CN111808785B - 红花龙胆内生贝莱斯芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

红花龙胆内生贝莱斯芽孢杆菌及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111808785B
CN111808785B CN202010795634.6A CN202010795634A CN111808785B CN 111808785 B CN111808785 B CN 111808785B CN 202010795634 A CN202010795634 A CN 202010795634A CN 111808785 B CN111808785 B CN 111808785B
Authority
CN
China
Prior art keywords
strain
bacillus
mango
pathogenic bacteria
growth
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010795634.6A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111808785A (zh
Inventor
张晓勇
杨友联
罗凯
李树江
严凯
周雪林
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Liupanshui Normal University
Original Assignee
Liupanshui Normal University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Liupanshui Normal University filed Critical Liupanshui Normal University
Priority to CN202010795634.6A priority Critical patent/CN111808785B/zh
Publication of CN111808785A publication Critical patent/CN111808785A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111808785B publication Critical patent/CN111808785B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/07—Bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • A01N63/22—Bacillus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23B—PRESERVING, e.g. BY CANNING, MEAT, FISH, EGGS, FRUIT, VEGETABLES, EDIBLE SEEDS; CHEMICAL RIPENING OF FRUIT OR VEGETABLES; THE PRESERVED, RIPENED, OR CANNED PRODUCTS
    • A23B7/00—Preservation or chemical ripening of fruit or vegetables
    • A23B7/14—Preserving or ripening with chemicals not covered by groups A23B7/08 or A23B7/10
    • A23B7/153—Preserving or ripening with chemicals not covered by groups A23B7/08 or A23B7/10 in the form of liquids or solids
    • A23B7/154—Organic compounds; Microorganisms; Enzymes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23B—PRESERVING, e.g. BY CANNING, MEAT, FISH, EGGS, FRUIT, VEGETABLES, EDIBLE SEEDS; CHEMICAL RIPENING OF FRUIT OR VEGETABLES; THE PRESERVED, RIPENED, OR CANNED PRODUCTS
    • A23B7/00—Preservation or chemical ripening of fruit or vegetables
    • A23B7/14—Preserving or ripening with chemicals not covered by groups A23B7/08 or A23B7/10
    • A23B7/153—Preserving or ripening with chemicals not covered by groups A23B7/08 or A23B7/10 in the form of liquids or solids
    • A23B7/154—Organic compounds; Microorganisms; Enzymes
    • A23B7/155—Microorganisms; Enzymes; Antibiotics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23B—PRESERVING, e.g. BY CANNING, MEAT, FISH, EGGS, FRUIT, VEGETABLES, EDIBLE SEEDS; CHEMICAL RIPENING OF FRUIT OR VEGETABLES; THE PRESERVED, RIPENED, OR CANNED PRODUCTS
    • A23B7/00—Preservation or chemical ripening of fruit or vegetables
    • A23B7/16—Coating with a protective layer; Compositions or apparatus therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A23—FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23V—INDEXING SCHEME RELATING TO FOODS, FOODSTUFFS OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES AND LACTIC OR PROPIONIC ACID BACTERIA USED IN FOODSTUFFS OR FOOD PREPARATION
    • A23V2002/00—Food compositions, function of food ingredients or processes for food or foodstuffs

Abstract

本发明公开了红花龙胆内生贝莱斯芽孢杆菌及其应用，具体为1株分离自红花龙胆(Gentianarhodantha)茎秆的内生贝莱斯芽孢杆菌菌株SB023(Bacillus velezensisSB023)；该菌株对芒果炭疽病病原菌菌丝生长和孢子萌发都具有显著抑制作用，并能高效抑制病原菌对果实的浸染，达到良好的防治效果。本发明提供的生防菌株安全、绿色、环保、高效，可为仓储期间芒果炭疽病的生物防治提供新的途径。

Description

红花龙胆内生贝莱斯芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一株红花龙胆内生贝莱斯芽孢杆菌SB023及其应用。
背景技术
炭疽病是芒果采收后仓储期间发病最严重的病害之一，发病果实初期形成黑褐色圆形病斑，扩大后呈圆形或不规则形，黑色，中间干瘪凹陷，严重影响果实外观，商品价值降低，常造成较大的经济损失。芒果属热带水果，不宜长期冷藏，在常温贮藏期间如果实表面、容器或贮藏环境消毒不彻底，极易爆发炭疽病。芒果炭疽病主要由亚洲炭疽菌(Colletotrichum.asianum)、胶孢炭疽菌(C.gloeosporioides)和尖孢炭疽菌(C.acutatum)等几种病原菌引起(杨波.海南芒果采后真菌病害调查及病原鉴定[D].海口:海南大学,2013；杨友联,刘永翔,刘作易.水果采后炭疽病病原鉴定[J].西南农业学报,2014,27(03):1114-1123.)，但以胶孢炭疽菌为主。
为了防治芒果采后炭疽病的发生，生产上主要在保鲜剂或熏蒸剂中添加化学杀菌剂，但长期使用不仅会导致很多炭疽病菌产生抗药性而使防治难度加大，还容易造成环境污染，威胁人体健康。因此，研制绿色、安全、高效的芒果炭疽病微生物生防制剂已势在必行。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一株红花龙胆内生贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)SB023；本发明的目的之二在于提供所述红花龙胆内生贝莱斯芽孢杆菌SB023在制备抑制病原菌的药物中的应用；本发明的目的之三在于提供所述红花龙胆内生贝莱斯芽孢杆菌SB023在制备芒果保鲜剂防治芒果炭疽病中的应用。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1、红花龙胆内生贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)SB023，贝莱斯芽孢杆菌SB023保藏于中国普通微生物保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.20047。
优选的，所述贝莱斯芽孢杆菌SB023自红花龙胆(Gentiana rhodantha Franch.exHemsl.)茎秆内分离获得。
优选的，所述贝莱斯芽孢杆菌SB023呈长杆状，大小0.46～0.63×1.4～3.3μm，革兰氏阳性，内生式芽孢，周生鞭毛。
2、所述红花龙胆内生贝莱斯芽孢杆菌SB023在制备抗刺盘孢属、核盘菌属或葡萄座腔菌属病原菌的药物中的应用。
优选的，所述病原菌为炭疽病菌。本发明中炭疽病菌可以为辣椒炭疽病菌(C.karstii)、菜豆炭疽病菌(C.lindemuthianum)或芒果炭疽病病原菌。
优选的，所述抑制胶孢炭疽菌为抑制菌丝生长、孢子萌发率和孢子芽管生长。
3、所述红花龙胆内生贝莱斯芽孢杆菌SB023在制备芒果保鲜涂膜剂防治芒果炭疽病中的应用。
优选的，所述芒果保鲜涂膜剂含有质量分数为10％的贝莱斯芽孢杆菌SB023菌悬液或发酵7天的无菌过滤液。
优选的，所述芒果保鲜涂膜剂含有质量分数为0.1％的吐温和质量分数为2％的海藻酸钠。
优选的，所述贝莱斯芽孢杆菌SB023菌悬液为贝莱斯芽孢杆菌SB023的发酵液稀释至OD600为0.7。
本发明的有益效果在于：本发明筛选出的贝莱斯芽孢杆菌SB023菌株，该菌株对刺盘孢属、核盘菌属或葡萄座腔菌属病原菌具有很强的抑制作用，其发酵液也可强烈抑制胶孢炭疽菌菌丝生长、孢子萌发及芽管伸长。本发明通过将10％的无菌发酵液掺入涂膜剂中处理芒果果实，可加速果实伤口愈合，抑制芒果炭疽菌的侵入，达到了高效防治的目的；且菌株SB023处理芒果伤口后对芒果无致病性，安全性较高，因此可以用于制备芒果保鲜剂。
本发明筛选出的贝莱斯芽孢杆菌SB023菌株培养简单，易于大批量生产，在芒果及其他含刺盘孢属、核盘菌属或葡萄座腔菌属水果保鲜中使用也非常方便，为芒果及其他水果仓储性炭疽病绿色防控提供新的技术。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为菌株SB023在NB培养基上的菌落及菌体形态特征；
图2为基于SB023菌株16S rDNA序列构建的NJ系统发育树；
图3为菌株SB023对芒果炭疽病菌拮抗效果；
图4为菌株SB023发酵液对芒果炭疽病菌菌丝生长的影响；
图5为菌株SB023对仓储期间芒果炭疽病的防治效果；
图6为不同pH值和培养温度对菌株SB023生长及抑菌活性的影响；
图7为菌株SB023对多种病原菌生长的抑制效果。
菌种保藏
本发明中贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)SB023是从红花龙胆(G.rhodantha)健康茎秆内分离、平板划线法进行纯化得到；送中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.20047，地址位于中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为2020年6月8日，分类命名为贝莱斯芽孢杆菌Bacillusvelezensis SB023。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
本发明中，芒果炭疽病病原菌为胶孢炭疽菌(C.gloeosporioides)，由杨友联教授提供，所有病原菌菌株均经过形态及多基因(ACT,CAL,CHS-1,TUB2,ITS和GPDH)鉴定，鉴定结果已公开发表(杨友联,刘永翔,刘作易.水果采后炭疽病病原鉴定[J].西南农业学报,2014,27(03):1114-1123)。供试菌株现存于六盘水师范学院微生物学实验室。
实施例1、红花龙胆内生贝莱斯芽孢杆菌SB023菌株的分离、鉴定
采用组织块分离法，从红花龙胆(G.rhodantha)健康茎秆内分离、平板划线法进行纯化得到贝莱斯芽孢杆菌SB023；贝莱斯芽孢杆菌SB023形态特征如下：贝莱斯芽孢杆菌SB023可在NB培养基和PDA培养基上生长，32℃下培养48h的菌落形态如图1所示。在NB培养基上的菌落较小，0.5～2mm，透明至白色、表面湿润，有褶皱、边缘不整齐；在PDA平板上生长迅速，3～12mm，油煎蛋状，表面褶皱隆起，边缘不整齐。通过染色观察，该菌株长杆状，大小0.46-0.63×1.4-3.3μm(
Figure BDA0002625506340000032
n＝30)，革兰氏阳性，内生式芽孢，周生鞭毛。
实施例2、贝莱斯芽孢杆菌SB023生理生化特征
参照《伯杰氏细菌鉴定手册》提供的方法配制不同培养基对SB023菌株进行生理生化鉴定，鉴定结果如表1所示。从常规生理生化指标来看是枯草芽孢杆菌近缘种。该菌株卵磷脂水解呈阳性，《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠,蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京:科学出版社,2001)中报道了枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和解淀粉芽孢杆菌B.amyloliquefaciens不能水解卵磷脂，故初步将菌株SB023鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(B.velezensis)。
表1、B.velezensisSB023菌株生理生化特征
Figure BDA0002625506340000031
Figure BDA0002625506340000041
注：+表示阳性；-表示阴性。
实施例3、贝莱斯芽孢杆菌SB023分子生物学鉴定
采用贝莱斯芽孢杆菌SB023的DNA为模板，利用细菌16S通用引物进行PCR扩增，扩增引物为：
27F：5’-caggcctaacacatgcaagtc-3(SEQ ID NO.1)；
1492R：5’-gggcggwgtgtacaaggc-3(SEQ ID NO.2)；
PCR反应体系为20μL，2×PCR Mix 10μL，上、下游引物各0.5μL，模板DNA1μL，ddH2O8μL；PCR反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸90s，30个循环；72℃延伸7min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后送北京擎科生物技术有限公司进行纯化和测序。所得DNA序列已提交至GenBank，序列号：MT509797。
将序列输入GenBank中的BLAST中进行同源性比对，下载相关序列后以Bacillusaltitudinis41KF2b菌株作为外围群，在MEGA X软件中选用Neighbor-Joining法构建系统发育树。进化树见图2。菌株SB023与贝莱斯芽孢杆菌B.velezensis、解淀粉芽孢杆菌B.amyloliquefaciens和暹罗芽孢杆菌B.siamensis以96％的高支持率聚为一枝，但B.amyloliquefaciens和B.siamensis独立于B.velezensis分别独立聚为一支，且表现出显著的支长差异，而SB023与B.velezensis无显著支长差异，结合形态特征、生理生化指标及16S rDNA序列分析，将SB023鉴定为贝莱斯芽孢杆菌，菌株全称为Bacillus velezensisSB023。
实施例4、菌株B.velezensisSB023对芒果炭疽病菌拮抗效果测试
采用平板对峙方法测定菌株B.velezensisSB023对胶孢炭疽菌(C.gloeosporioides)。所述菌株活化采用NB平板进行活化，菌株悬液制备方法：用接种环取少量菌落接种于100mL牛肉膏蛋白胨液体培养基(NB)中，32℃、180r/min下振荡培养3d，再用无菌水将菌液稀释至106CFU/mL即得菌悬液。用6mm灭菌打孔器分别取炭疽病菌菌落边缘菌饼接种于9cm PDA平板中央，再在距离培养皿边1cm、沿着边缘均匀铺设4块6mm双重灭菌滤纸圆片分别在前3块滤纸上滴加5μL上述SB023菌悬液，第4块滴加5μL灭菌水作为对照，试验设置3次重复。置于26℃中培养，待对照一侧菌丝长满培养皿时记录抑菌效果。
Figure BDA0002625506340000051
抑菌效果如图3所示，B.velezensisSB023对胶孢炭疽菌菌丝生长抑菌率为71％，抑菌带平均宽度达到18.5mm，抑菌效果良好。
实施例5、菌株SB023发酵液对胶孢炭疽菌菌丝生长的影响
(1)用接种环取少量SB023菌体接种于牛肉膏蛋白胨培养液中，32℃、180r/min下振荡培养48h作为种子液。
(2)取种子液100μL接种于100mL牛肉膏蛋白胨培养液中，32℃、180r/min下振荡培养7d后10000r/min离心10min取上清液，再用0.22μm无菌滤膜过滤得无菌发酵液。在冷却至50℃左右的PDA培养基中分别加入20％、15％、10％、5％、2.5％(V/V)的SB023无菌发酵滤液，以空白PDA为对照，充分混匀后倒成9cm平板。
(3)打取活化的芒果炭疽病菌菌落边缘6mm小菌饼接种于含不同浓度无菌发酵滤液的平板正中央，26℃下培养，待对照0％处理长满平板后，用游标卡尺以十字交叉法测量各个处理菌落的直径(mm)，三次重复并计算菌丝生长抑制率。
Figure BDA0002625506340000052
菌株SB023发酵液对芒果炭疽病菌菌丝生长的影响如图4和表2所示。随着菌株SB023无菌发酵液添加量的增大，病原菌菌落显著逐渐减小。当发酵液添加量达到5％时，即超过芒果炭疽病病原菌抑制中浓度；当添加量为10％、15％和20％时其菌丝生长抑制率分别达到72.78％、87.22％和92.11％；表明SB023菌株发酵液可高效抑制芒果炭疽病菌菌丝生长。
实施例6、菌株SB023发酵液对胶孢炭疽菌孢子萌发的影响
(1)参照实施例5制得SB023菌株7d无菌发酵液及不同浓度梯度的平板。
(2)刮取胶孢炭疽菌平板上形成的黄色孢子堆，用无菌水稀释为106CFU/mL的孢子悬浮液备用。
(3)取100μL的106CFU/mL胶孢炭疽菌孢子悬浮液均匀涂布于上述不同浓度无菌发酵滤液的平板中，置于26℃下培养2d后在10×10cm的低倍显微镜下观察孢子萌发情况，统计各个视野中孢子总数和未萌发的孢子数，每个处理统计5个视野。
Figure BDA0002625506340000053
(4)如孢子可萌发，测量芽管的长度(μm)，重复测量20次，孢子芽管生长率(μm/d)＝芽管的长度(μm)/天数(d)。SB023菌株的发酵液对胶孢炭疽菌孢子萌发抑制作用达到显著水平(表2)，5.0％发酵液处理下病原菌孢子萌发率仅10％，萌发抑制率达到64.55％；当发酵液添加量达到10％以上时病原菌孢子失去萌发能力，芽管未能伸长即形成水泡状畸形结构。
表2、菌株SB023发酵液对胶孢炭疽菌菌丝生长及孢子萌发的影响
Figure BDA0002625506340000061
实施例7、菌株SB023对仓储期间芒果炭疽病的防治效果
(1)参照实施例5制得SB023菌株7d的菌悬液及无菌发酵液，菌悬液用无菌水稀释至OD600为0.7。
(2)刮取胶孢炭疽菌平板上形成的黄色孢子堆，用无菌水稀释为106CFU/mL的孢子悬浮液备用。
(3)选取健康无病虫害、无损伤、大小和成熟度相似的新鲜鹰嘴芒，先用75％酒精擦拭表面，再浸入2％NaClO溶液中2min后用无菌水漂洗5次，捞出在超净工作台下用无菌风吹干表面水珠待用。
(4)用灼烧冷却的解剖刀尖在芒果一侧表面打取约2mm大小的微创口。
(5)制备3种果实涂膜剂，各组分质量百分比如下：
涂膜剂A1:0.1％土温-80、2％海藻酸钠、10％SB023无菌发酵滤液；
涂膜剂A2:0.1％土温-80、2％海藻酸钠、10％SB023菌悬液；
涂膜剂A3:0.1％土温-80、2％海藻酸钠；
溶剂为水。
(6)设计6种处理来验证菌株SB023对仓储期间芒果炭疽病的防治效果：
处理1：施用涂膜剂A1，无菌风吹干后接种病原菌孢子悬浮液20μL；
处理2：施用涂膜剂A2，无菌风吹干后接种病原菌孢子悬浮液20μL；
处理3：施用涂膜剂A2，无菌风吹干；
处理4：施用涂膜剂A3，无菌风吹干后接种病原菌孢子悬浮液20μL；
处理5：接种病原菌孢子悬浮液20μL，1d后施用涂膜剂A2并吹干；
对照6(对照)：接种病原菌孢子悬浮液20μL。
以上处理设置3次重复，置于20℃培养箱中贮藏10d后统计果实发病情况。
Figure BDA0002625506340000071
研究表明，菌株SB023的无菌发酵液和菌悬液均对仓储期间芒果炭疽病有非常好的预防效果(如表3、图5)，在0.1％土温-80、2％海藻酸钠的混合涂膜剂中添加SB023菌株的10％无菌发酵滤液和菌悬液都可100％阻止病原菌经伤口侵入，如涂膜剂中不添加菌株SB023的无菌发酵滤液或菌悬液(处理4)则起不到任何的保护作用，其形成的病斑面积与对照差异不显著，无抑菌效果。
先接种病原菌，1d后再施用含10％SB023菌悬液的涂膜剂处理(处理5)未能有效阻止病原菌在果实伤口中的扩展，抑制率低于50％，仅可延缓病斑扩展速度，说明SB023菌株对芒果炭疽病治疗效果不佳，在运用中应重在预防。
菌株SB023菌悬液单独处理伤口(处理3)未形成病斑，也未导致果肉腐烂，说明该菌株对芒果果实不具有致病性，其安全性可靠。
表3、菌株SB023对仓储期间芒果炭疽病的防治效果
Figure BDA0002625506340000072
实施例7、菌株SB023的最佳培养条件及产毒条件研究
参照实例5制得菌株SB023的种子液；
参照实例5制得芒果炭疽病菌的孢子悬浮液；
设计不同培养条件研究菌株SB023最佳生长条件：
(1)pH值：以KMB液体培养基(葡萄糖20g，蛋白胨20g，硫酸镁1.5g，磷酸氢二钾1.5g，蒸馏水1000g)为基础液体培养基，用1mol/L的HCl和NaOH调节培养液pH值为4、5、6、7、8、9和10等7个梯度。
(2)温度：以KMB液体培养基(葡萄糖20g，蛋白胨20g，硫酸镁1.5g，磷酸氢二钾1.5g，蒸馏水1000g)为基础液体培养基，接种后放置于15、20、26、28、30、32、38、40和45等几个温度梯度中。
(3)碳源：以KMB液体培养基(葡萄糖20g，蛋白胨20g，硫酸镁1.5g，磷酸氢二钾1.5g，蒸馏水1000g)为基础，将其中的葡萄糖等质量分别替换为甘油、蔗糖、淀粉、麦芽糖和甘露醇配制不同碳源的液体培养基。
(4)氮源：以KMB液体培养基(葡萄糖20g，蛋白胨20g，硫酸镁1.5g，磷酸氢二钾1.5g，蒸馏水1000g)为基础，将其中的蛋白胨等质量分别替换为硝酸钾、硝酸钠、酵母粉、硫酸铵和尿素配制不同氮源的液体培养基。
上述培养基配制好后装入300mL三角瓶中，每瓶100mL，灭菌冷却后均接种100ml的SB023菌株种子液，各个处理均重复3次，在32℃、180r/min的条件下培养72h后取少量菌悬液用分光光度计在600nm波长下测定其吸光值(OD600)。
取各个处理少量菌悬液过0.22μm的微孔滤膜制备无菌发酵滤液。
吸取100μL芒果炭疽病菌孢子悬浮液均匀涂布在PDA培养基上，再在涂布好的平板上均匀放置3个牛津杯；吸取100μL各个处理的无菌发酵滤液放入牛津杯中，重复3次，26℃下正置培养48h后测量各个处理牛津杯周围的抑菌圈直径(mm)。
不同pH值和培养温度对菌株SB023生长及抑菌活性的影响如图6所示。pH值和培养温度都显著影响菌株生长和抑菌活性物质积累。该菌株在pH 5-10范围内生长良好，最适pH值为7。pH值对菌株抑菌活性影响较大，pH值为7时抑菌活性显著高于其他处理。菌株在26-30℃范围内生长良好，在28-30℃培养下其抑菌活性最强。
不同碳源、氮源对菌株SB023生长及抑菌活性的影响如表4所示。最适菌体生长的成分不一定有利于抗菌物质的合成和积累。菌株SB023生长最适的碳源为麦芽糖，其次是淀粉；而麦芽糖处理下菌株抑菌活性也最强。有机氮含量高的天然氮素营养利于菌株SB023的生长及抑菌物质的积累，酵母粉中的生长量及发酵液抑菌活性均显著高于蛋白胨处理；该菌株在硝态氮、铵态氮及酰胺态氮的培养基中生长极差，发酵液中合成的抑菌物质极低，不能抑制芒果炭疽病菌的生长。
表4、不同碳源和氮源对菌株SB023生长及抑菌活性的影响
Figure BDA0002625506340000081
Figure BDA0002625506340000091
实施例8、菌株B.velezensisSB023的抗菌谱测试
采用平板对峙方法测定菌株B.velezensisSB023对辣椒炭疽病菌(C.karstii)、菜豆炭疽病菌(C.lindemuthianum)、红花龙胆菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、毛慈菇叶枯病病菌(Botryosphaeria dothidea)和山茶灰斑病病菌(Pestalotiopsisportugalica)等病原菌的抑制效果。红花龙胆菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)由本研究团队分离及鉴定，其ITS rDNA序列已提交至GenBank(Accession number MT620768)，现保存于六盘水师范学院微生物学实验室。辣椒炭疽病菌(C.karstii)、菜豆炭疽病菌(C.lindemuthianum)、毛慈菇叶枯病病菌(Botryosphaeria dothidea)和山茶灰斑病病菌(Pestalotiopsis portugalica)等几株病原菌本研究团队已公开发表(杨友联.中国贵州、云南、广西炭疽菌属真菌多基因分子系统学研究.华中农业大学，2010；李树江,杨友联.毛慈菇叶枯病病原菌多基因分子鉴定.六盘水师范学院学报,2017,29(06):20-24；张晓勇,李树江，王亮，杨友联.山茶灰斑病病原菌鉴定及防治药剂初步筛选.植物保护，2019，45(04):209-215+242.)，菌株现保藏于六盘水师范学院微生物学实验室。
所述菌株活化采用NB平板进行活化，菌株悬液制备方法：用接种环取少量菌落接种于100mL牛肉膏蛋白胨液体培养基(NB)中，32℃、180r/min下振荡培养3d，再用无菌水将菌液稀释至106CFU/mL即得菌悬液。
几种病原菌接种于PDA平板，25℃下培养活化。
用6mm灭菌打孔器分别打取几个活化的病原菌菌落边缘菌饼接种于9cmPDA平板中央，再在距离培养皿边1cm、沿着边缘均匀铺设4块6mm双重灭菌滤纸圆片分别在前3块滤纸上滴加5μL上述SB023菌悬液，第4块滴加5μL灭菌水作为对照，试验设置3次重复。置于26℃中培养，待对照一侧菌丝长满培养皿时记录抑菌效果。
Figure BDA0002625506340000092
结果如图7所示。结果显示，B.velezensisSB023对辣椒炭疽病菌、菜豆炭疽病菌、红花龙胆菌核病菌、毛慈菇叶枯病病菌和山茶灰斑病病菌抑菌率分别为71.83±0.56％、66.20±0.10％、73.99±1.14％、54.46±2.85％和55.12±0.33％，说明该菌对刺盘孢属病原菌和核盘菌的抑制效果非常理想，但对拟盘多毛孢属和葡萄座腔菌属病原菌抑制效果一般。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (7)

1.红花龙胆内生贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)SB023，其特征在于：贝莱斯芽孢杆菌SB023保藏于中国普通微生物保藏管理中心，保藏编号为CGMCC No.20047。
2.权利要求1所述红花龙胆内生贝莱斯芽孢杆菌SB023在制备抗病原菌药剂中的应用；所述病原菌为胶孢炭疽菌。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述抑制胶孢炭疽菌为抑制菌丝生长、孢子萌发率和孢子芽管生长。
4.权利要求1所述红花龙胆内生贝莱斯芽孢杆菌SB023在制备芒果保鲜涂膜剂防治芒果炭疽病中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述芒果保鲜涂膜剂含有质量分数为10％的贝莱斯芽孢杆菌SB023菌悬液或发酵7天的无菌过滤液。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述芒果保鲜涂膜剂含有质量分数为0.1％的吐温和质量分数为2％的海藻酸钠。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述贝莱斯芽孢杆菌SB023菌悬液为贝莱斯芽孢杆菌SB023的发酵液稀释至OD600为0.7。
CN202010795634.6A 2020-08-10 2020-08-10 红花龙胆内生贝莱斯芽孢杆菌及其应用 Active CN111808785B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010795634.6A CN111808785B (zh) 2020-08-10 2020-08-10 红花龙胆内生贝莱斯芽孢杆菌及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010795634.6A CN111808785B (zh) 2020-08-10 2020-08-10 红花龙胆内生贝莱斯芽孢杆菌及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111808785A CN111808785A (zh) 2020-10-23
CN111808785B true CN111808785B (zh) 2022-04-01

Family

ID=72863801

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010795634.6A Active CN111808785B (zh) 2020-08-10 2020-08-10 红花龙胆内生贝莱斯芽孢杆菌及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111808785B (zh)

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2871245A1 (en) * 2013-11-08 2015-05-13 Symborg, S.L. A bacillus subtilis strain deposited under deposit number CECT 8258 and method for protecting or treating plants
CN106011030B (zh) * 2016-07-27 2019-07-26 广西壮族自治区农业科学院微生物研究所 一种诱变菌株Bs6602v及其应用
CN106635870B (zh) * 2016-09-27 2019-09-13 安徽瑞虎肥业有限公司 芽孢杆菌及其应用
CN109266586B (zh) * 2018-10-18 2021-04-20 淮海工学院 贝莱斯芽孢杆菌bmf 03及其用途与发酵方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN111808785A (zh) 2020-10-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112175888B (zh) 贝莱斯芽孢杆菌Hsg1949及其应用
CN113717901B (zh) 一株贝莱斯芽孢杆菌及其在防治多种蔬菜病害中的应用
CN109456921B (zh) 一种多粘类芽孢杆菌、应用及微生物菌剂、粉剂和颗粒剂
CN112795496B (zh) 一株多粘类芽孢杆菌及其在防治白菜茎基腐病中的应用
CN111040976B (zh) 一株解淀粉芽孢杆菌及其应用
CN111647518A (zh) 一种贝莱斯芽孢杆菌微生物菌剂及制备方法
CN115058358B (zh) 一株耐盐芽孢杆菌及其应用
CN114854618A (zh) 一株贝莱斯芽孢杆菌sf327及其应用
CN108641989A (zh) 一株甲基营养型芽孢杆菌及其应用
CN113755389B (zh) 一种贝莱斯芽孢杆菌及其应用
CN110317747B (zh) 一种解淀粉芽孢杆菌jt68及其在防治茶炭疽病的应用
CN108220211B (zh) 一株嗜油不动杆菌nmb17及其在植物病害防治中的应用
CN110804566B (zh) 防治七叶一枝花根腐病的芽孢杆菌及其制备方法与应用
KR20080045346A (ko) 신규한 바실러스 서브틸리스 엠27 균주 및 이를유효성분으로 한 식물 균핵병 방제 방법
CN116536207A (zh) 一种萎缩芽孢杆菌wlkysy-4、生物菌剂及应用
CN116445357A (zh) 一株贝莱斯芽孢杆菌及其应用
CN116240126A (zh) 一株多功能贝莱斯芽孢杆菌sb10及其应用
CN107058183B (zh) 一种甲基营养型芽孢杆菌及其生防菌剂和应用
CN113817642B (zh) 贝莱斯芽孢杆菌yj02、其微生物制剂及应用
CN105838643B (zh) 枯草芽孢杆菌jtfm1001及其在防控玉米黄曲霉毒素污染中的应用
CN111808785B (zh) 红花龙胆内生贝莱斯芽孢杆菌及其应用
CN115851479A (zh) 一种对番茄灰霉病菌具有拮抗作用的细菌及其应用
CN114015618A (zh) 一株贝莱斯芽孢杆菌及其在植物病害防治中的应用
CN110982764A (zh) 一种防治水稻稻瘟病的特基拉芽孢杆菌s12及其应用
CN117384807B (zh) 一种蕈状芽孢杆菌hdcm2及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant