谢，此过程中将产生更多的还原型物质，会导致胞内氧化还原不平衡。本发明人通过大量实验发现，丁酸梭菌发酵废液中添加NaHCO₃可以为沼泽红假单胞菌培养提供CO₂，以促进沼泽红假单胞菌对丁酸等中长链脂肪酸的代谢。因为CO₂的增加可促进沼泽红假单胞菌卡尔文循环，将丁酸代谢产生的还原性物质氧化。并且NaHCO₃的加入能调节丁酸梭菌发酵废液的pH，为酵母培养提供合适的生长条件。基于此，本发明人设计制定了丁酸梭菌发酵废液序列培养酵母菌和光合细菌的技术流程，以丁酸梭菌发酵液经菌体分离后的丁酸梭菌发酵废液作为液体培养基培养酵母，然后分离酵母菌体，并将所获得的酵母菌发酵废液作为液体培养基培养沼泽红假单胞菌；该方法能收获可作为微生物制剂的酵母菌体，以及含高细胞浓度光合细菌菌液的微生物菌肥，此时丁酸梭菌发酵废液已被充分的利用，由此获得本发明。

因此，本发明所涉及的丁酸梭菌发酵废液资源化利用的方法，是以丁酸梭菌发酵废液为培养基依次培养酵母和光合细菌，同时得到酵母菌体和含高细胞浓度光合细菌菌液的微生物菌肥。其包括：

步骤B，在丁酸梭菌发酵废液中接入酵母菌菌种进行好氧培养1-3天，优选为2-3天，更优选为2天，分离处理，分别获得酵母菌体，以及酵母菌发酵废液；

步骤C，向酵母菌发酵废液中接入光合细菌菌种进行光照厌氧培养8-12天，优选为10-12天，更优选为10天，得到高浓度光合细菌菌液。

根据本发明方法，所述分离处理包括离心分离和/或膜过滤，优选为离心分离。

本发明中，所述丁酸梭菌发酵废液是丁酸梭菌厌氧发酵后经分离处理(例如离心分离)移除丁酸梭菌菌体的上清液，其不需要做彻底灭菌处理就可以用作酵母菌的发酵培养基。

本发明中，所述酵母菌发酵废液是酵母菌好氧发酵后经分离处理(例如离心分离)移除酵母菌体的上清液，本发明中也称为酵母发酵废液，其不需要做彻底灭菌处理就可以用作光合细菌的发酵培养基。

在本发明的一些优选的实施方式中，所述丁酸梭菌发酵废液中添加了固体NaHCO₃；优选地，NaHCO₃加入量为每升丁酸梭菌发酵废液5.0-7.0g。

本发明采用丁酸梭菌纯种厌氧发酵，测定发酵液的主要理化指标，结果见表1。其中TOC和TN含量较高，且含有较多的丁酸，pH较低，直接排放会导致环境污染，特别是造成水体富营养化。

表1丁酸梭菌发酵废液主要理化指标

本发明中，所述酵母菌菌种以种子液的形式接入到丁酸梭菌发酵废液中。

在本发明的一些实施例中，基于丁酸梭菌发酵废液总体积计，酵母菌种子液的接种量为1％-4％，优选为2％-3％，更优选为2％；进一步优选地，所述酵母菌种子液的细胞浓度为(5-6)×10⁸cfu/mL。

本发明中，所述酵母菌菌种为毕赤酵母菌菌种，优选采用的酵母菌种为库德里阿兹威氏毕赤酵母DCRP株(Pichia kudriavzeviistrainDCRP)，其保藏编号为CGMCCNO.12209(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)。

本发明中，所述光合细菌菌种以种子液的形式接入到酵母菌发酵废液中。

在本发明的一些实施例中，基于酵母菌发酵废液总体积计，所述光合细菌菌种接种量为35％-45％，优选为35％-40％，更优选为40％；进一步优选地，所述光合细菌种子液的细胞浓度为(4.5-5.5)×10⁸cfu/mL。

本发明中，所述光合细菌菌种为沼泽红假单胞菌菌株(Rhodopseudomonaspalustris)，其保藏编号为CGMCCNO.1.2180(中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)。

根据本发明方法，在步骤B中，所述好氧培养的温度为25-32℃，优选为28-30℃，更优选为28℃。

优选地，所述好氧培养的摇床转速为150-220rpm，优选为180-200rpm。

根据本发明方法，在步骤C中，光照厌氧培养的温度为32-40℃，优选为35-37℃，更优选为37℃。

在本发明的一些实施例中，所述光照厌氧发酵培养的光照强度为250-2500lux，优选为500-1000lux。

本发明中，所述光照厌氧发酵培养的光源为LED灯或白炽灯。

在本发明的一些实施例中，在步骤B中，酵母菌体可用作微生物制剂。

在本发明的另一些实施例中，在步骤C中，将得到的含高细胞浓度光合细菌的菌液用作微生物菌肥。

本发明还提供了一种微生物制剂，其由本发明中利用丁酸梭菌发酵废液培养酵母的方法制得。

本发明还提供了一种微生物菌肥，其由本发明中培养得到光合细菌菌液的方法制得。

在本发明的一些具体的实施例中，丁酸梭菌发酵废液序列培养酵母和光合细菌的方法按以下步骤进行：

一、库德里阿兹威氏毕赤酵母的种子培养

本发明中，酵母种子培养选用YPD培养基，以去离子水为溶剂添加1％酵母粉、2％蛋白胨以及2％葡萄糖。

本发明的一些实施例中，利用上述培养基培养酵母的培养步骤如下：

(1)配制YPD培养基，在250mL三角瓶装入50mL该液体培养基，经封口膜密闭封口后高压蒸汽灭菌30min(115℃，0.06MPa)，再置于超净工作台内紫外灯照射20min后使用。

(2)在超净工作台内，将库德里阿兹威氏毕赤酵母DCRP株储存菌液以2％(v/v)接种量接种至装有50mLYPD培养基的250mL三角瓶中，用可透气封口膜封口以隔绝瓶外杂菌，28℃，摇床200rpm培养1天，酵母细胞数量达到(5-6)×10⁸cfu/mL，即可作为酵母种子接种于丁酸梭菌发酵废液中进行培养。

二、沼泽红假单胞菌的种子培养

本发明中，沼泽红假单胞菌种子培养以去离子水作为溶剂，每1L去离子水中添加表2中所述重量的组分：

表2沼泽红假单胞菌种子培养基

T.M储备液为：H₃BO₃，0.7g/L；MnSO₄.H₂O，0.389g/L；NaMoO₄H₂0，0.188g/L；Cu(NO₃)₂3H₂0，0.01g/L。

在本发明的一些实施例中，利用上述培养基培养沼泽红假单胞菌菌种的培养步骤如下：

(1)按上述配方配制成培养基，用500mL三角瓶配置好液体培养基400mL，经封口膜密闭封口后在高压蒸汽灭菌15min(121℃，0.15MPa)，然后置于在超净工作台内紫外灯照射20min以上，冷却后分装至透明玻璃瓶中待使用。

(2)在超净工作台内，挑取沼泽红假单胞菌单菌落于灭菌培养基中，37℃，500lux厌氧光照培养，至菌液浓度(4.5-5.5)×10⁸cfu/mL后即可作为种子接种。同时通过按20％(v/v)接种量将种子接种于上述灭菌培养基中，培养2-3天可制备出新的菌种。

三、丁酸梭菌发酵废液序列培养酵母和光合细菌

在本发明的一些实施例中，先将丁酸梭菌发酵液经10000rpm、10min离心去除丁酸梭菌菌体获得发酵废液，并且每升发酵废液加入6.0g固体NaHCO₃，然后酵母培养阶段(步骤B)按照2％(v/v)的比例将酵母接种，在装液量为20％的三角瓶中28℃、200rpm摇床好氧培养2天，10000rpm离心10min收获酵母泥。光合细菌培养阶段(步骤C)，通过添加36％HCl将酵母菌发酵废液pH调节为7.0，按照40％的比例接种光合细菌，37℃，500lux厌氧光照培养10天，最终获得含高细胞浓度光合细菌的菌液用作微生物菌肥。

应该了解的是，本发明在酵母培养阶段(步骤B)采用好氧培养，不仅酵母菌生长速度快，而且能很好地抑制丁酸梭菌废液中少量残存菌体的繁殖。因此，丁酸梭菌发酵废液无需灭菌直接用于酵母培养，缩短了处理周期、简化了培养流程以及降低了能耗。对于沼泽红假单胞菌来说，最适生长pH为7.0左右，而此时培养酵母后的发酵废液pH在9.0左右，所以需要添加酸性化合物调整废液的pH。

本发明人研究发现，所述丁酸梭菌发酵废液培养酵母前添加的固体NaHCO₃，主要作用是在光合细菌培养阶段(步骤C)为光合细菌生长提供CO₂，不含HCO₃ ^-的其他碱性化合物难以实现。

根据本发明方法，在酵母培养阶段(步骤B)采用好氧培养酵母，光合细菌培养阶段(步骤C)采用静置培养，所述光合细菌生长条件为光照厌氧异养培养，这意味着若采用有氧培养就不能实现沼泽红假单胞菌的很好生长。

在本发明的一些实施例中，所述种子液的培养时间不宜过长，光合细菌接种前菌浓度应为(4.5-5.5)×10⁸cfu/mL，延长培养时间提高种子生物量会影响菌种活性。并以种子液形式接种于发酵废液中，此接种量为35％-45％，优选为35％-40％，更优选种子液的接种量为40％。

在本发明的一些实施例中，在光合细菌培养阶段(步骤C)调节废液pH的盐酸也可更改成其他酸性化合物。

在本发明的一些实施例中，所述接种沼泽红假单胞菌的酵母菌发酵废液初始pH值为6.5-8.5；优选为7.0-7.5。

在本发明的一些实施例中，所述光照厌氧发酵培养的温度为32-40℃，优选为35-37℃，更优选为37℃。用于光照的光源可以为LED灯和/或白炽灯，所述光照厌氧发酵培养的光照强度为250-2000lux，优选为500-1000lux，进一步优选为500lux。

根据本发明方法，以丁酸梭菌发酵废液经毕赤酵母处理后，收获的酵母菌体可用作微生物制剂，剩余的发酵废液进行光合细菌厌氧培养，所获得的培养物中光合细菌细胞浓度可达1.5×10⁹cfu/mL以上，类胡萝卜素含量为23mg/L以上。这可以理解为本发明在收获酵母菌体后，还能利用酵母发酵废液培养光合细菌，以用于制备微生物菌肥，最大程度上充分利用了丁酸梭菌发酵废液中的营养物质，且整个培养过程不再产生任何余留废液或废弃物。目前，酵母微生物制剂和光合细菌微生物菌肥应用广泛，因此，发明人认为酵母和光合细菌序列培养是实现丁酸梭菌发酵废液高效资源化利用的一条有效途径。

Ⅲ、本发明中相关检测方法

本发明中TOC、TN、细胞浓度、pH、丁酸含量采用以下方法测定：

(1)TOC、TN的测定，采用TOC仪(岛津TOC-VCPH+TNM1)，0.22μm滤膜过滤丁酸梭菌发酵废液，经超纯水稀释一定倍数后直接注射进TOC仪中测定其中的TOC和TN浓度。

(2)酵母细胞浓度的测定，根据国家标准GB 4789.15-2016中的平板计数法进行计数。

(3)沼泽红假单胞菌细胞浓度的测定，根据国家标准GB/T 3879-2020中的计数方法，进行光合细菌计数。

(4)pH测定，采用pH计(METTLER TOLEDO FiveEasy Plus)将pH探头直接插入到溶液中测定pH。

(5)丁酸含量测定：采用高效液相色谱法，固定相为Zorbax SB-Aq(5μm，4.6mm×150mm)，流动相为乙腈：0.3mM磷酸水溶液＝10:90(v:v)，检测波长210nm，流速1.0mL/min，柱温40℃，进样体积20μL。

(6)苜蓿粗蛋白测定：根据国家标准GB/T 6432-2018中的凯氏定氮法。

实施例

为使本发明更加容易理解，下面将结合附图和实施例来进一步详细说明本发明，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本发明的应用范围。本发明中所使用的原料或组分若无特殊说明均可以通过商业途径或常规方法获得。

实施例1：利用丁酸梭菌发酵废液序列培养毕赤酵母和沼泽红假单胞菌。

(1)如前所述制备库德里阿兹威氏毕赤酵母菌种子[酵母细胞浓度达到5.5×10⁸cfu/mL]和沼泽红假单胞菌种子[沼泽红假单胞菌液浓度5.1×10⁸cfu/mL]。

(2)10000rpm、10min离心去除丁酸梭菌菌体获得丁酸梭菌发酵废液，每升丁酸梭菌发酵废液中加入固体NaHCO₃ 6.0g。

(3)将库德里阿兹威氏毕赤酵母以2％(v/v)接种量接种至丁酸梭菌发酵废液中，28℃，200rpm摇床培养0天(不接种酵母)、1天、2天、3天，以获得不同酵母浓度的发酵废液。

(4)将步骤(3)中不同酵母浓度的发酵废液10000rpm离心10min收获菌体，36％HCl将酵母菌发酵废液pH调节为7.0，然后40％(v/v)接种光合细菌，37℃，500lux厌氧光照培养10天。

(5)结果

实验研究发现酵母与光合细菌的序列培养是必须的。如图1所示，采用丁酸发酵废液直接培养(0天)，光合细菌几乎无法生长。且酵母生长浓度会影响光合细菌的生长。酵母浓度为8.53×10⁸cfu/mL时(2天)，光合细菌菌浓度高达1.57×10⁹cfu/mL。酵母浓度提高(3天的1.02×10⁹cfu/mL，相较于2天增加19.6％)会大幅降低后续培养得到的光合细菌浓度(仅有9.57×10⁸cfu/mL，降低39％)；酵母浓度过低(1天的7.21×10⁸cfu/mL，相较于2天减少15.5％)则会使发酵废液中大分子物质降解的不够完全，导致光合细菌不能有效利用剩余营养物，生物量为1.07×10⁹cfu/mL，相比2天降低32.3％。并且，在酵母培养阶段(步骤B)可从种子液浓度、接种量、培养时间等条件来控制酵母的生长量。

实施例2：

实施例2除NaHCO₃添加量外，其余条件采用实施例1中的最优方案。以丁酸梭菌发酵废液不添加NaHCO₃只采用NaOH调节废液pH至6为对照，研究NaHCO₃添加量分别为5.0g/L、5.5g/L、6.0g/L、6.5g/L和7.0g/L时对酵母菌和光合细菌生物量的影响。如图2所示，对照中采用NaOH调节pH为6，酵母生长良好(8.39×10⁸cfu/mL)，但光合细菌浓度偏低，仅有1.15×10⁹cfu/mL。当添加NaHCO₃添加量为5.0-7.0g/L时，不仅使丁酸梭菌发酵废液pH为6-7左右，适合酵母菌生长(浓度8.2-8.6×10⁸cfu/mL)，而且更关键是能提供CO₂使光合细菌充分利用丁酸(最大菌浓度为1.57×10⁹cfu/mL，相比于对照增加了36.5％)。

实施例3：

实施例3除光合细菌接种量外，其他条件则采用实施例1中的最优方案。光合细菌接种体积对比了20％、30％、40％以及50％，结果如图3所示，接种量偏低会使光合细菌生长缓慢，增大接种量能提高光合细菌生长速率，但过大的接种体积会减少营养物质导致最大菌浓度降低，因此选用40％为最为合适，光照厌氧培养时间为10天时达到最高浓度。

实施例4

实施例4为本发明最终得到的高细胞浓度光合细菌菌液作为微生物菌肥实施例，供试菌肥沼泽红假单胞菌活菌数量为1.5×10⁹cfu/mL以上。实验设置四组，每组苜蓿实验面积为5m×5m＝25m²，每实验设三平行组，随机排列。液态肥施用方法：对照组使用自来水，实验组施用不同稀释度(10倍、100倍、1000倍)的光合细菌菌液，总施用量30L。施用时将菌肥均匀喷洒至植株叶面部分，每次菌肥现用现配，使用时避开阴雨天气。苜蓿上一茬收割完每周施用一次，连续施用5次收割测鲜重和粗蛋白含量。

如图4所示，施用光合菌肥后苜蓿产量和粗蛋白含量都有明显提高。与对照组的测定结果相对比，10倍、100倍、1000倍处理组的鲜重分别高出：10.1％、12.4％和7.3％，粗蛋白含量分别提高：4.7％、3.8％和3.4％。

本实施例结果说明本发明得到的含高细胞浓度光合细菌的微生物菌肥肥效显著。

应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明作出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。

Claims (9)

1.一种丁酸梭菌发酵废液资源化利用的方法，其包括：

步骤B，在丁酸梭菌发酵废液中接入酵母菌菌种进行好氧培养，分离处理，分别获得酵母菌体，以及酵母菌发酵废液；

步骤C，向酵母菌发酵废液中接入光合细菌菌种进行光照厌氧培养，得到高细胞浓度光合细菌菌液。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述丁酸梭菌发酵废液是丁酸梭菌厌氧发酵后经分离处理移除丁酸梭菌菌体的上清液；和/或，所述酵母菌发酵废液是酵母菌好氧发酵后经分离处理移除酵母菌体的上清液；优选地，所述分离处理包括离心分离和/或膜过滤。

3.根据权利要求1或2所述方法，其特征在于，所述丁酸梭菌发酵废液中还加入了NaHCO₃；优选地，NaHCO₃加入量为每升丁酸梭菌发酵废液5.0-7.0g。

4.根据权利要求1-3中任意一项所述的方法，其特征在于，所述酵母菌菌种以种子液的形式接入到丁酸梭菌发酵废液中；优选地，基于丁酸梭菌发酵废液总体积计，酵母菌种子液的接种量为1％-4％，优选为2％-3％；进一步优选地，所述酵母菌种子液的细胞浓度为(5-6)×10⁸cfu/mL。

5.根据权利要求1-4中任意一项所述的方法，其特征在于，所述光合细菌菌种以种子液的形式接入到酵母菌发酵废液中；优选地，基于酵母菌发酵废液总体积计，所述光合细菌菌种接种量为35％-45％，优选为35％-40％；进一步优选地，所述光合细菌种子液的细胞浓度为(4.5-5.5)×10⁸cfu/mL。

6.根据权利要求1-5中任意一项所述的方法，其特征在于，在步骤B中，所述好氧培养的温度为25-32℃，优选为28-30℃；和/或，所述好氧培养的时间为1-3天，优选为2-3天；和/或，所述好氧培养的摇床转速为150-220rpm，优选为180-200rpm。

7.根据权利要求1-6中任意一项所述的方法，其特征在于，在步骤C中，光照厌氧培养的温度为32-40℃，优选为35-37℃；和/或，所述光照厌氧发酵培养的时间为8-12天，优选为10-12天；和/或，所述光照厌氧发酵培养的光照强度为250-2500lux，优选为500-1000lux；进一步优选地，所述光照厌氧发酵培养的光源为LED灯或白炽灯。

8.根据权利要求1-7中任意一项所述的方法，其特征在于，在步骤B中，将酵母菌体可用作微生物制剂。

9.根据权利要求1-7中任意一项所述的方法，其特征在于，在步骤C中，将含高细胞浓度光合细菌的菌液用作微生物菌肥。

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