CN104894008A - 一株瓜类细菌性果斑病生防解淀粉芽孢杆菌菌株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一株瓜类细菌性果斑病生防解淀粉芽孢杆菌菌株及其应用，本发明获得的瓜类细菌性果斑病生防解淀粉芽孢杆菌菌株JD001的生物保藏号是CGMCC No.10421。本发明的菌株JD001为从西瓜产区的土样中分离并保藏的，其对多种植物病原细菌有较好的抑菌作用，可用于瓜类细菌性果斑病的生物防治，为瓜类细菌性果斑病的防治提供了新的微生物资源，具有很好的应用前景。

Description

一株瓜类细菌性果斑病生防解淀粉芽孢杆菌菌株及其应用

技术领域

本发明属于生物技术技术，涉及一株瓜类细菌性果斑病生防解淀粉芽孢杆菌菌株及其应用。

背景技术

瓜类细菌性果斑病属典型的种传细菌性病害,病原菌为Acidovorax citrulli。该菌可侵染多种葫芦科作物，如甜瓜、西瓜、打瓜、南瓜、黄瓜等等，人工接种也可侵染蒌叶等植物。该病害最初于20世纪60年代中期被发现，当时被美国农业部(United States Department ofAgriculture,USDA)认为是一种苗期枯萎病，该病很快发展成为美国西甜瓜产区的重要病害。1989年该病害在美国种子商业生产基地大量发生，给美国西甜瓜产业带来了毁灭性的损害。该病害在西瓜和甜瓜的各个阶段都有侵染，其中叶片和果实发病最为普遍。自1998年我国首次报道西瓜细菌性果斑病在海南省发生后，该病害在我国内蒙古、台湾、河南、吉林、广东、湖北、福建、新疆、甘肃、黑龙江、辽宁等地陆续被报道，且病害发生呈逐年上升趋势。

目前，田间防治该病害的方法主要是喷施农用硫酸链霉素和铜制剂。长期的使用该类农药，使得对环境的抗生素污染、人类健康的危害和植物病原菌抗性的产生等问题日益严重，因此，寻找到广谱、高效、低毒的生物农药已成为必然。Johnson等于1945年首次报道了枯草芽孢杆菌产生抗菌物质后，各种微生物产生的抗菌物质得到广泛的关注。芽孢杆菌是一种广泛存在于自然界中的非致病性细菌，能产生多种抗菌多肽物，能够抑制真菌和细菌。解淀粉芽孢杆菌是一种与枯草芽孢杆菌亲缘关系很近的细菌，近年来报道其自身产生的代谢物能够抑制细菌和真菌的活性。果斑病为种子带菌传播的病害，目前主要用盐酸、福尔马林等化学药剂处理种子，容易产生药害，影响种子发芽。到目前为止，尚未见有用解淀粉芽孢杆菌处理种子防治瓜类细菌性果斑病的生防菌菌株的报道。

发明内容

针对上述领域的缺陷，本发明提供了一株瓜类细菌性果斑病生防菌菌株，用于瓜类细菌性果斑病的生物防治，为瓜类细菌性果斑病的防治提供了新的微生物资源。

本发明提供的瓜类细菌性果斑病生防菌菌株JD001 CGMCC No.10421是本实验室从西瓜产区的土样中分离，对多种植物病原细菌有较好的抑菌作用，具有很好的应用前景。本研究通过生理生化特性测定和16SrDNA序列分析，对该菌株进行了鉴定。并对JD001CGMCCNo.10421对瓜类细菌性果斑病菌的防治效果进行了研究。

本发明的技术方案如下：

一株瓜类细菌性果斑病生防解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株JD001，其特征在于，其生物保藏号为：CGMCC No.10421。

所述解淀粉芽孢杆菌菌株的16SrDNA全序列如SEQ IDNo.3所示。

上述解淀粉芽孢杆菌的培养方法，其特征在于：将解淀粉芽孢杆菌接种到液体LB培养基，30℃、200r/min恒温培养24h，OD600≈0.3(10⁸cfu/mL)。

所述液体LB培养基的成分为：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L，酵母提取物(Yeast extract)5g/L，氯化钠(NaCl)5g/L。

上述的瓜类细菌性果斑病生防解淀粉芽孢杆菌株在防治瓜类细菌性果斑病中的应用。

上述的瓜类细菌性果斑病生防解淀粉芽孢杆菌株在抑制西瓜嗜酸菌(Acidovorax citrulli)中的应用。

所述应用指防治瓜类细菌性果斑病中用所述解淀粉芽孢杆菌株处理种子。

所述应用指对生长期的西瓜、甜瓜及其他葫芦科作物进行喷雾。

本发明针对瓜类细菌性果斑病菌(Acidovorax citrulli以下简称Ac)，通过室内抑菌圈法和温室活体防效测定，筛选出在室温条件下对Ac具有良好防病作用的拮抗菌株JD001，测定其16srDNA全序列见附录。应用BLAST软件和DNAMAN软件进行分析，JD001菌株的序列与芽孢杆菌属解淀粉芽孢杆菌16srDNA部分序列相同，同源性100％，并结合生理生化测定(菌株能够利用接触酶、D-葡萄糖、D-甘露醇、蔗糖；淀粉水解、明胶液化和卵磷脂降解试验阳性；不能利用柠檬酸铵、Tween80和7％NaCl；能够在2％NaCl、5％NaCl上生长)因此鉴定JD001菌株为枯草芽孢杆菌属解淀粉芽孢杆菌。该菌株的培养条件为30-35℃，NA培养基或LB培养基，pH7.0。该菌株为芽孢杆菌属(Bacillus)、解淀粉芽孢杆菌(amyloliquefaciens)，并已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏日期为2015年1月22日，保藏编号为：CGMCC No.10421。室内抑菌圈测定表明，在NA平板上能够抑制西瓜嗜酸菌(Acidovorax citrulli)的生长(图1)，温室防治实验表明防效为100％。

本发明通过室内平板抑菌圈法，获得了平板拮抗能力强的JD001菌株(抑菌抑菌圈直径24.5mm)，拮抗菌JD001菌液处理人工接种细菌性果斑病菌甜瓜种子表明，经拮抗菌菌液处理带菌种子12h促进种子根的生长，与对照相比提高5.2mm。拮抗菌JD001处理后的种子，出苗整齐，叶色浓绿且肥厚，长势好。

本发明获得的拮抗瓜类细菌性果斑病菌的生防解淀粉芽孢杆菌菌株JD001可应用与对瓜类细菌性果斑病的防治，生物学测定表明，在LB培养基上能够抑制瓜类细菌性果斑病菌(Acidovorax citrulli)的生长(图1)，人工接菌种子经拮抗菌JD001菌液处理后温室防治效果为100％(图5)。具有较好的实际应用价值。

本发明通过室内平板抑菌圈发筛选到拮抗瓜类细菌性果斑病菌株JD001，经过生理生化测定及16srDNA测定，确定该拮抗菌为芽孢杆菌属解淀粉芽孢杆菌。人工接种果斑病菌甜瓜种子经拮抗菌JD001菌液处理12h后温室防治效果为100％，并促进了根的生长。

本发明菌株JD001具有如下优点：

1)拮抗细菌JD001菌株对果斑病菌有很好的抑菌效果，平板抑菌圈直径24.5mm；

2)菌株JD001菌液处理人工接菌甜瓜种子，温室播种后防效效果达100％，植株生长健壮，叶色浓郁；

3)拮抗菌JD001具有较好的实际应用价值，为缓解乃至解决生产上使用化学药剂防治瓜类细菌性果斑病造成的抗生素污染及药害现象提供了新的微生物资源。

菌种保藏信息：

生物材料名称：JD001

菌株分类：解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏日期：2015年1月22日

保藏编号：CGMCC No.10421

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)

保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

附图说明

图1菌株JD001对Acidovorax citrulli抑菌效果；

图2菌株JD001在LB培养基上菌落形态特征；

图3菌株JD001的生理生化特征；

图4JD001的16SrDNA电泳结果；

图5拮抗菌JD001处理人工接菌种子后对果斑病防治效果；

图6拮抗菌JD001菌液处理带菌种子对种子根长的影响；

图7为JD001PCR产物序列在Genbank数据库中搜索比对的结果。

具体实施方式

提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的方法和产品，均落在本发明的保护范围之内。

菌种名称：解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)JD001，菌株分类：芽孢杆菌属、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)，保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2015年1月22日，保藏编号：CGMCC No.10421，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

本发明实验材料的来源：

生物材料：

JD001菌株来自西瓜产区的土样中分离，进行筛选并保藏到中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

试剂的来源及规格：

名称	来源	规格(瓶)
			明胶	北京化学试剂公司	500g
过氧化氢	北京化工厂	500ml
			D-葡萄糖	国药集团化学试剂有限公司	500g
D-甘露醇	北京化工厂	25g
			蔗糖	国药集团化学试剂有限公司	500g
淀粉	浙江菱湖化工试剂厂	500g
			柠檬酸铵	Sigma	500g
Tween80	中国医药公司	500ml
			NaCl	国药集团化学试剂有限公司	500g
卵磷脂	Solarbio	25g
			琼脂糖	Invitrogen	100g
胰蛋白胨	OXOID	500g
			酵母	OXOID	500g

实施例1、

1.1防治瓜类细菌性果斑病拮抗细菌JD001的鉴定

1.1.1拮抗菌的筛选

挑取果斑病菌单菌落接种于液体LB培养基(胰蛋白胨(Tryptone)10g/L,酵母提取物(Yeast extract)5g/L,氯化钠(NaCl)5g/L)，30℃、200r/min恒温培养24h，OD600≈0.3(10⁸cfu/mL)。将菌液加入培养基内(菌液与培养基的比例是1:40)，制成混菌平板。灭菌牙签挑取拮抗菌单菌落，点接在混菌平板上。30℃恒温培养，24h、49h观察抑菌效果，测量抑菌圈大小及有无。从平板抑菌效果看，JD001菌株的室内平板抑菌效果好，平均抑菌圈直径24.5mm,拮抗效果显著(表1)。

表1 JD001菌株对瓜类细菌性果斑病的抑制作用

混有(Acidovorax citrulli)的平板检测菌株JD001抑菌活性(图1)。

1.1.2拮抗菌的鉴定

用接种环挑取少量菌体，在LB培养基平板上划线，30℃培养24h后观察单菌落表面形态、菌落近圆形，边缘不规则，表面褶皱粗糙，不透明，菌落淡黄色(图2)；液体LB培养基培养静止时有明显的菌膜生成。显微镜下油镜观察菌体杆状，产芽孢，芽孢椭圆形。革兰氏染色阳性(G⁺)等。生理生化特性测定，具体方法参照《常见细菌系统鉴定手册》及《伯杰氏细菌鉴定手册》(表2和图3)。16S rDNA序列测定以细菌菌液为模板，细菌16SrDNA通用引物：上游引物(SEQ IDNo.1)

5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和下游引物(SEQ IDNo.2)

5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’。PCR扩增后，琼脂糖凝胶电泳获得16SrDNA的序列约1.5kb(图4)。华大基因公司测序。获得测序结果NCBI上进行BLAST比对分析，JD001菌株的序列与解淀粉芽孢杆菌16SrDNA部分序列相同，同源性100％)(图7)。

表2 拮抗菌JD001生理生化特征

实施例2拮抗菌JD001种子处理温室盆栽控病实验及室内促生作用。

将Aac-5菌液调至10⁸cfu/mL，以甜瓜种子1g菌液2mL比例混合，浸泡1h，在超净工作台内吹干种子。

接种果斑病菌的甜瓜种子在JD001菌液(10⁸cfu/mL)中浸泡12h，每皿50粒种子，3次重复。于28℃催芽，24h后调查种子的发芽率，48h后测定根长，以此来判断药剂处理对种子发芽的影响。将相同处理剩余的种子播种在灭过菌的土壤中，每个处理3次重复。清水作对照。出苗后1周调查，经解淀粉芽孢杆菌菌液处理后的带菌甜瓜种子出苗后均未发病，且植株叶色浓绿肥大。对照(清水)发病率84％。(表3和图5)。相对防治效果达到100％。

表3 种子处理防治效果

菌株JD001处理人工接菌甜瓜种子对种子活性的影响见表2。拮抗菌JD001处理带菌种子12h促进种子根的生长，与对照相比提高5.2mm；提高出苗整齐度，促进植株生长(表4和图6)。

表4 拮抗菌JD001菌液处理带菌种子对种子根长的影响

综上，本发明获得拮抗瓜类细菌性果斑病菌株JD001，经生理生化测定结合分子生物学方法，鉴定拮抗细菌为芽孢杆菌属解淀粉芽孢杆菌。菌株JD001具有如下特性：1)拮抗细菌JD001菌株对果斑病菌有很好的抑菌效果，平板抑菌圈直径24.5mm。2)菌株JD001菌液处理人工接菌甜瓜种子，温室播种后防效效果达100％，植株生长健壮，叶色浓郁。3)拮抗菌JD001处理带菌种子12h促进种子根的生长，与对照相比提高5.2mm。拮抗菌JD001具有较好的实际应用价值，为缓解乃至解决生产上使用化学药剂防治瓜类细菌性果斑病造成的抗生素污染及药害现象提供了新的微生物资源。

本发明实施例旨在以举例方式具体阐明本发明。试剂的浓度、温度和其他变量的值只是举例说明本发明的应用，而不构成对本发明的限制。

Claims (8)

1.一株瓜类细菌性果斑病生防解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)菌株JD001，其特征在于，其生物保藏号为：CGMCC No.10421。

2.根据权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌，其特征在于：16SrDNA全序列如SEQ ID No.3所示。

3.解淀粉芽孢杆菌的培养方法，其特征在于：将解淀粉芽孢杆菌接种到接种于液体LB培养基，30℃、200r/min恒温培养24h，OD600≈0.3(10⁸cfu/mL)。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述液体LB培养基的成分为：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L，酵母提取物(Yeast extract)5g/L，氯化钠(NaCl)5g/L。

5.权利要求1所述的瓜类细菌性果斑病生防解淀粉芽孢杆菌株在防治瓜类细菌性果斑病中的应用。

6.权利要求1所述的瓜类细菌性果斑病生防解淀粉芽孢杆菌株在抑制西瓜嗜酸菌(Acidovorax citrulli)中的应用。

7.根据权利要求5或6所述应用，其特征在于，所述应用指防治瓜类细菌性果斑病中用所述解淀粉芽孢杆菌株处理种子。

8.根据权利要求5或6所述应用，其特征在于，所述应用指对生长期的西瓜、甜瓜及其他葫芦科作物进行喷雾。