CN106282024B - 一种提高生产多粘菌素菌株正向突变机率的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种提高挑选多粘菌素正向突变菌株机率的方法，涉及多粘芽抱杆菌筛选差异菌领域。本发明对分离平板培养基添加轻质碳酸钙，制备成平板后进行低温冷藏，在分离平板上进行菌株培养，依据单菌落出现的外观形态转接到添加有轻质碳酸钙的斜面培养基培养，将斜面培养基上培养完成后的菌苔接种于种子培养基中培养，即得正向突变率大于50％的菌株。本发明采用对粘杆菌素产生菌进行代谢调控和固体培养基初始湿度进行调节相结合的筛选方法，实现了高产菌落的直观可区分的筛选方法，提高了粘杆菌素筛选中获得正向突变菌株的机率，提高了筛选效率。本发明方法工艺简单、易操作。因而可进行大规模的筛选，获得较多的高产菌株，进而降低生产成本。
Description
技术领域
本发明涉及多粘芽抱杆菌筛选差异菌领域，具体的是一种提高挑选多粘菌素正向突变菌株机率的方法。
背景技术
硫酸黏杆菌素(Colistin Sulfate)又名黏杆菌素、抗敌素、多黏菌素E，是从多黏芽胞杆菌变种(Bacillus polymyxa var.colistimus)的培养液中提取的一种碱性多肽类抗生素。近十几年来，由于药物残留和耐药问题对人类产生的潜在危害日益突出，发达国家相继禁用了若干种饲用抗生素。硫酸黏杆菌素因内服胃肠道不易吸收，不易产生耐药性，对革兰氏阴性菌，如大肠杆菌、沙门氏菌、巴氏杆菌、绿脓杆菌等有强大的抗菌作用而引起畜牧兽医工作者的关注。美国和欧盟将其批准作为兽药使用，在日本还被用作饲料添加剂。我国在20世纪90年代末由山东鲁抗医药集团成功研制了硫酸黏杆菌素及其制剂，并于2002年被农业部批准为国家三类新兽药。
尽管基因工程技术已经开始用于工业生产高产菌株的构建，但是应用物理、化学诱变因了如紫外线、高频电了流、亚硝基呱等仍然是遗传育种不可或缺的手段。为了提高诱变后高产菌株的筛选效率，人们设计了各种筛选方案，如川市设计了琼脂块法，Elander RP.等人提出利用前体及结构类似物抗性的筛选方法，它们在菌种选育中取得了较好的效果。周希贵、戴鹏高等公开了一种“粘杆菌素高产菌株的选育”方法(中国知网)，用亚硝基胍对多粘类芽胞杆菌(Paenibacilluspolymyxa)AS1 5 4 1进行诱变,采用其自身次生代谢产物粘杆菌素进行筛选时正突变率为32.3％，但其筛选方法依旧繁琐、复杂，虽然获得高产菌种的几率可以进一步提高。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种简捷、易操作、提高挑选多粘菌素正向突变菌株机率的方法；
为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：一种提高生产多粘菌素菌株正向突变机率的方法，其特征在于：对分离平板培养基添加轻质碳酸钙，制备成平板后进行低温冷藏，在分离平板上进行菌株培养，依据单菌落出现的外观形态转接到添加有轻质碳酸钙的斜面培养基培养，将斜面培养基上培养完成后的菌苔接种于种子培养基中培养，即得正向突变率大于50％的菌株。
进一步的技术方案在于，所述分离平板培养基平板培养基由以下组份及重量百分比组成：葡萄糖0.5％-1.5％，酵母粉0.5％-1.5％，牛肉膏0.1％-0.5％，氯化钠0.1％-0.5％，轻质碳酸钙0.1-0.2％，琼脂2.2％，水余量；所述分离平板培养基平板培养基pH6.0-7.2。
进一步的技术方案在于，所述斜面培养基由以下组份及重量百分比组成：葡萄糖0.5％-1.5％，酵母粉0.5％-1.5％，牛肉膏0.1％-0.5％，氯化钠0.1％-0.5％，轻质碳酸钙0.1-0.2％，琼脂2.2％，水余量；所述斜面培养基pH6.0-7.2。
进一步的技术方案在于，所述单菌落分为N(粘稠)型和G(干瘪)型菌落，所述G(干瘪)型菌落为高产菌落，可直观的进行操作，易挑选出正向突变菌株。
进一步的技术方案在于，所述的一种提高生产多粘菌素菌株正向突变机率的方法包括以下步骤：
(1)配制无菌的含有轻质碳酸钙的的分离平板培养基，在超净台上制成平板，然后在温度30-35℃的条件下空培3天；
(2)将步骤(1)中空培3天后的分离平板培养基放入冰箱，在2-10℃条件下冷藏6-10天；
(3)使用无菌水稀释生产菌株冻存管，选择稀释度为10-3-10-8的稀释液，依次涂布于步骤(2)中冷藏后的分离平板培养基上，在温度为28-35℃，湿度为30％-60％条件下，培养70h-100h，即得N(粘稠)型和G(干瘪)型菌落；
(4)挑取步骤(3)中G(粘稠)型单菌落，划线涂布于含有轻质碳酸钙的的斜面培养基上，在温度为28-35℃，湿度为30％-60％条件下，进行培养，即得菌苔；
(5)将步骤(4)中的菌苔刮下接种于种子培养基中，在温度28.0℃-35.0℃，摇床转速为190rpm的条件下培养20h-38h，即得正向突变率大于50％的菌株。
进一步的技术方案还在于，所述种子培养基由以下组份及重量百分比组成：蔗糖1％-2％，酵母粉2％-3％，氯化钠0.1％-0.5％，磷酸二氢钾0.05％-0.1％，水余量；所述种子培养基pH6.0-7.0。
采用上述技术方案所产生的有益效果在于：本发明采用对粘杆菌素产生菌进行代谢调控和固体培养基初始湿度进行调节相结合的筛选方法，实现了多粘菌素高产菌落的直观可区分的菌株筛选方法，提高了粘杆菌素筛选中获得正向突变菌株的机率，提高了筛选效率。本发明方法工艺简单、易操作。因而可进行大规模的筛选，获得较多的高产菌株，进而降低生产成本。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。
下述实施例中，种瓶种子即正向突变的菌株。
实施例1
(1)配制无菌分离平板培养基，在超净台上制成平板，然后在温度30-35℃的条件下空培3天；分离平板培养基由以下组份及重量百分比组成：葡萄糖1.0％，酵母粉1.0％，牛肉膏0.5％，氯化钠0.2％，琼脂2.2％，水余量，pH6.0-7.2；
(2)使用无菌水稀释生产菌株冻存管，选择稀释度为10-3-10-8的稀释液，依次涂布于步骤(1)中的分离平板培养基上，在温度为28-35℃，湿度为30％-60％条件下，培养70h-100h，即得菌落；
(3)挑取步骤(2)中单菌落135个，划线涂布于135个斜面培养基上，在温度为28-35℃，湿度为30％-60％条件下，进行培养，即得菌苔；斜面培养基由以下组份及重量百分比组成：葡萄糖1.0％,酵母粉1.0％，牛肉膏0.5％，氯化钠0.2％，琼脂2.2％，水余量，pH6.0-7.2；
(4)将步骤(3)中的菌苔刮下接种于种子培养基中，在温度28.-35℃，摇床转速为190rpm的条件下培养20h-38h，即得种瓶种子；种子培养基由以下组份及重量百分比组成：蔗糖1.5％,酵母粉2％，氯化钠0.3％，磷酸二氢钾0.06％，水余量，pH6.0-7.0。
至此，还需要种瓶种子接种发酵瓶进行效价能力的验证，发酵方法：将步骤(4)培养好的种瓶种子接种到发酵培养基中，在温度28-35℃，摇床转速为200rpm条件下，摇瓶培养45-50h，发酵培养基由以下组份及重量百分比组成：淀粉4％，硫酸按2％，磷酸二氢钾0.06％，七水硫酸亚铁0.03％，水余量，pH6.0-7.0；发酵瓶采用八层纱布；
测得发酵瓶效价和生产原菌株进行对照，高于对照的菌株有35株，所以正向突变率为35/135＝25.9％。
实施例2
(1)配制无菌分离平板培养基，在超净台上制成平板，然后在温度30-35℃的条件下空培3天；分离平板培养基由以下组份及重量百分比组成：葡萄糖1.0％,酵母粉1.0％，牛肉膏0.5％，氯化钠0.2％，轻质碳酸钙0.1％，琼脂2.2％，水余量，pH6.0-7.2；
(2)将步骤(1)中空培3天后的分离平板培养基放入冰箱，在2-10℃条件下冷藏6天；
(3)使用无菌水稀释生产菌株冻存管，选择稀释度为10-2-10-8的稀释液，依次涂布于步骤(2)中冷藏后的分离平板培养基上，在温度为28-35℃，湿度为30％-60％条件下，培养70h-100h，即得N(粘稠)型和G(干瘪)型菌落；
(4)挑取步骤(3)中G(粘稠)型单菌落128个菌落，划线涂布于128个斜面培养基上，在温度为28-35℃，湿度为30％-60％条件下，进行培养，即得菌苔；斜面培养基由以下组份及重量百分比组成：葡萄糖1.0％,酵母粉1.0％，牛肉膏0.5％，氯化钠0.2％，轻质碳酸钙0.1％，琼脂2.2％，水余量，pH6.0-7.2；
(5)将步骤(4)中的菌苔刮下接种于种子培养基中，在温度28-35℃，摇床转速为190rpm的条件下培养20h-38h，即得种瓶种子；种子培养基由以下组份及重量百分比组成：蔗糖1.5％,酵母粉2％，氯化钠0.3％，磷酸二氢钾0.06％，水余量，pH6.0-7.0；
至此，还需要种瓶种子接种发酵瓶进行效价能力的验证，发酵方法：将步骤(4)培养好的种瓶种子接种到发酵培养基中，在温度28-35℃，摇床转速为200rpm条件下，摇瓶培养45-50h，发酵培养基由以下组份及重量百分比组成：淀粉4％、硫酸按2％、磷酸二氢钾0.06％、七水硫酸亚铁0.03％，水余量，pH6.0-7.0；发酵瓶采用八层纱布；
测得发酵瓶效价和生产原菌株进行对照，高于对照的菌株有85株，所以正向突变率为85/128＝66.4％。
实施例3
(1)配制无菌分离平板培养基，在超净台上制成平板，然后在温度30-35℃的条件下空培3天；分离平板培养基由以下组份及重量百分比组成：葡萄糖1.0％,酵母粉1.0％，牛肉膏0.5％，氯化钠0.2％，轻质碳酸钙0.15％，琼脂2.2％，水余量，pH6.0-7.2；
(2)将步骤(1)中空培3天后的分离平板培养基放入冰箱，在2-10℃条件下冷藏8天；
(3)使用无菌水稀释生产菌株冻存管，选择稀释度为10-2-10-8的稀释液，依次涂布于步骤(2)中冷藏后的分离平板培养基上，在温度为28-35℃，湿度为30％-60％条件下，培养70h-100h，即得N(粘稠)型和G(干瘪)型菌落；
(4)挑取步骤(3)中G(粘稠)型单菌落144个菌落，划线涂布于144个斜面培养基上，在温度为28-35℃，湿度为30％-60％条件下，进行培养，即得菌苔；斜面培养基由以下组份及重量百分比组成：葡萄糖1.0％,酵母粉1.0％，牛肉膏0.5％，氯化钠0.2％，轻质碳酸钙0.15％，琼脂2.2％，水余量，pH6.0-7.2；
(5)将步骤(4)中的菌苔刮下接种于种子培养基中，在温度28-35℃，摇床转速为190rpm的条件下培养20h-38h，即得种瓶种子；种子培养基由以下组份及重量百分比组成：蔗糖1.5％,酵母粉2％，氯化钠0.3％，磷酸二氢钾0.06％，水余量，pH6.0-7.0；
至此，还需要种瓶种子接种发酵瓶进行效价能力的验证，发酵方法：将步骤(4)培养好的种瓶种子接种到发酵培养基中，在温度28-35℃，摇床转速为200rpm条件下，摇瓶培养45-50h，发酵培养基由以下组份及重量百分比组成：淀粉4％、硫酸按2％、磷酸二氢钾0.06％、七水硫酸亚铁0.03％，水余量，pH6.0-7.0；发酵瓶采用八层纱布；
测得发酵瓶效价和生产原菌株进行对照，高于对照的菌株有85株，所以正向突变率为116/144＝80.6％。
实施例4
(1)配制无菌分离平板培养基，在超净台上制成平板，然后在温度30-35℃的条件下空培3天；分离平板培养基由以下组份及重量百分比组成：葡萄糖1.0％,酵母粉1.0％，牛肉膏0.5％，氯化钠0.2％，轻质碳酸钙0.2％，琼脂2.2％，水余量，pH6.0-7.2；
(2)将步骤(1)中空培3天后的分离平板培养基放入冰箱，在2-10℃条件下冷藏10天；
(3)使用无菌水稀释生产菌株冻存管，选择稀释度为10-2-10-8的稀释液，依次涂布于步骤(2)中冷藏后的分离平板培养基上，在温度为28-35℃，湿度为30％-60％条件下，培养70h-100h，即得N(粘稠)型和G(干瘪)型菌落；
(4)挑取步骤(3)中G(粘稠)型单菌落130个菌落，划线涂布于130个斜面培养基上，在温度为28-35℃，湿度为30％-60％条件下，进行培养，即得菌苔；斜面培养基由以下组份及重量百分比组成：葡萄糖1.0％,酵母粉1.0％，牛肉膏0.5％，氯化钠0.2％，轻质碳酸钙0.2％，琼脂2.2％，水余量，pH6.0-7.2；
(5)将步骤(4)中的菌苔刮下接种于种子培养基中，在温度28-35℃，摇床转速为190rpm的条件下培养20h-38h，即得种瓶种子；种子培养基由以下组份及重量百分比组成：蔗糖1.5％,酵母粉2％，氯化钠0.3％，磷酸二氢钾0.06％，水余量，pH6.0-7.0；
至此，还需要种瓶种子接种发酵瓶进行效价能力的验证，发酵方法：将步骤(4)培养好的种瓶种子接种到发酵培养基中，在温度28-35℃，摇床转速为200rpm条件下，摇瓶培养45-50h，发酵培养基由以下组份及重量百分比组成：淀粉4％、硫酸按2％、磷酸二氢钾0.06％、七水硫酸亚铁0.03％，水余量，pH6.0-7.0；发酵瓶采用八层纱布；
测得发酵瓶效价和生产原菌株进行对照，高于对照的菌株有85株，所以正向突变率为94/130＝72.3％。
本发明在原配方的基础上添加轻质碳酸钙0.1-0.2％，产生优化分离平板培养基，为了使孢子在生长过程中稳定在合适的pH生长范围内更长的时间，利于孢子生长过程外观形态充分表达；冰箱冷藏使培养基表面水份缓慢蒸发，利于孢子的发芽和菌落的均匀生长，使菌落形态出现差异；挑选单菌落，N(粘稠)型和G(干瘪)型菌落，G型菌落为高产菌落，从而直观的进行操作，结果获得正向突变菌株的机率得到提高；最好将斜面培养基上培养好的菌种加入20％甘油保藏到冻存管中，-70℃冰箱保存或液氮冷冻保藏，以进一步提高其存活率，然后可以进行后续的发酵多次考察使用。
本发明采用对粘杆菌素产生菌进行代谢调控和固体培养基初始湿度进行调节相结合的筛选方法，实现了多粘菌素高产菌落的直观可区分的菌株筛选方法，提高了粘杆菌素筛选中获得正向突变菌株的机率，提高了筛选效率。本发明方法工艺简单、易操作。因而可进行大规模的筛选，获得较多的高产菌株，进而降低生产成本。
Claims (4)
1.一种提高挑选多粘菌素菌株正向突变机率的方法，其特征在于：对分离平板培养基添加轻质碳酸钙，制备成平板后进行低温冷藏，在分离平板上进行菌株培养，依据单菌落出现的外观形态转接到添加有轻质碳酸钙的斜面培养基培养，将斜面培养基上培养完成后的菌苔接种于种子培养基中培养，即得正向突变率大于50％的菌株；
所述分离平板培养基由以下组份及重量百分比组成：葡萄糖0.5％-1.5％，酵母粉0.5％-1.5％，牛肉膏0.1％-0.5％，氯化钠0.1％-0.5％，轻质碳酸钙0.1-0.2％，琼脂2.2％，水余量；所述分离平板培养基pH6.0-7.2；
所述单菌落分为N型菌落和G型菌落，所述N型菌落为粘稠型，所述G型菌落为干瘪型，所述G型菌落为高产菌落，直观的进行操作，挑选出正向突变菌株。
2.根据权利要求1所述的一种提高挑选多粘菌素菌株正向突变机率的方法，其特征在于：所述斜面培养基由以下组份及重量百分比组成：葡萄糖0.5％-1.5％，酵母粉0.5％-1.5％，牛肉膏0.1％-0.5％，氯化钠0.1％-0.5％，轻质碳酸钙0.1-0.2％，琼脂2.2％，水余量；所述斜面培养基pH6.0-7.2。
3.根据权利要求1-2任一项权利要求所述的一种提高挑选多粘菌素菌株正向突变机率的方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)配制无菌的含有轻质碳酸钙的分离平板培养基，在超净台上制成平板，然后在温度30-35℃的条件下空培3天；
(2)将步骤(1)中空培3天后的分离平板培养基放入冰箱，在2-10℃条件下冷藏6-10天；
(3)使用无菌水稀释生产菌株冻存管，选择稀释度为10-3-10-8的稀释液，依次涂布于步骤(2)中冷藏后的分离平板培养基上，在温度为28-35℃，湿度为30％-60％条件下，培养70h-100h，即得N型菌落和G型菌落；
(4)挑取步骤(3)中G型菌落，划线涂布于含有轻质碳酸钙的斜面培养基上，在温度为28-35℃，湿度为30％-60％条件下，进行培养，即得菌苔；
(5)将步骤(4)中的菌苔刮下接种于种子培养基中，在温度28.0℃-35.0℃，摇床转速为190rpm的条件下培养20h-38h，即得正向突变率大于50％的菌株。
4.根据权利要求3所述的一种提高挑选多粘菌素菌株正向突变机率的方法，其特征在于：所述种子培养基由以下组份及重量百分比组成：蔗糖1％-2％，酵母粉2％-3％，氯化钠0.1％-0.5％，磷酸二氢钾0.05％-0.1％，水余量；所述种子培养基pH6.0-7.0。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Zheng Wanjing Inventor after: Yan Caijie Inventor before: Zheng Wanjing Inventor before: Yan Caijie |
|
| GR01 | Patent grant | ||
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