CN116042481B - 一种贝莱斯芽孢杆菌复配壳寡糖发酵菌剂及其应用 - Google Patents
一种贝莱斯芽孢杆菌复配壳寡糖发酵菌剂及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种贝莱斯芽孢杆菌复配壳寡糖发酵菌剂及其应用，属于生物技术领域，贝莱斯芽孢杆菌复配壳寡糖发酵菌剂，包括贝莱斯芽孢杆菌剂和壳聚糖，所述贝莱斯芽孢杆菌剂由贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）BF017002制成，贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）BF017002于2022年07月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M20221086。本发明利用具有较强抑菌活性的贝莱斯芽孢杆菌BF017002，在前期发酵获得的初始发酵菌液后，复配壳寡糖，继续发酵3‑5d，获得复合发酵菌剂，该菌剂对番茄颈腐根腐病的防治效果达到80%以上。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体是一种贝莱斯芽孢杆菌复配壳寡糖发酵菌剂及其应用。
背景技术
番茄颈腐根腐病是番茄种植过程中危害极大的一种土传性病害，病原是尖孢镰刀菌FORL（Fusarium oxysporum f. sp. radicis-lycopersici）。该病害于1974年由Sato首次在日本发现，随后美国、以色列、加拿大等30多个国家相继发现该病害。我国在2007年首次在北京发现番茄颈腐根腐病（耿丽华等，2012），目前番茄颈腐根腐病在山东、黑龙江、河北、北京等地均有发生，成为危害番茄生产的重要土传病害。番茄颈腐根腐病发病初期，幼苗表现出根部和茎基部变褐色腐烂，叶片黄化或萎蔫，茎部维管束变色不超过茎基部25cm；发病后期主要表现为根部腐烂，整株萎蔫倒伏。目前国内对该病害的研究主要是选育抗病品种和化学防治技术，在生物防治方面的研究较少。
贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）普遍分布于植物组织、根际土壤等环境，能够产生抗菌肽、抗菌蛋白等多种生物活性代谢物，对植物病原菌具有良好的抑制作用；同时具有繁殖能力强、抗逆性优、环境安全性高等优点，能够通过拮抗、竞争、诱导植物产生抗病性等方式在植物病害生物防治中发挥作用，是一种优良的生防菌。
壳寡糖是壳聚糖经生物酶降解得到的一种小分子寡糖产品，聚合度在2-20之间，具备分子量低、水溶性好、生物活性高等优势，具有诱导植物抗性、促进种子萌发及根系生长、改善土壤微生物菌群、抑制病原菌等作用，在农业领域应用广泛。
利用微生物复配壳寡糖进行发酵，开发复合发酵菌剂，对实现高效、环境友好和可持续的植物病害综合治理具有重要作用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种贝莱斯芽孢杆菌复配壳寡糖发酵菌剂及其应用，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种贝莱斯芽孢杆菌复配壳寡糖发酵菌剂，包括贝莱斯芽孢杆菌剂和壳聚糖，所述贝莱斯芽孢杆菌剂由贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）BF017002制成，贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）BF017002于2022年07月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M20221086。
作为本发明的进一步技术方案，所述贝莱斯芽孢杆菌剂由以下步骤制备而成：
取适量保存在NA固体培养基上的贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）BF017002菌种接种到种子培养基中，在振荡培养箱中振荡培养，获得种子液；
将获得的种子液接种到发酵培养基中，在振荡培养箱中培养，获得贝莱斯芽孢杆菌剂。
作为本发明的更进一步技术方案，所述种子培养基中在转速150-200rpm的振荡培养箱中振荡培养24h，培养温度25-35℃。
作为本发明的再进一步技术方案，所述种子液接种到发酵培养基中的接种量为5%。
作为本发明的再进一步技术方案，所述发酵培养基在转速为转速150-200rpm的振荡培养箱中培养48-72h，培养温度25-35℃。
作为本发明的再进一步技术方案，所述壳寡糖的添加质量为贝莱斯芽孢杆菌剂质量的0.1-0.3%。
作为本发明的再进一步技术方案，所述贝莱斯芽孢杆菌复配壳寡糖发酵菌剂通过如下方法制备而成：在无菌条件下将壳寡糖加入贝莱斯芽孢杆菌剂，于25-35℃，转速150-200rpm的振荡培养箱中培养3-5d，即得。
如上述所述的贝莱斯芽孢杆菌复配壳寡糖发酵菌剂在治疗番茄颈腐根腐病中的应用。贝莱斯芽孢杆菌复配壳寡糖发酵菌剂的施用方法包括灌根、蘸盘中的至少一种。在番茄整个生长季均可使用，方法是番茄苗定植时，采用番茄苗在发酵菌剂中蘸盘；或通过灌根或水肥一体化冲施入番茄根际施用。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：利用具有较强抑菌活性的贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）BF017002，在前期发酵获得的初始发酵菌液后，复配壳寡糖，继续发酵3-5d，获得复合发酵菌剂，贝莱斯芽孢杆菌复配壳寡糖发酵菌剂对番茄颈腐根腐病菌具有显著的抑制作用，抑菌率达到80%以上；同时对番茄灰霉病菌、番茄晚疫病菌、番茄叶霉病菌、番茄灰叶斑病菌、番茄红粉病菌、番茄早疫病菌、黄瓜靶斑病菌、黄瓜枯萎病菌、黄瓜灰霉病菌、茄子褐纹病菌、西葫芦蔓枯病菌具有良好抑菌作用。
附图说明
图1为贝莱斯芽孢杆菌复配壳寡糖发酵菌剂对不同植物病原菌的抑菌效果图；
图2为贝莱斯芽孢杆菌复配壳寡糖发酵菌剂对番茄颈腐根腐病防治效果图；
图3为基于16S rDNA基因序列构建菌株BF017002的系统发育树图；
图4为gyrA基因序列构建菌株BF017002的系统发育树图。
具体实施方式
结合附图和实施例说明本发明的具体实施方式，以下实施例只是用来详细说明本发明，并不以任何方式限制本发明的范围。
实施例中涉及的仪器设备如无特殊说明，均为常规仪器设备；涉及的试剂如无特殊说明，均为市场销售的常规试剂；所涉及的试验方法如无特殊说明，均为通用常规方法。
生物材料来源：2020年8月12日在山东省寿光市大棚内采集番茄根际土壤，利用土壤稀释平板法，吸取稀释105倍的土壤悬浮液100µL，均匀涂布在NA培养基平板上；在37℃恒温培养箱中培养48h，挑取单菌落，并进行连续划线，将菌落形态一致的单菌落菌株接种至NA斜面培养基上37℃培养48h后，分离获得贝莱斯芽孢杆菌BF017002，于4℃冰箱保存备用。贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）BF017002，于2022年07月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M20221086。
贝莱斯芽孢杆菌BF017002的鉴定：
（1）菌落形态特征和菌体形态观察
取分离菌株BF017002接种到NA培养基上，37℃培养48h，观察菌落的形态特征和生长情况；并挑取菌落进行革兰氏染色，观察菌体的大小和形态。
菌落为乳白色圆形，表面干燥，有皱褶，边缘不整齐，中部凹陷；菌体杆状，大小为（1.4-4.2）µm×（0.4-0.6）µm，产生椭圆形芽孢，革兰氏染色阳性。
（2）理化性质分析
参照《常见细菌系统鉴定手册》进行分离菌株BF017002的生理生化试验，主要包括甲基红反应、V-P试验、淀粉水解试验、吲哚反应试验、明胶液化试验和碳源利用试验。
理化性质分析结果见如下表1：
注：+为阳性，-为阴性。
（3）菌株BF017002分子生物学及系统发育分析
菌株BF017002的分子生物学分析采用16S rDNA、gyrA基因片段，PCR扩增所用引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，16S rDNA基因片段扩增引物为27F和1492R，gyrA基因片段扩增引物为42F和1066R；上述16S rDNA基因片段扩增引物27F和1492R、gyrA基因片段扩增引物42F和1066R均属于现有技术公开的通用引物，具体引用现有文献“M.Labiadh, R. Aidi, B. M’hamdi, A. Rhouma, S. Flahaut, S. Kallel. Occurrenceand functional diversity of bacteria in rhizosphere of citrus trees infestedby Tylenchulus semipenetrans in a citrus-growing area of Tunisia [J].European Journal of Plant Pathology, 2019, 155:475–488”，其中，文献中16S-F和16S-R分别对应上述的27F、1492R，文献中gyrA-42-F和gyrA-1066-R分别对应上述的42F、1066R。
以菌株BF017002的LB液体培养物为模板，分别以27F/1492R、42F/1066R为引物进行PCR扩增，获得PCR扩增产物送至华大基因科技有限公司进行序列测定，分别获得大小为1105bp和915bp的序列，测序结果进行BLAST序列同源性分析。将菌株BF017002测序结果在NCBI网站上进行序列比对，下载相关菌株的基因序列，采用MEGA 7.0软件进行序列比对，NJ（Neighbour-joining）法分别构建基于16S rDNA、gyrA基因序列的系统发育树，如图3、图4所示。
菌株BF017002的16S rDNA、gyrA基因序列经BLAST比对分析，与数据库中多个贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）菌株具有高度同源性，同源性达99%以上。分别由菌株BF017002的16S rDNA、gyrA基因序列与多个已知芽孢杆菌的16S rDNA、gyrA基因序列构建系统发育树，结果显示菌株BF017002的16S rDNA、gyrA基因序列与贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis 聚为一支。结合形态特征、生理生化分析及序列分析结果，鉴定菌株BF017002为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）。
实施例1：贝莱斯芽孢杆菌复配壳寡糖发酵菌剂的制备
（1）将保存在NA斜面培养基上的贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）BF017002在无菌条件下接种到种子培养基中，在25-35℃，转速150-200rpm振荡培养箱中培养24h，获得种子液；种子培养基配方：蛋白胨5g，牛肉浸粉10g，氯化钠5g，水1000ml，调节pH6.5-7.5；分装后，121℃灭菌20min备用；
（2）将上述制备的种子液按照5%接种量在无菌条件下接种至发酵培养中，在25-35℃，转速150-200rpm条件下发酵培养48-72h，获得初始发酵菌剂；发酵培养基配方：蛋白胨40g，红糖30g，氯化钠1g，硫酸镁1g，磷酸二氢钾1g，水1000ml，调节pH7-8；分装后，121℃灭菌20min备用。
（3）无菌条件下，在初始发酵菌剂中加入0.1%-0.3%壳寡糖，于25-35℃，转速150-200rpm继续振荡培养3-5d，即获得贝莱斯芽孢杆菌复配壳寡糖发酵菌剂。
实施例2：发酵时间对复合发酵菌剂中贝莱斯芽孢杆菌菌体及芽孢数量影响的试验
采用稀释平板涂布法测定发酵菌剂中菌体和芽孢数量。
（1）按实施例1中（1）、（2）步骤制备初始发酵菌剂，在复配壳寡糖后1-7d，每天取1ml复合发酵菌剂依次稀释104、105、106、107倍，取100µl稀释至107倍的菌液均匀涂布到NA培养基平板上，在28℃培养箱中培养24h，重复5次，统计平板上的菌落数量，计算发酵菌剂中的菌体浓度。
（2）按实施例1中（1）、（2）步骤制备初始发酵菌剂，在复配壳寡糖后1-7d，每天取5ml复合发酵菌剂在80℃水浴锅中水浴处理20min，冷却后取1ml菌剂依次稀释104、105、106、107倍，取100µl稀释至107倍的菌液均匀涂布到NA培养基平板上，在28℃培养箱中培养24h，重复5次，统计平板上的菌落数量，计算复合发酵菌剂中的芽孢浓度。
不同发酵时间的复合发酵菌剂中菌体和芽孢数量如表2所示。由结果可见，复配壳寡糖后发酵3d复合发酵菌剂中活菌数量超过10亿，随着发酵时间延长，复合发酵菌剂中菌体数量逐渐降低，芽孢数量增加，活菌数量整体趋于稳定，发酵3-5d为最佳发酵时间。
实施例3：贝莱斯芽孢杆菌复配壳寡糖发酵菌剂的抑菌谱试验
采用平板对峙培养法测定贝莱斯芽孢杆菌复配壳寡糖发酵菌剂对不同病原菌的抑制效果，方法如下：
（1）供试植物病原菌：番茄颈腐根腐病菌、番茄灰霉病菌、番茄叶霉病菌、番茄红粉病菌、番茄晚疫病菌、番茄灰叶斑病菌、番茄早疫病菌、黄瓜灰霉病菌、黄瓜枯萎病菌、黄瓜靶斑病菌、茄子褐纹病菌、西葫芦蔓枯病菌，由潍坊科技学院微生物实验室分离保存。
（2）供试病原菌活化好后，使用打孔器打取直径5mm菌饼，接种到PDA培养平板中心，然后采用十字交叉法在距离病原菌中心2.5-3cm处打孔，取出打孔处的培养基，每个孔内加入实施例（1）中获得复合发酵菌剂20µl，25℃培养5-7d，观察抑菌效果并测量圈直径。
（3）上述试验，每种病原菌做3次重复，以等量无菌水为对照。
统计并计算复合发酵菌剂对12种植物病原真菌的抑菌效果，结果见表3和图1。结果表明贝莱斯芽孢杆菌复配壳寡糖发酵菌剂对多种病原菌均具有较高的抑菌活性，抑菌率均高于60%，其对番茄颈腐根腐病菌的抑菌率达到80%以上。
实施例4：贝莱斯芽孢杆菌复配壳寡糖发酵菌剂对番茄颈腐根腐病防治试验
于2021年7月在潍坊科技学院培养室内进行。供试病原菌为番茄颈腐根腐病菌，由潍坊科技学院微生物实验室分离保存，对照药剂为30%吡唑醚菌酯悬浮剂（先正达公司）。
供试番茄品种为粉贝贝，种子在25℃催芽后播种在装有育苗基质的育苗盘内，置于25℃左右的温室内育苗。
待番茄苗长至3叶一心时，洗净幼苗根部后在上述孢子悬浮液中浸根20min，然后将幼苗定植于装有基质的花盆（直径15cm）中，每盆种植3棵。
接种后的番茄苗在培养室培养2d后，然后分别使用稀释10倍、稀释20倍的实施例1的复合发酵菌剂以及30%吡唑醚菌酯1500倍液进行灌根处理，以清水处理为空白对照。每个处理10盆，重复3次。接种后25d后观察发病情况并记录病级，计算病情指数和防治效果。
防治试验结果见表4和图2（A：空白对照；B：10倍复合发酵菌剂处理；C：20倍复合发酵菌剂处理；D：30%吡唑醚菌酯SC处理）。结果表明，实施例1获得复合发酵菌剂稀释10倍和20倍进行灌根处理，对番茄颈腐根腐病的防治效果达到75%以上，其中10倍复合发酵菌剂的防治效果高于30%吡唑醚菌酯，20倍复合发酵菌剂的防治效果低于30%吡唑醚菌酯。
本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员可以想到的任何变形、改进、替换均落入本发明的范围。
Claims (5)
1.一种贝莱斯芽孢杆菌复配壳寡糖发酵菌剂，其特征在于，包括贝莱斯芽孢杆菌剂和壳寡糖，所述贝莱斯芽孢杆菌剂由贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）BF017002制成，贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）BF017002于2022年07月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M20221086；
所述贝莱斯芽孢杆菌剂由以下步骤制备而成：
取适量保存在NA固体培养基上的贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）BF017002菌种接种到种子培养基中，在振荡培养箱中振荡培养，获得种子液；
将获得的种子液接种到发酵培养基中，在振荡培养箱中培养，获得贝莱斯芽孢杆菌剂；
所述壳寡糖的添加质量为贝莱斯芽孢杆菌剂质量的0.1%-0.3%；
所述贝莱斯芽孢杆菌复配壳寡糖发酵菌剂通过如下方法制备而成：在无菌条件下将壳寡糖加入贝莱斯芽孢杆菌剂，于25-35℃，转速150-200rpm的振荡培养箱中培养3-5d，即得。
2.根据权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌复配壳寡糖发酵菌剂，其特征在于，所述种子培养基中在转速150-200rpm的振荡培养箱中振荡培养24h，培养温度25-35℃。
3.根据权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌复配壳寡糖发酵菌剂，其特征在于，所述种子液接种到发酵培养基中的接种量为5%。
4.根据权利要求3所述的贝莱斯芽孢杆菌复配壳寡糖发酵菌剂，其特征在于，所述发酵培养基在转速为转速150-200rpm的振荡培养箱中培养48-72h，培养温度25-35℃。
5.如权利要求1-4任一所述的贝莱斯芽孢杆菌复配壳寡糖发酵菌剂在治疗番茄颈腐根腐病中的应用。
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| CN116042481A (zh) | 2023-05-02 |
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