CN101974452A

CN101974452A - 一种粘杆菌素高产菌株及其筛选方法

Info

Publication number: CN101974452A
Application number: CN2010102840481A
Authority: CN
Inventors: 李琪; 李建梅; 袁昉; 王培培; 李敏
Original assignee: HEBEI SHENGXUE DACHENG PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: HEBEI SHENGXUE DACHENG PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date: 2010-09-17
Filing date: 2010-09-17
Publication date: 2011-02-16
Anticipated expiration: 2030-09-17
Also published as: CN101974452B

Abstract

本发明公开了一种粘杆菌素高产菌株及其筛选方法，其菌株保藏名称为DCLL488，保藏单位CGMCC，保藏编号为CGMCC No：4099，保藏日期2010年08月24日。本发明方法，包括以下步骤：a、将粘杆菌素芽孢杆菌接种于活化培养液中，制成成熟活化菌液；b、取成熟活化菌液，加入的乙硫氨酸或甲硫氨酸水溶液；c、选择稀释度为10^-2-10^-6的稀释液，依次涂布于固体培养基平板上，培养48h-100h；d、挑取c步所培养的单个菌落，划线涂布于斜面培养基，再进行培养；e、将斜面上的菌苔刮下接种于种子培养基培养，f、发酵培养：将菌种接种发到发酵培养基培养48h-96h；本发明提高了粘杆菌素菌的生产效率。

Description

一种粘杆菌素高产菌株及其筛选方法

技术领域

本发明涉及多粘芽孢杆菌及其筛选方法，具体地说是一种粘杆菌素高产菌株及其筛选方法。

背景技术

粘杆菌素(Colistin)又称粘菌素、抗敌素、克利斯汀，是1947年由美国和英国的学者在多粘芽孢杆菌(Bacillus polymyxa)培养液中与多粘菌素B(PolymyxinB)一起发现的，当时被称为多粘菌素E(Polymyxin E)。后来由粘杆菌素芽孢杆菌(Bacillus colistinus)发酵生产，改称为粘杆菌素。它是一种带有氨基酸和脂肪酸侧链的碱性环肽类抗生素，能与细菌细胞质膜上的脂类结合而扰乱细胞膜的功能，并破坏细胞壁的完整性，对革兰氏阴性细菌如大肠杆菌、沙门氏菌、痢疾杆菌、流感杆菌、百日咳杆菌、产气杆菌、变形杆菌特别是绿脓杆菌有很强的杀菌作用，且不易产生抗药性，临床上主要用于治疗由上述敏感菌引起的胃肠道感染、手术后感染、烧伤后感染和其他局部感染，也用作饲料添加剂。

目前，粘杆菌素产生菌的选育主要采用诱变育种与随机筛选相结合的方法，但是，这种方法效率偏低，发酵单位提高较慢。邢维玲，周希贵等公开了一种“多粘菌素E高产菌株的选育方法(中国抗生素杂志2002，27(6)：326-327)，该方法是采用诱变和理性化相结合的一种筛选方法。它以多粘芽孢杆菌18-3为出发株，采用紫外诱变，并以重金属Cu2+作为筛选因子，获得一株遗传稳定且多粘菌素E发酵效价比出发菌株提高45％的菌株，对该菌株再采用亚硝基胍(NTG)诱变，以结氨酸结构类似物α-氨基丁酸作为筛选因子时得到一株产量提高34％的菌株，最终发酵单位为16295U/ml。该方法虽然提高了菌株的生产效率，但其筛选方法依旧繁琐、复杂，且菌株的发酵单位仍有待进一步提高。

发明内容

本发明的目的就是要提供一种粘杆菌素高产菌株，同时提供一种简捷、易操作的筛选该菌株的方法。

本发明的目的是这样实现的：

本发明所提供的粘杆菌素高产菌株，其菌株保藏名称为DCLL488，保藏单位CGMCC，保藏编号为CGMCC NO：4099，保藏日期2010年08月24日。

本发明所提供的粘杆菌素高产菌株的筛选方法，依次包括以下步骤：

a、将粘杆菌素芽孢杆菌接种于活化培养液中，在温度28℃-37℃，摇床转速为200rpm，活化培养20h-36h，制成成熟活化菌液；活化培养液的组成为：以质量百分配比计，葡萄糖1％-5％、酵母粉1％-5％、氯化钠0.3％-1.0％，水余量；pH6.5-7.0

b、取成熟活化菌液，加入体积质量比浓度为0.5mg/ml、水温为40℃-55℃的乙硫氨酸或甲硫氨酸水溶液，进行稀释；

c、选择稀释度为10^-2-10^-6的稀释液，依次涂布于固体培养基平板上，在温度为28℃-37℃，湿度为40％-60％条件下，培养48h-100h；固体培养基的组成为：以质量百分配比计，葡萄糖1％-3％、酵母膏1％-3％、蛋白胨0.1％-0.5％、氯化钠0.1％-0.5％、琼脂2.2％，水余量，pH6.0-7.0；

d、挑取c步所培养的单个菌落，划线涂布于斜面培养基，再按照c步所述条件进行培养；

e、菌种培养：将斜面上的菌苔刮下接种于种子培养基中，在温度28℃-37℃，摇床转速为200rpm，条件下培养20h-30h；种子培养基的质量百分配比为葡萄糖1％-3％、酵母粉4％-6％、氯化钠0.1％-0.5％、磷酸二氢钾0.05-0.1％，水余量，pH6.0-7.0；

f、发酵培养：将菌种接种发到发酵培养基中，在温度28℃-37℃，摇床转速为200rpm条件下，摇瓶培养48h-96h；发酵培养基的质量百分配比为豆粕粉3％-5％、硫酸铵1％-3％、磷酸二氢钾0.05-0.1％、七水硫酸亚铁0.01％-0.07％，水余量，pH6.0-7.0；发酵采用八层纱布。

在上述b步工序中，所说的水温优选40℃-45℃和50℃-55℃。由此可进一步高产菌株的筛选效率，同时也能进一步提高高效菌株的发酵单位。

布于e步工序中，最好将斜面培养基上培养好的菌种加入20％甘油保藏管(mg/ml)中，先在4℃冰箱内冻存，再-70℃液氮冷冻保藏，以进一步提高其存活率。然后再将其进行发酵培养。

本发明采用对粘杆菌素产生菌进行代谢调控和温度梯度筛选相结合的方法，实现了粘杆菌素高产菌株的筛选，提高了粘杆菌素菌的生产效率。本发明筛选工艺简单、易操作。因而可有效降低生产成本，同时也有利于进行大规模的筛选。

具体实施方式

以下实施例用于对本发明作进一步的详细说明。

实施例1

将polymyxa AS11541粘杆菌素芽孢杆菌(该菌种可从中国科学院微生物研究所菌种保藏中心购得)接种到活化培养基(该培养基的组成：葡萄糖1％、酵母粉1％、氯化钠0.3％，水余量，pH6.5)中，进行活化培养，28℃-37℃，摇床转速为200rpm，培养20h-36h。

取活化液菌种，加入体积质量比浓度为0.5mg/ml、水温为50℃-55℃的乙硫氨酸或甲硫氨酸水溶液，进行稀释；按照稀释度10^-2、10^-4、10^-6依次涂布于固体培养基平板中(同体培养基的构成葡萄糖1g、酵母膏1g、蛋白胨0.1g、氯化钠0.1g、琼脂2g，加水至100g，调pH至6.0-7.0)，进行单菌落培养，培养温度28℃-37℃，培养湿度40％-60％，培养48h。

活化液菌种经分离、在固体培养基上培养后，菌量有所减少，一部分为1-2mm、乳白色、微鼓的单菌落平铺于培养基表面，个别有2-3mm、扁平单菌落平铺于培养基表面。

在固体培养基上挑取菌落饱满的圆形单个菌落，划线涂布于斜面培养基上，进行斜面培养。斜面培养基的配方及培养条件与固体培养基一致。

将斜面上的菌苔刮下0.25cm²接种于装量为30ml的种子培养基中培养20h-30h，培养温度为28℃-37℃，摇床转速为200rpm。(种子培养基的组成：葡萄糖1g、酵母粉4g、氯化钠0.1g、磷酸二氢钾0.05g，加水至100g，pH6.0-7.0；)；即制成种子液。

再将0.9ml种子液接入到装量为30ml发酵培养基的300ml摇瓶中进行摇瓶培养(发酵培养基的配比为豆粕粉3g、硫酸铵1g、磷酸二氢钾0.05g、七水硫酸亚铁0.01g，加水至100g)，培养温度为28℃-37℃，摇床转速为200rpm，培养48h，得到本发明菌株，其保藏名称为DCLL488，保藏单位CGMCC，保藏编号为CGMCC NO：4099，保藏日期2010年08月24日。

将上述培养好的菌种加入20％甘油保藏管(mg/ml)中，先在4℃冰箱内冻存，再-70℃液氮冷冻保藏，可更有利于提高其存活率。

采用HPLC(EP5.0药典P1361-1362页)进行定量分析，测定结果为：

本实施例的出发菌的发酵单位效价为5520U/ml。筛选出的菌株(本发明菌株)的发酵单位效价为56000U/ml。(二者发酵培养条件相同)。

对上述采用出发菌、本发明菌株，其发酵液经12000r/min离心10min取上清液以双碟扩散法测定发酵效价，指示菌为大肠埃希氏菌CMCC(B)44103，获得与HPLC定量分析基本相同的测试结果。

对分离筛选出的菌株(本发明菌株)进行稳定性考察：

经活化培养基(该培养基的组成：葡萄糖5g、酵母粉5g、氯化钠1.0g，加水至100水余量，pH6.5-7.0)，连续转接5代后，相对效价为98％，表明该菌株具有较好的传代稳定性。

实施例2：

将polymyxa AS11541粘杆菌素芽孢杆菌(该菌种可从中国科学院微生物研究所菌种保藏中心购得)接种到活化培养基(该培养基的组成：葡萄糖5g、酵母粉5g、氯化钠1.0g，加水至100水余量，pH6.5-7.0)，进行活化培养，28℃-37℃，摇床转速为200rpm，培养20h-36h。

取活化液菌种，加入体积质量比浓度为0.5mg/ml、水温为40℃-45℃的乙硫氨酸或甲硫氨酸水溶液，进行稀释；按照稀释度10^-2、10^-3、10^-4、10^-5、10^-6依次涂布于固体培养基平板中(固体培养基的构成葡萄糖3g、酵母膏3g、蛋白胨0.5g、氯化钠0.5g、琼脂2g，加水至100g，调pH至6.0-7.0)，进行单菌落培养，培养温度37℃，培养湿度60％，培养100h。

在固体培养基上挑取生长好的单个菌落，划线涂布于斜面培养基上，进行斜面培养，斜面培养基的配方及培养条件与固体培养基一致

取斜面菌种进行保存，并将斜面上的菌苔刮下0.25cm²接种于装量为30ml的种子培养基中培养20h-30h，培养温度为28℃-37℃，摇床转速为200rpm。再将0.9ml种子液接入到装量为30ml发酵培养基的300ml摇瓶中进行摇瓶培养，培养温度为28℃-37℃，摇床转速为200rpm，培养48h-96h，得到粘杆菌素芽孢杆菌。菌株保藏名称为DCLL488，保藏单位CGMCC，保藏编号为CGMCC NO：4099，保藏日期2010年08月24日。

采用HPLC(EP5.0药典P1361-1362页)进行定量分析，本实施例的出发菌的发酵单位效价为5540U/ml。筛选出的菌株(本发明菌株)的发酵单位效价为52000U/ml。(二者发酵培养条件相同)。

对分离筛选出的菌株(本发明菌株)进行稳定性考察：

经活化培养液(该培养基的组成：葡萄糖5g、酵母粉5g、氯化钠1.0g，加水至100水余量，pH6.5-7.0)，连续转接3代后，相对效价为98％，表明该菌株具有较好的传代稳定性。

实施例3：将实施例1-2筛选到的菌株进行菌种鉴定。

其形态学特征为：-----细胞杆状，菌落乳白色、圆形、半透明、表面光滑、微凸起、边缘整齐。

化理生化特征为：-------生长温度在28℃-37℃，湿度为40％-60％，适合生长的pH是6.0-7.0。

实施例5发酵产量对比

试验材料：采用本发明中所描述的原材料和仪器材料

试验组采用本发明实施例1、2所筛选的菌株。

对照组按照邢维玲，周希贵等提供的多粘菌素E高产菌株的选育方法(中国抗生素杂志2002，27(6)：326-327)选育的菌株。

发酵方法均与实施例1相同。

定量分析方法：均采用HPLC对发酵产物进行定量分析。

对比结果见表2。

由此可见，本发明菌株其发酵产量远远高于现有高产菌株的发酵产量。

Claims

1.一种粘杆菌素高产菌株，其特征在于所述菌株保藏名称为DCLL488，保藏单位CGMCC，保藏编号为CGMCC NO：4099，保藏日期2010年08月24日。

2.一种权利要求1所述的高产菌株的筛选方法，其特征在于它依次包括以下步骤：

a、将粘杆菌素芽孢杆菌接种于活化培养液中，在温度28℃-37℃，摇床转速为200rpm，活化培养20h 36h，制成成熟活化菌液；活化培养液的组成为：以质量百分配比计，葡萄糖1％-5％、酵母粉1％-5％、氯化钠0.3％-1.0％，水余量；pH6.5-7.0；

f、发酵方法：将培养后的菌种接种发到发酵培养基中，在温度28℃-37℃，摇床转速为200rpm条件下，摇瓶培养48h；发酵培养基的质量百分配比为豆粕粉3％-5％、硫酸铵1％-3％、磷酸二氢钾0.05-0.1％、七水硫酸亚铁0.01％-0.07％，水余量，pH6.0-7.0。

3.根据权利要求2所述的高产菌株的筛选方法，其特征在于在b步所说的水温为40℃-45℃。

4.根据权利要求2所述的高产菌株的筛选方法，其特征在于在b步所说的水温为50℃-55℃。

5.根据权利要求2所述的高产菌株的筛选方法，其特征在于e步工序中，将斜面培养基上培养好的菌种加入20％甘油保藏管中，-70℃冷冻保藏。

6.根据权利要求2所述的高产菌株的筛选方法，其特征在于在保藏管冻存管要先在4℃进行预冻后再放入液氮内保存。