CN114958665B - 一株防治瓜类细菌性果斑病的沙福芽孢杆菌s21及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一株防治瓜类细菌性果斑病的沙福芽孢杆菌S21及其应用。所述沙福芽孢杆菌为沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)S21，保藏编号为CCTCCM2022467。本发明沙福芽孢杆菌S21应用于防治瓜类细菌性果斑病，优于现有芽孢杆菌类产品，可较好地提高瓜类对西瓜噬酸菌Acidovoraxcitrulli的抗侵染能力，而且还可以同时抑制荔枝霜疫霉病菌Peronophythora litchii。
Description
技术领域
本发明涉及生防菌剂领域，特别涉及一株防治瓜类细菌性果斑病的沙福芽孢杆菌S21及其应用。
背景技术
西瓜噬酸菌(Acidovorax citrulli)引起的瓜类细菌性果斑病，常见于西瓜(Citrulluslanatus)、甜瓜、厚皮甜瓜(Cucuumis melo var.cantalupensis，包括哈密瓜，伽师瓜)、南瓜(cucurbita pepo)、黄瓜(Cucumis sativus L.)、西葫芦(CuCurbita pepo)、蜜瓜(Cucuumis melo var..inodorus)和苦瓜等。发病后容易导致大量减产，商品瓜得率低，损失惨重。
目前已报道的防治瓜类细菌性果斑病的芽孢杆菌类产品的防效欠佳。如武芳等报道的用于防治瓜类细菌性果斑病的芽孢杆菌类产品“蔬得康”的防效只有40.8％，李乐书等报道的枯草芽孢杆菌TS86的防效只有67-69％。
发明内容
鉴于此，本发明提出一株沙福芽孢杆菌S21及其应用，应用于防治瓜类细菌性果斑病，防效优于现有芽孢杆菌类产品。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种沙福芽孢杆菌，所述沙福芽孢杆菌为沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)S21，保藏编号为CCTCC NO:M 2022467。
一种含有本发明所述的沙福芽孢杆菌的菌液。
进一步的，所述菌液由菌株沙福芽孢杆菌S21接种至牛肉膏蛋白胨液体培养基中，经培养制得。
更进一步的，所述菌液的制备方法包括以下步骤：
(1)将菌株沙福芽孢杆菌S21挑取单个菌落，接种至80-120mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在26-30℃、160-200rpm条件下振荡培养10-15小时，得种子菌液；
(2)将步骤(1)制得的种子菌液按1.8-2.2％(v/v)的量接种至牛肉膏蛋白胨液体培养基，在26-30℃、160-200rpm条件下振荡培养45-50小时，得到目标菌剂。
优选地，所述菌剂的制备方法包括以下步骤：
(1)将菌株沙福芽孢杆菌S21挑取单个菌落，接种至100mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，28℃下振荡培养12小时，得种子菌液；
(2)将步骤(1)制得的种子菌液按2％(v/v)的量接种至牛肉膏蛋白胨液体培养基，在28℃、180rpm条件下振荡培养48小时，得到目标菌液。
将上述沙福芽孢杆菌及其菌液应用于防治瓜类细菌性果斑病，尤其用于防治哈密瓜的瓜类细菌性果斑病。
进一步的，采用沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)S21浓度为(0.8-1.2)×108cfu/mL的菌液进行喷施。
进一步的，将所述菌液喷施于叶片。
进一步的，所述叶片为哈密瓜苗叶片。
沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)S21应用于抑制西瓜噬酸菌Acidovoraxcitrulli或/和荔枝霜疫霉病菌Peronophythora litchii。
沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)S21应用于制备西瓜噬酸菌Acidovoraxcitrulli或/和荔枝霜疫霉病菌Peronophythora litchii的抑制剂。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)S21，保藏编号为CCTCC NO:M2022467。本发明沙福芽孢杆菌S21应用于防治瓜类细菌性果斑病，其防效优于现有沙福芽孢杆菌产品，可较好地提高瓜类对西瓜噬酸菌Acidovorax citrulli的抗侵染能力，而且还可以同时抑制荔枝霜疫霉病菌Peronophythora litchii，可应用于制备同时抑制西瓜噬酸菌Acidovorax citrulli和荔枝霜疫霉病菌Peronophythora litchii的抑制剂，进一步提高沙福芽孢杆菌S21应用价值。
附图说明
图1为本发明沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)S21菌落照片。
图2为本发明沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)S21菌体显微图。
具体实施方式
为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明提供的沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)S21由海南大学植物病害生防研究团队分离获得，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏中心地址为中国湖北省武汉市武昌区八一路299号，保藏编号为：CCTCC NO:M 2022467，保藏日期为2022年4月25日。
实施例1-沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)S21的分离与筛选
采用平板稀释法进行分离：称取5g土样，加入45mL无菌水中，振荡培养30min，静置5min后，吸取100μL的土壤悬浮液于900μL的无菌水中，依次进行梯度稀释(102、103、104)，分别吸取稀释倍数为102、103和104的土样悬浮液100μL到牛肉膏平板中，用无菌涂布棒涂布，28℃恒温培养2天，挑取形态、大小、颜色不同的菌落多次纯化后保藏备用。
上述土样采集自海南省乐东县佛罗镇哈密瓜大棚的根际土壤，用密封袋密封后于4℃保存，48h内对土壤分离。
沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)S21生物学特性：杆状、产芽孢、G+，好氧，接触酶、氧化酶、明胶液化、淀粉水解、MR和V-P试验等生理生化测定结果均为阳性，可在2％-10％的NaCl培养液中生长。
实施例2-沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)S21生防菌液的制备方法
1.种子菌液制备
将菌株沙福芽孢杆菌S21挑取单个菌落，接种至100mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中(配方如下)，28℃下振荡(180rpm)培养12小时，得种子菌液。
牛肉膏蛋白胨培养基配方：蛋白胨5g，酵母提取物1g，牛肉浸膏3g，蔗糖15g，水1000mL，pH 7.0，灭菌(121.3℃、1kg/cm2、20分钟)
2.菌体大量发酵
将制备好的种子菌液按2％(v/v)的量接种至牛肉膏、蛋白胨液体培养基中(配方同种子培养基)，28℃、振荡(180rpm)培养48小时，获得菌液，即为沙福芽孢杆菌(Bacillussafensis)S21菌液，可直接用于瓜类细菌性果斑病的防治。
实施例3-沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)S21的平板拮抗试验
1.1沙福芽孢杆菌S21对西瓜噬酸菌Acidovorax citrulli的拮抗：采用对峙平板法测定。将1mL西瓜噬酸菌Acidovorax citrulli菌液加到溶化好的约45℃的牛肉膏蛋白胨培养基中，迅速混匀后倒平板，冷却凝固后用无菌接种针点接沙福芽孢杆菌S21在平板上，重复3点，点与点的距离相隔2cm。28℃恒温培养2天，观察沙福芽孢杆菌S21周围有无抑菌圈，用十字交叉法量取抑菌圈大小，取平均值。
1.2沙福芽孢杆菌S21对荔枝霜疫霉病菌Peronophythora litchii的拮抗采用对峙平板法测定。将培养好的荔枝霜疫霉病菌用无菌打孔器打成0.5cm的菌饼，将1块菌饼置于PDA(马铃薯、葡萄糖、琼脂)平板中间，在距菌饼1.5cm的地方点接沙福芽孢杆菌S21，接4个点每个平板。28℃恒温培养6天，测量抑菌带的宽度，取4个数据的平均值。
2.拮抗作用测定结果
沙福芽孢杆菌S21对西瓜噬酸菌Acidovorax citrulli的拮抗：抑菌圈直径平均为16.32±0.1mm。沙福芽孢杆菌S21对荔枝霜疫霉病菌Peronophythora litchii的拮抗：抑菌带宽度平均为15±0.1mm。
实施例4-沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)S21的防病试验
1.哈密瓜苗准备
将哈密瓜西州蜜25号的种子用水浸泡24小时，将浸泡好的种子用双层湿纱布包裹，保湿催芽。待种子发芽后，将出芽种子播种于营养土中，每天浇水，长至5片叶备用。
2.防病试验
将大量发酵获得的S21菌液稀释至浓度为1×108cfu/mL备用。实验分2组：第1组先将浓度为1×108cfu/mL的S21菌液喷雾于哈密瓜苗叶片正反面，以喷湿叶片为止，一小时后，待所喷菌液干后，再在哈密瓜叶片上喷雾接种细菌性果斑病菌(菌液浓度1×108cfu/mL)。第2组用清水代替S21，即先喷清水，一小时后再喷同样的病菌，作为对照。每天观察发病情况，第8天统计发病率和病情指数。
分级标准如下：
分0、1、2、3、4、5、6共7个等级，
0级：不发病；
1级：病叶上有零星病斑，病斑占叶面积的10％以下；
2极：病叶上有少量病斑，病斑占叶面积的11％～25％；
3级：病叶上病斑数量中等，病斑占叶面积的26％～50％；
4级：病叶上病斑数量较多，病斑占叶面积的51％～75％；
5级：病叶上有许多病斑，病斑占叶面积的76％～90％；
6级：病叶上有大量病斑，病斑占叶面积90％以上。
3试验结果
经统计，本发明沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)S21对哈密瓜苗的瓜类细菌性果斑病的防效为75.3％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种沙福芽孢杆菌，其特征在于，所述沙福芽孢杆菌为沙福芽孢杆菌(Bacillussafensis)S21，保藏编号为CCTCC NO:M 2022467。
2.一种含有权利要求1所述的沙福芽孢杆菌的菌液。
3.根据有权利要求2所述的菌液，其特征在于，所述菌液由菌株沙福芽孢杆菌S21接种至牛肉膏蛋白胨液体培养基中，经培养制得。
4.根据有权利要求2所述的菌液，其特征在于，所述菌液的制备方法包括以下步骤：
(1)将菌株沙福芽孢杆菌S21挑取单个菌落，接种至80-120mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在26-30℃、160-200rpm条件下振荡培养10-15小时，得种子菌液；
(2)将步骤(1)制得的种子菌液按1.8-2.2％(v/v)的量接种至牛肉膏蛋白胨液体培养基，在26-30℃、160-200rpm条件下振荡培养45-50小时，得到目标菌液。
5.根据有权利要求4所述的菌液，其特征在于，所述菌液的制备方法包括以下步骤：
(1)将菌株沙福芽孢杆菌S21挑取单个菌落，接种至100mL牛肉膏蛋白胨液体培养基中，在28℃、180rpm条件下振荡培养12小时，得种子菌液；
(2)将步骤(1)制得的种子菌液按2％(v/v)的量接种至牛肉膏蛋白胨液体培养基，在28℃、180rpm条件下振荡培养48小时，得到目标菌液。
6.权利要求1所述的沙福芽孢杆菌或权利要求2-4任一项所述的菌液应用于防治哈密瓜的瓜类细菌性果斑病。
7.根据权利要求6所述的沙福芽孢杆菌的应用，其特征在于，采用沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)S21浓度为(0.8-1.2)×108cfu/mL的菌液进行喷施。
8.根据权利要求7所述的沙福芽孢杆菌的应用，其特征在于，将所述菌液喷施于叶片。
9.权利要求1中所述的沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)S21应用于抑制西瓜噬酸菌Acidovorax citrulli或/和荔枝霜疫霉病菌Peronophythora litchii。
10.权利要求1中所述的沙福芽孢杆菌(Bacillus safensis)S21应用于制备西瓜噬酸菌Acidovorax citrulli或/和荔枝霜疫霉病菌Peronophythora litchii的抑制剂。
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