CN109266586B

CN109266586B - 贝莱斯芽孢杆菌bmf 03及其用途与发酵方法

Info

Publication number: CN109266586B
Application number: CN201811218406.1A
Authority: CN
Inventors: 暴增海; 陈茹; 李欢; 曹雪梅; 万丹丹; 吴海霞; 马桂珍
Original assignee: Huaihai Institute of Techology
Current assignee: Huaihai Institute of Techology
Priority date: 2018-10-18
Filing date: 2018-10-18
Publication date: 2021-04-20
Anticipated expiration: 2038-10-18
Also published as: CN109266586A

Abstract

本发明是一种源自海洋的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)BMF 03，其保藏号为CCTCC NO：2017374。BMF 03菌株及其无菌发酵液对植物病原真菌的具有抑制作用。BMF 03菌株的无菌发酵液可以作为有效成份制成抑细菌药物。本发明还公开了BMF 03的无菌发酵液的发酵方法。本发明采用平板对峙法、牛津杯法筛选出新的具有抑菌作用强、抑菌谱广的海洋细菌菌株贝莱斯芽孢杆菌BMF 03，同时还研究了其菌株产生抑菌物质以及产芽孢发酵培养基和摇瓶发酵条件，明确了菌株发酵液及其固态发酵物对黄瓜幼苗生长的促进作用，为菌株的应用奠定了基础。

Description

贝莱斯芽孢杆菌BMF 03及其用途与发酵方法

技术领域

本发明涉及一种海洋细菌，特别是一种贝莱斯芽孢杆菌BMF 03，本发明还涉及其用途与发酵方法。

背景技术

生物防治因其环境友好、无残留、不产生抗药性等优点越来越受到重视，保护环境、减少化学农药的使用保障食品安全等需要更多的抑菌作用强、促进作物生长的优良菌株。现有用于开发微生物农药的微生物菌株主要来源于陆源环境，源自海洋的微生物菌株的开发研究起步较晚，海洋细菌生长繁殖快、寡营养、耐盐、且代谢产物丰富，具有陆源微生物所不具有的优势，已经成为植物病害生物防治的重要微生物资源，不同学者分离得到多个具有抢抗菌作用的海洋细菌优良菌株。朱晓飞等筛选出菌株YB-3，其对水稻纹枯病菌具有强烈抗菌作用，通过形态学观察、生理生化试验、Biolog鉴定技术及16S rDNA序列分析鉴定其为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)；骆祝华等从不同海域中分离到480株海洋细菌，包括107株粪大肠杆菌和150株芽孢细菌，其中117株海洋细菌具有抑菌活性，分离自不同区域不同样品的细菌菌株，其抑菌活性有很大差别，红树林区域的生物样品的抗菌率很高；Yoo等分离了一株海洋细菌菌株PT-1，经16S rRNA序列测定、进化树分析和脂肪酸分析表明菌株PT-1为海洋单胞菌属(Marinomonas arctica)的新菌种，可产生蛋白酶。现有研究主要处于实验室筛选阶段，对于菌株的发酵及其应用较少。

因此，从海洋细菌中筛选新的抗性菌株并加以利用具有重要的意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是针对目前应用化学农药防治植物病害所出现的环境污染、有害生物产生抗药性和农产品农药残留等问题，生物农药能够弥补化学农药的不足，但生物农药种类少不能满足生产上的需要等现有技术的不足，提供一种具有较强抗菌作用具有生物农药和肥料开发应用前景的新的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)BMF 03菌株。

本发明所要解决的另一技术问题是提供了前述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)BMF 03的用途。

本发明所要解决的再一技术问题是针对海洋细菌菌株研制生物农药或肥料需要加个低廉来源广泛的培养基和简单的发酵工艺提高发酵效率的现状提供了前述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)BMF 03产芽孢及其发酵食用菌菌糠的发酵培养基及其发酵方法以及对黄瓜生长的促进作用。

本发明是一种贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)BMF 03，其特点是：其保藏号为CCTCC NO：2017374。本发明涉及的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)BMF 03菌株(以下简称BMF03菌株或者BMF03)已由申请人于2017年7月8日保藏在中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏号为CCTCC NO：M2017374。保藏单位地址为：中国武汉市武汉大学，邮编430072，电话027－68754052。

本发明所述的贝莱斯芽孢杆菌BMF 03具备以下的用途：所述的用途为BMF 03菌株对植物病原真菌的抑制用途，所述的植物病原真菌选自：苹果腐烂病菌(Valsa mali)、葡萄白腐病菌(Coniella diplodiella)、芒果炭疽病菌(Colletotrichum gloesporioides)、小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)、棉花立枯病菌(Rhizoctonia solani)、黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum)、苹果炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)、玉米弯孢霉叶斑病菌(Curvularia lunata)、蓝莓早疫病菌(Alternaria solani)、小麦纹枯病菌(Rhizoctonia cerealis)、大豆菌核病菌(Sclerotina sclerotiorum)、玉米叶枯病菌(Alternaria tenuis Nees)。

本发明所述的贝莱斯芽孢杆菌BMF 03具备以下的用途：所述的用途为BMF 03菌株的无菌发酵液对植物病原真菌的抑制用途，所述的植物病原真菌选自：小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)、苹果腐烂病菌(Valsa mali)、稻瘟病菌(Pyricularia oryzae)、小麦根腐病菌(Bipolaris sorokiniana)、斑点落叶病菌(Alternaria alternate)、黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum)、苹果炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)、草莓灰霉病菌(Botrytis cinerea)、小麦雪腐镰刀菌(Fusarium nivale)、玉米弯孢霉叶斑病菌(Curvularia lunata)、玉米小斑病菌(Bipolaris maydis)、水稻纹枯病菌(Rhizoctoniasolani)、蓝莓早疫病菌(Alternaria solani)、大豆菌核病菌(Sclerotinasclerotiorum)、玉米叶枯病菌(Alternaria tenuis Nees)。

本发明所述的贝莱斯芽孢杆菌BMF 03具备以下的用途：所述的用途为以BMF 03菌株的无菌发酵液为有效成份制成抑细菌药物的用途，所述的细菌选自：角斑病菌(Pseudomonas syringae)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、青枯病菌(Ralstoniasolanacearum)。

本发明还公开了所述的贝莱斯芽孢杆菌BMF 03的无菌发酵液的发酵方法，其特点是：将种子液按6％的接种量接种至盛有60mL发酵培养基的250mL三角瓶中，28℃、180r/min振荡培养48h，即得BMF 03菌株发酵液；将发酵液在4℃、10000r/min条件下离心20min，收集上清液，经直径为0.22μm的细菌过滤器过滤，即得无菌发酵液。

本发明所述的贝莱斯芽孢杆菌BMF 03具备以下的用途：贝莱斯芽孢杆菌BMF 03产芽孢的发酵培养方法，其特征在于：贝莱斯芽孢杆菌BMF 03的产芽孢培养基配方为：乳糖20g/L，牛肉膏25g/L；发酵条件为：摇床培养时间40h，pH 6.0，装液量为50mL/250mL，温度28℃，接种量为6％，摇床转速为160r/min。

本发明所述的贝莱斯芽孢杆菌BMF 03具备以下的用途：贝莱斯芽孢杆菌BMF 03固态发酵食用菌菌糠的方法，其特征在于：贝莱斯芽孢杆菌BMF 03菌株固态发酵培养基配方为：菌糠44.5％、玉米粉37％、豆粕18.5％、尿素0.75％、磷酸氢二钾0.2％；发酵条件为：接种量25％，发酵时间68h，料水比1∶1.5，温度37℃，pH7。

本发明所述的贝莱斯芽孢杆菌BMF 03具备以下的用途：贝莱斯芽孢杆菌BMF 03对黄瓜幼苗生长的促进用途。

以下是发明人所做的相关实验：

1材料与方法

1.1供试菌株

海洋细菌菌株：编号从1-18等18株细菌分离自自连云港海域海水、海泥以及海洋动植物等材料。

病原菌：小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)、水稻纹枯病菌(Rhizoctoniasolani)、黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporium)、葡萄白腐病菌(Coniella diplodiella)、菠菜早疫病菌(Alternaria solani)、斑点落叶病菌(Alternaria alternate)、番茄早疫病菌(Alternariasonali)、小麦根腐病菌(Bipolaris sorokinianum)、甘蓝枯萎病菌(Fusarium oxysporum)、金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus aureus)、大肠杆菌(Escherichia coli)、青枯病菌(Ralstonia solanacearum)、角斑病菌(Pseudomonassyringae)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等由淮海工学院海洋学院抗菌海洋微生物实验室保存提供。

1.2培养基

病原真菌活化和抑菌试验用培养基为PDA：马铃薯200g，琼脂20g，1000mL水。

PD：马铃薯200g，水1000mL。

病原细菌活化培养基为牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂20g，水1000mL，pH7.0-7.2。

1.3具有抑菌活性的海洋细菌的初步筛选

采用平板对峙的方法，以小麦赤霉病菌、黄瓜枯萎病菌、水稻纹枯病菌作为指示菌，测定18株海洋细菌的抑菌活性，筛选出具有较强抗菌作用的海洋细菌。

在直径9cm的平板中心接种上直径5mm的病原真菌的菌苔，在距离培养皿边缘2.5cm处对称划线接待测的18株海洋细菌菌株，以不接海洋细菌菌株作为对照。每个海洋细菌菌株接种3次为3次重复。28℃培养48h，测定不同海洋细菌菌株的抑菌宽度。选择抑菌带宽度大于25mm的海洋细菌菌株进行复筛。

1.4具有抑菌活性的海洋细菌的复筛

采用牛津杯法测定初筛抑菌带宽度大于25mm的海洋细菌菌株的无菌发酵液对小麦赤霉病菌等病原真菌的抑制作用。

将初筛中得到的抑菌带宽度大于25mm的海洋细菌菌株分别接入PDA培养基中28℃培养18h，用无菌水洗下菌苔，调整成浓度为10⁸个细胞/mL的菌悬液，作发酵用种子液。将种子液按10％的接种量接种至盛有60mL发酵培养基的250mL三角瓶中，28℃、180r/min振荡培养48h，发酵液在4℃、10000r/min条件下离心20min，收集上清液，经孔径为0.22μm的细菌过滤器过滤，即为无菌发酵液。

将直径5mm的指示真菌菌苔接在直径9cm的PDA平板中央，在距边缘2.5cm处对称放置4个牛津杯，每个牛津杯中加入不同海洋细菌菌株无菌发酵液200μL，以等量的发酵培养基为对照，每个菌株重复3次。培养3－5d，测定抑菌带宽度。比较不同海洋细菌菌株的抑菌活性，选择抑菌带宽度大于30mm的菌株作为优良菌株进行后续试验。

1.5抗菌海洋细菌优良菌株的抑菌谱测定

采用牛津杯法测定筛选出的优良海洋细菌菌株对8种病原真菌以及金黄色葡萄球菌等4种细菌的抑菌效果。

1.6优良抑菌海洋细菌菌株的种类鉴定

1.6.1菌落及菌体形态学观察及染色反应

观察海洋细菌优良菌株在不同固体培养基上的生长形态、菌落大小及其颜色，菌落个体表面、隆起程度、边缘的生长状况光泽度及透明度；

在光学显微镜下观察不同菌株细胞颜色和形态，利用ImageJ软件测定细胞大小。对菌株进行革兰氏染色、荚膜染色、芽孢染色和鞭毛染色。

1.6.2生理生化分析

海洋细菌优良菌株应用细菌微量生化管进行糖发酵试验(葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、阿拉伯糖等)、VP试验、硫化氢试验、明胶液化试验、苯丙氨酸试验、精氨酸双水解酶肉汤试验、赖氨酸脱羧酶肉汤试验和甘露醇利用试验等。

耐盐性试验：把培养18h的海洋细菌优良菌株分别接种到装60mL氯化钠浓度分别为2％、5％、7％和10％的PD液体培养基的250mL三角瓶中，28℃、180r/min振荡培养24h，采用平板菌落计数法测定不同氯化钠浓度下的菌落数。

1.6.3海洋细菌优良菌株16S rDNA序列分析

采用试剂盒法提取海洋细菌优良菌株的基因组DNA，以不同海洋细菌菌株基因组DNA为模板，用细菌16S rDNA通用引物进行PCR扩增。PCR反应体系为ddH₂O 16.7μL，模板DNA1μL，10×PCR Buffer 2.5μL，Primer 27F 1μL，Primer 1492R 1μL，2mM dNTP 2.5μL，5U/μLTaq plus 0.3μL。PCR反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性40s、53℃退火40s、72℃延伸1min30s，循环30次，最后72℃延伸5min，4℃下样品保存。用1％琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物。PCR扩增产物送上海生工生物公司测序。将测序结果与GenBank数据库中的数据进行Blast相似性分析，用Mega5软件对构建系统发育树。

结合形态学观察结果和生理生化反应，查阅伯杰氏细菌鉴定手册及其相关文献，确定抗菌作用较强的优良菌株的分类地位。

2结果与分析

2.1具有抑菌活性的海洋细菌的初步筛选结果

表1海洋细菌不同菌株对的3种病原真菌的抑菌带宽度(mm)

18株海洋细菌有15株对黄瓜枯萎病菌等3种指示菌有明显的抑制作用，其中有5个菌株的抑菌带宽度大于等于30mm，菌株编号分别为2、5、7、14、16。5个菌株对3种病原真菌的抑菌带宽度大于25mm。其中2号菌株和16号菌株的抑菌作用最强，对3种病原真菌抑菌带宽度均达到了30mm以上。

2.2具有抑菌活性的海洋细菌的复筛

根据初筛结果选取抑菌作用较强、抑菌带宽度大于25mm的10个菌株进行液体发酵，测定不同菌株无菌发酵液对小麦赤霉病菌等3种重要植物病原真菌的抑菌作用，结果见表2。

结果表明，10个海洋细菌菌株的发酵液对3种病原菌均具有明显的抑菌作用，抑菌带宽度均达到15mm以上，其中5个菌株对3种病原真菌的抑菌带宽度达到20mm以上。

16号菌株的抑菌作用最强，对三种植物病原真菌的抑菌带宽度均达到30mm以上。选择16号菌株作为优良菌株进行研究。

表2海洋细菌优良菌株无菌发酵液对3种病原真菌的抑菌带宽度(mm)

2.3抑菌海洋细菌优良菌株16号的抑菌谱测定结果

表3海洋细菌16号对多种病原菌的抑菌带宽度

测定菌16号对甘蓝枯萎病菌等7种病原真菌和青枯病菌等4种细菌的抑制作用，结果表明，菌株16号对甘蓝枯萎病菌、水稻纹枯病菌、葡萄白腐病菌和金黄色葡萄球菌4种病原菌有较强的抑制作用，抑菌带宽度大于18mm；其次是对小麦根腐病菌等7种其他病原菌也有一定的抑制作用，抑菌带宽度均小于15mm，对青枯病菌也具有一定的抑制作用，抑菌带宽度大于10mm，结果见表3。

2.4优良抑菌海洋细菌菌株的种类鉴定

2.4.1菌落形态

16号海洋细菌在牛肉膏蛋白胨和PDA培养基上的菌落形态特征见表4：

表4 16号株海洋细菌在牛肉膏蛋白胨培养基上的菌落形态特征

2.4.2菌体形态观察和染色

16号海洋细菌得革兰氏染色、鞭毛染色、荚膜染色和芽孢染色结果如表5所示。

表5 16号海洋细菌菌体形态观察及染色结果

注：“+”：有

2.4.3生理生化反应

耐盐性试验结果表明，16号对2％-7％浓度NaCl有耐受性，菌株细胞数量随盐浓度的上升而下降，浓度达10％时不能生长。结果见表6.

表6菌株16号的耐盐性测定结果(CFU/ml)

以大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和金黄色葡萄球菌为对照，测定16号菌株的生理生化特性，结果表明，菌株可利用葡萄糖、果糖、蔗糖、甘露醇，对精氨酸双水解酶肉汤、苯丙氨酸、VP和淀粉水解试验呈阳性反应；不可利用阿拉伯糖、半乳糖、麦芽糖、鼠李糖、山梨醇和肌醇。尿素酶反应呈阴性，结果如表7所示。

表7菌株16号的生理生化反应

综合菌株的菌落和菌体形态、染色反应和生理生化试验结果，查阅伯杰氏细菌鉴定手册和相关文献，认为16号菌株均属于芽孢杆菌属(Bacillus)。

3.3.4抑菌海洋细菌不同菌株16S rRNA序列分析

对16号海菌株的16S rDNA序列进行扩增，序列片段大小均在1500bp左右，符合细菌16S rDNA片段的大小。

将菌株16号的PCR产物送上海生工生物工程有限公司测序，所得序列进行Blast相似性对比，结果表明，菌株16号与Bacillus velezensis(贝莱斯芽孢杆菌)的相似性达100％，在构建的系统发育进化树中，菌株16号与贝莱斯芽孢杆菌聚为一支。

结合形态特征观察结果和生理生化试验结果，认为菌株16号为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，将16号菌株菌株号标记为BMF03，该菌株已保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏号为CCTCC NO：M2017374。

发明人针对农作物中常见的主要病原菌，采用平板对峙法、牛津杯法筛选出新的具有广谱抗性的的海洋细菌菌株贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)BMF 03，并系统研究了该菌株产芽孢和固态发酵食用菌菌糠的发酵方法和对黄瓜生长的促进作用，与现有技术相比，菌株的抑菌作用强，抑菌谱广泛，发酵培养基原料价格低廉且废物利用，发酵工艺简单，发酵效率高，表现出良好的开发利用前景，为菌株的进一步应用奠定了基础。

具体实施方式

以下进一步描述本发明的具体技术方案，以便于本领域的技术人员进一步地理解本发明，而不构成对其权利的限制。

实施例1，贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)BMF 03菌株抗菌实验：

1材料与方法

1.1试验材料

1.1.1供试菌株

贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)BMF 03菌株，由连云港海域分离得到；供试病原真菌(见表8)以及供试病原细菌(见表3)由淮海工学院海洋微生物研究室(简称本实验室)保存。

1.1.2培养基

PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000mL；

PD培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，水1000mL。

BMF 03菌株发酵培养基：蔗糖为0.25％，黄豆粕粉为1.5％，MgCl₂为0.01％，MnSO₄为0.01％。

NA培养基：蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl 5g，琼脂15g，水1000mL，pH 7.0。

NA液体培养基：蛋白胨10g，牛肉膏3g，NaCl 5g，水1000mL，pH 7.0。

1.2试验方法

1.2.1 BMF 03菌株和病原真菌的活化

将4℃下保存的BMF 03菌株在无菌条件下转接于PDA斜面上，在28℃的条件下培养1d进行活化；将4℃下保存的15种植物病原真菌在无菌条件下转接于PDA斜面上，在28℃培养3d进行活化，备用。

1.2.2种子液的制备

将BMF 03菌株活化后，在无菌条件下接种一环于盛有60mLPD培养基的250mL三角瓶中，28℃，180r/min振荡培养16h；调整菌液浓度为10⁸个细胞/mL，作发酵用种子液。

1.2.3无菌发酵液的制备

将种子液按6％的接种量接种至盛有60mL发酵培养基的250mL三角瓶中，28℃、180r/min振荡培养48h，即得BMF 03菌株发酵液。将发酵液在4℃、10000r/min条件下离心20min，收集上清液，经直径为0.22μm的细菌过滤器过滤，即为无菌发酵液。

1.2.4 BMF 03菌株对多种植物病原真菌的抑菌活性测定

采用平板对峙的方法，以植物病原菌作为指示菌，测定BMF 03的抑菌活性。在直径9cm的平板中心接上直径5mm的病原真菌的菌苔，在距离平板边缘2.5cm处划线接待测的BMF03菌株，以不接BMF 03菌株作为对照。每处理3个重复。28℃培养3-5d，观测并测量抑菌带宽度。

1.2.5 BMF 03无菌发酵液对多种病原真菌抑菌作用的测定

采用牛津杯法，将指示真菌接在直径9cm的平板中央，在距边缘2.5cm处对称放置4个牛津杯，每个牛津杯中加入不同无菌发酵液200μL，以等量的无菌水为对照，每个菌株重复3次。待空白对照真菌长满平板，测定抑菌圈宽度。

1.2.6 BMF 03无菌发酵液对不同细菌的抑制作用

采用牛津杯法测定发酵液的抑菌活性。将斜面培养24h的5种供试指示细菌分别接种至在盛有60mLNA液体培养基的250mL三角瓶中，28℃、180r/min振荡培养24h，制成浓度为10⁶个细胞/mL的菌悬液，取100μL菌悬液均匀涂布在不同NA培养基上平板上，每个涂有病原菌平板上等距离摆放4个牛津杯，每个牛津杯中加入200μL BMF 03菌株的无菌发酵液，以等量的发酵培养基为对照，每个指示菌为一处理，每个处理重复3次。28℃培养36h，测定BMF03菌株的无菌发酵液对不同指示细菌的抑菌带宽度。

2结果与分析

2.1 BMF 03菌株对多种植物病原真菌的抑菌作用

从表8可以看出，BMF 03菌株对供试的20种病原菌菌丝生长均具有一定的抑制作用。对18种病原菌的抑菌带宽度在10mm以上，其中对苹果腐烂病菌的抑制作用最强，抑菌带宽度达27.33mm。对水稻胡麻斑病菌、草莓灰霉病菌的抑制作用较弱，抑菌带宽度在10mm以下。

表8 BMF 03菌株及其发酵液对多种病原真菌的抑菌带宽度(mm)

2.2 BMF 03无菌发酵液对多种病原真菌抑菌作用

从表8可以看出，BMF 03菌株发酵液对多种病原菌菌丝生长具有一定的抑制作用，其中对小麦根腐病菌等17种病原真菌的抑制作用较强，抑菌带宽度在10mm以上，对水稻胡麻斑病菌、芒果炭疽病菌、小麦纹枯病菌的抑制作用较弱，抑菌带宽度在10mm以下。

2.3 BMF 03无菌发酵液对不同细菌的抑制作用

由表9可知，BMF 03菌株对供试的3种细菌具有明显的抑制作用，对角斑病菌的抑制作用最强，抑菌带宽度为17.50mm，其次是枯草芽孢杆菌，抑制带宽度为15.67mm，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌没有抑制作用。

表9 BMF 03菌株无菌发酵液对5种细菌的抑制作用

实施例2，贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)BMF 03产抑菌物质发酵培养基和摇瓶发酵条件优化实验：

1、实验目的：BMF 03产抑菌物质发酵培养基和摇瓶发酵条件优化

2材料与方法

2.1供试菌株

海洋细菌BMF 03菌株：由本实验室在连云港海域中分离纯化得到并保存。黄瓜枯萎病菌：本实验室保存并提供。

2.2培养基

(1)PD：马铃薯200g、葡萄糖20g、水1000mL。

(2)PDA：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂20g、水1000mL。

2.3实验仪器

表10试验主要仪器

2.4种子液的制备

将BMF 03菌株接种到PDA斜面培养基上活化16h，无菌操作环境下用接种环挑取BMF 03菌株接种于装有60mLPD培养基的250mL三角瓶中，28℃，180r/min环境下摇床振荡培养16h，备用。

2.5无菌发酵液的制备

接6％BMF 03菌株种子液到装有60mL发酵培养基的250mL三角瓶中，pH 7.0，28℃，180r/min条件下振荡培养48h。4离心15min，弃沉淀，取上清液利用细菌过滤器滤掉残余菌体得到无菌发酵液。

2.6无菌发酵液抑菌活性的测定

以黄瓜枯萎病菌为指示菌，采用牛津杯法测定不同发培养基和发酵条件下发酵液的抑菌活性。将指示菌接在培养基中央，在距平板边缘1.5cm等距离对称放置4个牛津杯，每个牛津杯中加入200μL无菌发酵液，以等量的无菌水为对照，28℃培养4d，每组重复3次，测定抑菌带宽度。

2.7基础培养基筛选

将BMF 03菌株分别接种到9种不同的发酵培养基(表11)中进行发酵，每种培养基为一处理，每个处理接种3瓶为3次重复，用牛津杯法和分光光度法分别测定BMF 03菌株在不同培养基中的抑菌带宽度和OD₆₀₀值。

表11基本培养基配方

2.8贝莱斯芽孢杆菌BMF 03菌株摇瓶发酵培养基优化的单因素试验

2.8.1碳源种类的筛选

分别取等量的的乳糖、麦芽糖、玉米糊精、甘露醇、葡萄糖、半乳糖、麸皮和可溶性淀粉替代基础培养基中的碳源，以基础培养基为对照，其他发酵条件不变，进行发酵。每种碳源为1个处理，每个处理3次重复，测定不同处理发酵液的OD₆₀₀值和抑菌带宽度，筛选最佳碳源。

2.8.2碳源浓度的筛选

碳源种类优化的基础上，加入不同浓度(1％，1.5％，2％，2.5％，3％)的碳源配制成不同浓度的碳源培养基进行发酵。每个碳源浓度为1个处理，每个处理3次重复，测定不同处理发酵液的OD₆₀₀值和抑菌带宽度，筛选出最佳碳源浓度。

2.8.3氮源种类的筛选

分别取等量的蛋白胨、硝酸钾、硫酸铵、硝酸钠、酵母浸膏、玉米粉、牛肉膏和尿素替代基础培养基中的氮源，以基础培养基为对照，其他发酵条件不变，进行发酵。每个种类为1个处理，每个处理3次重复，测定不同处理发酵液的OD₆₀₀值和抑菌带宽度，测筛选出最佳氮源。

2.8.4氮源浓度的筛选

氮源种类优化的基础上，相同条件下选用不同浓度(0.5％，1％，1.5％，2％，2.5％)的氮源加入到BMF 03菌株产抑菌物质基础培养基中，配制不同氮源浓度的培养基进行发酵培养。每个氮源浓度为1个处理，每个处理3次重复，测定不同处理发酵液的OD₆₀₀值和抑菌带宽度，筛选出最佳氮源浓度。

2.8.5无机盐种类的筛选

碳源和氮源优化的基础上，大量元素部分加入0.1％浓度的磷酸氢二钾、氯化钙、碳酸钙、硫酸镁、氯化钠、硝酸钾，微量元素部分加入0.01％硫酸锌、硫酸亚铁和硫酸锰分别作为基础培养基中的无机盐，以基础培养基对照，每种无机盐为1个处理，每个处理3次重复，测定不同处理发酵液的OD₆₀₀值和抑菌带宽度，筛选出最佳无机盐。

2.8.6无机盐浓度的筛选

无机盐种类优化的基础上，配置不同浓度的无机盐(大量元素为0.1％，微量元素为0.01％)加入到BMF 03菌株产抑菌物质基础培养基中，配制不同无机盐浓度的培养基进行发酵。每个无机盐浓度为1个处理，每个处理3次重复，测定不同处理发酵液的OD₆₀₀值和抑菌带宽度，筛选出最佳无机盐浓度。

2.9贝莱斯芽孢杆菌BMF 03产抑菌物质培养基优化的正交试验

根据对碳源、氮源、无机盐及浓度的筛选所得到的各组数据，按正交试验设计(表3)，发酵培养48h，以发酵液抑菌效果研究3因素、3水平对海洋细菌BMF 03发酵的影响，测定不同处理发酵液的OD₆₀₀值和抑菌带宽度，筛选出最佳培养基配方。

2.10贝莱斯芽孢杆菌BMF 03菌株摇瓶发酵条件优化

在正交试验优化出的最佳培养基配方的基础上，对接种量、pH值、装液量、发酵时间、摇床转速、发酵温度等进行优化。每个试验组设定3次重复，在一个因素进行优化时，其他条件保持不变。测定OD₆₀₀值和抑菌带宽度，确定最佳发酵条件。

2.10.1发酵时间的优化

BMF 03菌株接种到优化的培养基后进行发酵试验。发酵12h后每隔4h取样一次，测定OD₆₀₀值和抑菌带宽度，每个时间设定3次重复，筛选出OD₆₀₀值和抑菌带宽度最高的发酵时间，筛选最佳发酵时间。

2.10.2发酵pH值的优化

在发酵时间优化的基础上，用1M HCl或1M NaOH调节优化的发酵培养基的pH值分别为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0，将BMF 03菌株种子液接种到不同pH值的发酵培养基后进行摇瓶发酵。每个pH值设定3次重复，测定不同处理发酵液的OD₆₀₀值和抑菌带宽度，筛选最佳发酵pH值。

2.10.3发酵温度的优化

在发酵时间优化和发酵pH值优化的基础上，将BMF 03菌株种子液接种到优化的培养基，试验选用五个温度：24℃、26℃、28℃、30℃、32℃，进行发酵，每个温度设定3次重复，测定不同处理发酵液的OD₆₀₀值和抑菌带宽度，筛选最佳发酵温度。

2.10.4发酵接种量的优化

在发酵时间、温度和pH值优化的基础上，将BMF 03菌株分别按2％、4％、6％、8％、10％等5个接种量接种到优化后的培养基后进行摇瓶发酵。每个接种量设定3次重复，测定不同处理发酵液的OD₆₀₀值和抑菌带宽度，筛选最佳发酵接种量。

2.10.5发酵装液量的优化

在发酵时间、温度、pH值和接种量优化的基础上，将菌株BMF 03分别接种于装有30mL、50mL、70mL、90mL、110mL优化后的培养基中进行发酵。每种装液量设定3次重复，测定不同处理发酵液的OD₆₀₀值和抑菌带宽度，筛选最佳发酵装液量。

2.10.6摇床转速的优化

在发酵时间、温度、pH值、接种量和装液量优化的基础上，将BMF 03菌株种子液接种到优化后的培养基中进行摇瓶发酵。试验选用转速：140r/min、160r/min、180r/min、200r/min、220r/min，每个转速设定3次重复，测定不同处理发酵液的OD₆₀₀值和抑菌带宽度，筛选最佳摇床转速。

3结果与分析

3.1基础培养基筛选

9种不同培养基中，2号YSP培养基BMF 03菌株的菌体生长最好，对黄瓜枯萎病菌的抑制带宽度最大，为20.67mm，与其余培养基数据有显著性差异。其次为9号NB，抑菌带宽度和OD₆₀₀值为18.53mm和1.45，其余培养基的抑菌带宽度和OD₆₀₀值均低于2号培养基，因此选用2号YSP培养基作为最佳基础培养基。

3.2贝莱斯芽孢杆菌BMF 03菌株产抑菌物质培养基优化的单因素试验结果

3.2.1碳源种类筛选

乳糖作为碳源的培养基中BMF 03菌株的菌体生长最好，对黄瓜枯萎病菌的抑制带宽度和OD₆₀₀最大，分别为19.00mm和2.24，与其他碳源培养基数据有显著性差异。所以选用乳糖作为最佳碳源。

3.2.2碳源浓度筛选

乳糖浓度的筛选中，浓度为2％，BMF 03菌株在乳糖作为碳源的基础培养基中抑菌带宽度和OD₆₀₀值最大，分别为18.67mm和2.22，与其他组碳源浓度培养基数据有显著性差异。当乳糖的浓度继续增大时，BMF 03菌株发酵液的抑菌带宽度和OD₆₀₀值降低，在乳糖浓度为1.5％和2.5％时，抑菌带宽度和OD₆₀₀值分别为17.33mm、16mm和2.23、2.08。所以选用1.5％、2％和2.5％作为培养基优化正交试验碳源浓度的三个水平。

3.2.3氮源种类筛选

蛋白胨作为氮源的培养基中BMF 03菌株的菌体生长最好，对黄瓜枯萎病菌的抑制带宽度最大，为19.67mm，与其他氮源培养基数据有显著性差异，所得OD₆₀₀值最大，为1.32，所以选用蛋白胨作为最佳氮源。

3.2.4氮源浓度筛选

蛋白胨浓度的筛选中，当浓度为2％的时候，BMF 03菌株在蛋白胨作为氮源的基础培养基抑菌带宽度和OD₆₀₀值最大，分别为17.33mm和1.92，与其他组氮源浓度培养基数据有显著性差异。当蛋白胨的浓度从0.5％-2.0％时，BMF 03菌株发酵液的抑菌带宽度和OD₆₀₀值上升，当蛋白胨浓度继续增大时BMF 03菌株发酵液抑菌带宽度和OD₆₀₀值下降，在蛋白胨浓度为1.5％和2.5％时，抑菌带宽度和OD₆₀₀值分别为15.67mm、14.67mm和1.74、1.75。所以选用1.5％、2％和2.5％作为培养基优化正交试验氮源浓度的三个水平。

3.2.5无机盐种类筛

不加无机盐的培养基BMF 03菌株的菌体生长最好，对黄瓜枯萎病菌的抑制带宽度最大，为22.00mm，抑菌带宽度最小的为NaCl，为15.7mm。经过显著性分析，不加无机盐的培养基数据与其他无机盐培养基数据有显著性差异。所以无机盐筛选方面选择不加无机盐。

3.3贝莱斯芽孢杆菌BMF 03菌株产抑菌物质培养基优化正交试验结果

通过正交试验设计的结果，可以得出6号培养基配方的抑菌带宽度与OD₆₀₀值最高，数据为34mm和1.329，抑菌带宽度和OD₆₀₀值最低的5号培养基配方。经过显著性分析6号培养基配方数据与其他培养基数据有显著性差异。因此，6号配方选作海洋细菌BMF 03菌株发酵培养基的配方。配方为：乳糖20g/L，蛋白胨25g/L。

表12海洋细菌BMF 03菌株发酵培养基正交试验设计及实验结果

3.4贝莱斯芽孢杆菌BMF 03菌株产抑菌物质发酵条件优化

3.4.1发酵时间优化

海洋细菌BMF 03菌株发酵时间不同，菌株发酵液的生长量和抑菌作用不同，在时间梯度为12-40h抑菌带宽度与OD₆₀₀值不断增加，在40h达到最大，抑菌带宽度与OD₆₀₀值分别为19.67mm和1.92，与其他组发酵时间数据有显著性差异。随着时间的增长抑菌带宽度和OD₆₀₀值下降。因此40h为BMF 03菌株摇瓶发酵的最佳发酵时间。

3.4.2发酵pH优化

海洋细菌BMF 03在不同初始pH的发酵液中抑菌作用及菌体生长量有非常显著的差异，初始pH为5.0-6.0时抑菌带宽度增大，此数据显示海洋细菌BMF 03菌株适合在此pH范围生长发酵。当初始pH为6.0-9.0时抑菌带宽度和OD₆₀₀值明显下降。在pH 6.0条件下抑菌带宽度和OD₆₀₀值最大，分别为16.67mm和1.73与其他组发酵pH数据有显著性差异。因此将pH6.0作为海洋细菌BMF 03菌株摇瓶发酵的最佳pH。

3.4.3发酵摇瓶装液量优化

发酵摇瓶装液量为30-50mL/250mL发酵液抑菌带宽度和OD₆₀₀值增大50mL/250mL时其发酵液的抑菌活性最大，其抑菌带宽度最大，为18.33mm，与其他组发酵摇瓶装液量数据有显著性差异，随着装液量的提高，发酵液的抑菌带宽度下降。因此将装液量50mL/250mL作为海洋细菌BMF 03菌株摇瓶发酵的最佳装液量。

3.4.4发酵温度优化

发酵温度24-28℃时，发酵液抑菌带宽度和OD₆₀₀值增大，发酵温度在28℃时发酵液的抑菌活性最大，抑菌带宽度为16.33mm，与其他组发酵温度数据有显著性差异，随着温度增高，抑菌带宽度和OD₆₀₀值下降。因此将28℃作为海洋细菌BMF 03菌株摇瓶发酵的最佳发酵温度。

3.4.5摇瓶发酵接种量优化

海洋细菌BMF 03在不同发酵摇瓶接种量中抑菌作用及生长量有较大的差异，接种量为6％的时候在BMF 03菌株发酵液的抑菌带宽度和OD₆₀₀最大，分别为22.33mm和2.06，与其他组发酵摇瓶接种量数据有显著性差异。但随接种量的增大，菌体生长量减少。因此将6％的接种量作为海洋细菌BMF 03菌株摇瓶发酵的最佳接种量。

3.4.6摇床转速优化

摇床转速影响着海洋细菌BMF 03菌株发酵液的抑菌活性，在转速为160r/min时，抑菌活性最强，其抑菌带宽度和OD₆₀₀值分别为25.67mm和2.32，与其他组发酵液转速数据有显著性差异。因此将160r/min作为海洋细菌BMF 03菌株摇瓶发酵的最佳摇床转速。

实施例3，贝莱斯芽孢杆菌BMF 03固态发酵食用菌菌糠的培养基及发酵条件优化实验：

1、实验目的：为进一步利用BMF 03菌株开发成微生物肥料和农药，以发酵后固态培养基中的细菌总数和芽孢产率为检测指标，采用单因素和响应面试验设计，对BMF 03菌株固态发酵培养基和发酵条件进行优化。

2材料和方法

2.1试验材料

2.1.1供试菌株

贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)BMF 03菌株：本实验室从连云港海域分离获得并保藏。

甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)BMF 04菌株：本实验室从连云港海域分离获得并保藏。

2.1.2仪器设备

2.1.3培养基

贝莱斯芽孢杆菌BMF 03菌株活化培养基：PDA培养基。

贝莱斯芽孢杆菌BMF 03种子培养基：PD培养基。

2.2试验方法

2.2.1菌种活化

将4℃下保存的贝莱斯芽孢杆菌BMF 03在无菌操作下接种到PDA斜面上，28℃培养约16h。

2.2.2种子液制备

将活化好的贝莱斯芽孢杆菌BMF 03接种于装有60mL种子液培养基的250mL三角瓶内，自然pH，置于摇床中28℃、180r/min振荡培养16h，将菌液浓度调整为10⁹cfu/mL，作为种子液。

2.2.4细菌总数和芽孢产率的测定

细菌总数的测定：血球计数板法。取一块洁净的血球计数板，在计数区盖上盖玻片，将固态发酵培养基用0.5％的吐温80进行梯度稀释并混匀^[32]，吸取少量稀释液，将稀释液沿血球计数板沟槽边缘滴入，轻轻按压盖玻片，让菌悬液均匀分布于整个计数区，并避免产生气泡^[33]。用吸水纸吸去多余稀释液，避免多余液体影响计数。静止2min后进行镜检。待计数完毕后，取下盖玻片，将载玻片洗净,放入95％乙醇中保存^[34]。

芽孢产率的测定：结晶紫染色法。将稀释液涂片，干燥固定后用结晶紫染液进行染色，测定视野中芽孢数目，计算芽孢产率。

2.2.5BMF 03菌株初始发酵条件

发酵培养基配制完成后，121℃灭菌60min。接种量20％，料水比1∶1.5，自然pH，发酵温度32℃发酵时间72h。

2.3BMF 03菌株固态发酵培养基优化的单因素试验

2.3.1碳源种类筛选

如表13所示，1-5号培养基中，分别添加37％的玉米粉、玉米芯粉、稻壳粉、麸皮、米糠作为碳源，以6、7号培养基作为CK₁、CK₂。每种碳源作为1个处理，每个处理设3次重复。待发酵完成，测定培养基细菌总数和芽孢率，筛选最佳碳源。

表13不同碳源培养基的配方

2.3.2碳源浓度筛选

在筛选出最佳碳源的基础上，设置碳源浓度梯度为26％、32％、37％、41％和45％。每个碳源浓度作为1个处理，每个处理设3次重复。待发酵完成，测定培养基细菌总数和芽孢产率，确定最佳碳源浓度。

2.3.3氮源种类筛选

在筛选出最佳碳源的基础上，分别添加0.1％的尿素、硫酸铵、硝酸铵、氯化铵、硝酸钠作为外加无机氮源，18.5％的豆粕和18.5％花生饼粉为有机氮源。每种氮源作为1个处理，每个处理设3次重复。待发酵完成，测定培养基细菌总数和芽孢产率，筛选最佳氮源。

2.3.4氮源浓度筛选

在筛选出最佳氮源的基础上，设置氮源浓度梯度为0.5％、0.75％、1％、1.25％和1.5％。每个氮源浓度作为1个处理，每个处理设3次重复。待发酵完成，测定培养基细菌总数和芽孢产率，确定最佳氮源浓度。

2.2.5无机盐种类筛选

分别称取0.2％的硝酸钾、硫酸镁、碳酸钙、氯化钠、磷酸氢二钾和0.02％的硫酸锰、硫酸锌、硫酸亚铁。每种无机盐作为1个处理，每个处理设3次重复。待发酵完成，测定培养基细菌总数和芽孢产率，筛选最佳无机盐。

2.3.6无机盐浓度筛选

在筛选出最佳无机盐的基础上，其他发酵条件均不变条件下，设置无机盐浓度梯度为0.1％、0.15％、0.2％、0.25％和0.3％。每个因素无机盐浓度作为1个处理，每个处理设3次重复。待发酵完成，测定培养基细菌总数和芽孢产率，确定最佳无机盐浓度。

2.4BMF 03菌株固态发酵培养基优化的响应面试验

响应面各因素水平如表14所示，将单因素试验筛选获得的发酵培养基最佳碳源(A)、氮源(B)和无机盐(C)作为响应值，通过Box-Beheken的中心组合原理，设计三因素三水平共17组试验，每组设3次重复，响应值(Y)为细菌总数，并以-1、0、1对响应面三因素进行编码。待发酵完成后以细菌总数为检测指标，通过Design Expert8.0.6软件对实验数据进行分析，筛选最优固态发酵培养基配方，为发酵条件的优化做准备。

表14响应面各因素水平表(％)

2.5 BMF03菌株固态发酵条件的优化

2.5.1接种量

在优化得到的最佳发酵培养基的基础上，将BMF 03菌株种子液分别按照5％、10％、15％、20％、25％、30％的接种量接入配置好的固态发酵培养基中，每个接种量作为1个处理，每个处理设3次重复，其他发酵条件均控制不变。测定培养基细菌总数和芽孢产率，筛选最佳接种量。

2.5.2发酵时间

在接种量优化的基础上，将BMF 03菌株的种子液接入优化后的固态发酵培养基中进行发酵，每4h测定一次固态发酵培养基中细菌总数和芽孢产率，每个发酵时间作为1个处理，每个处理设3次重复，其他发酵条件均控制不变。筛选最佳固态发酵时间。

2.5.3料水比

在接种量、时间优化的基础上，设置料水比梯度为1∶1.1、1∶1.3、1∶1.5、1∶1.7和1∶1.9，分别配制固态发酵培养基，每个料水比作为1个处理，每个处理设3次重复，其他发酵条件均控制不变。待发酵完成后，测定培养基细菌总数和芽孢产率，筛选最佳料水比。

2.5.4培养温度

在接种量、发酵时间、料水比优化的基础上，将BMF 03菌株的种子液接入优化后的固态发酵培养基中进行发酵，发酵温度分别设置为24℃、28℃、32℃、36℃、40℃，每个温度作为1个处理，每个处理设3次重复，其他发酵条件控制不变。测定培养基细菌总数和芽孢产率，筛选最佳培养温度。

2.5.5pH值

在上述发酵条件优化的基础上，设定发酵培养基pH梯度5、6、7、8、9，将BMF 03种子液接入优化后的固态发酵培养基中，每个pH作为1个处理，每个处理设3次重复，其他发酵条件保持不变。测定培养基细菌总数和芽孢产率，筛选最佳pH。

3结果与分析

3.1培养基优化的单因素试验

3.1.1碳源种类筛选

考察不同碳源对海洋细菌BMF 03菌株固态发酵细菌总数和芽孢产率有明显的影响，添加玉米粉、麸皮的培养基对BMF 03细菌总数影响较大，细菌总数分别达到9.70×10⁹个细胞/g、10.62×10⁹个细胞/g，芽孢产率也较高，而不添加碳源的的培养基细菌总数相对较少。由于玉米粉和麸皮对细菌总数的影响显著，因此对二者进一步研究，筛选最优碳源。

两种待优化碳源的培养基配方如表15所示，对BMF 03菌株碳源种类培养基筛选再次优化后，7号培养基细菌总数和芽孢率都相对较高，细菌总数为11.12×10⁹细胞/g,芽孢率为90％，因此选择7号培养基作为贝莱斯芽孢杆菌BMF 03固态发酵最优碳源培养基。

表15优化两种碳源的培养基配方

3.1.2碳源浓度筛选

考察不同碳源浓度对BMF 03菌株细菌总数及芽孢产率的影响，在一定浓度范围内，BMF 03菌株细菌总数随碳源浓度的增大而增加，当碳源浓度为37％时，细菌总数和芽孢产率都达到了最高，分别为4.55×10¹⁰细胞/g,芽孢率为95％；随浓度继续增大，细菌总数和芽孢率都有所下降。因此，选择37％为BMF 03固态发酵培养基最佳碳源浓度。

3.1.3氮源种类筛选

考察不同氮源对BMF 03菌株细菌总数及芽孢产率的影响，1号培养基的细菌总数最高，达到4.99×10¹⁰个细胞g，芽孢率达到94％；其次是4号培养基，细菌总数达到4.45×10¹⁰个细胞/g，芽孢产率最高，为92％。综合考虑，选择1号尿素为BMF 03菌株固态发酵培养基最佳氮源。

3.1.4氮源浓度筛选

考察不同氮源浓度对BMF 03菌株细菌总数及芽孢产率的影响，当氮源浓度在0.5％～0.75％时，BMF 03菌株细菌总数随氮源浓度的增大而增加，当氮源浓度为0.75％时，细菌总数和芽孢产率都达到了最大，分别为5.02×10¹⁰个细胞/g、94％；随浓度继续增大，细菌总数和芽孢率都有所下降。因此，选择0.75％为BMF 03菌株固态发酵培养基最佳氮源浓度。

3.1.5无机盐筛选

考察不同无机盐对BMF 03菌株细菌总数及芽孢产率的影响，5号机培养基细菌总数和芽孢产率最高，分别为4.55×10¹⁰个细胞/g和86％；其次是添加1号无机盐的培养基，其细菌总数和芽孢产率分别为4.45×10¹⁰个细胞/g和94％，因此，选择5号磷酸氢二钾为BMF03菌株固态发酵培养基最优无机盐。

3.1.6无机盐浓度筛选

考察不同无机盐浓度对BMF 03菌株细菌总数及芽孢产率的影响，当无机盐的浓度在0.1％～0.2％时，BMF 03菌株细菌总数随无机盐浓度的增大而增加；当无机盐浓度为0.2％时，细菌总数最高为4.46×10¹⁰个细胞/g，芽孢产率为92％；浓度超过0.2％时，细菌总数呈下降趋势。因此，选择0.2％为BMF 03固态发酵培养基最佳无机盐浓度。

3.2BMF 03菌株固态发酵培养基响应面试验结果

根据表16运用Design-Expert软件对培养基各因素进行多元回归拟合,可得玉米粉(A)、尿素(B)、磷酸氢二钾(C)与响应值细菌总数(Y)的二次方程,其方程式：Y＝-36.30591+0.99275A+9.599B+203.7975C+0.08AB-0.4875AC-3BC-0.013344A²-7.576B²-464.4C²。根据响应面试验结果,回归模型的方差分析如表17所示通过对P值检验可以看出，碳源、氮源、无机盐以及它们的二次项对细菌总数的影响都是显著的，且影响显著。同时，模型的复相关系数R²＝0.9996，表示该实验预测值与实验值拟合良好。从上述数据可以看出,此模型很好地反映细菌总数与碳源、氮源、无机盐之间的关系,可以用来对细菌总数进行优化分析与预测。此外，从F值可以看出对细菌总数的影响顺序：B＞A＞C，即玉米粉＞尿素＞磷酸氢二钾。

表16 Box-Benhnken响应面试验设计方案及试验结果

表17 Box-Benhnken响应面试验方差分析结果

注：**差异极显著(P＜0.0001)；*差异显著(P＜0.05)

根据回归方程绘制细菌总数随各因素变化的响应面，由响应面图可知碳源(A)、氮源(B)、无机盐(C)对细菌总数的影响存在最大值，进一步通过软件分析计算得到因此，确定贝莱斯芽孢杆菌BMF 03固态发酵最佳配方为：碳源(A)37％、氮源(B)0.75％、无机盐(C)0.2％。

3.3BMF 03菌株固态发酵培养基发酵条件优化

3.3.1接种量

考察接种量对贝莱斯芽孢杆菌BMF 03菌株固态发酵的细菌总数和芽孢产率的影响，当接种量为25％的时细菌总数最大，达5.52×10¹⁰个细胞/g，芽孢产率最高，为95％；当接种量继续增大时，细菌总数呈下降趋势。因此贝莱斯芽孢杆菌BMF 03固态发酵的最佳接种量为25％。

3.3.2发酵时间

考察时间对贝莱斯芽孢杆菌BMF 03菌株固态发酵的细菌总数和芽孢产率的影响，在时间为0～20h时细菌生长处于缓慢增长阶段，20～36h后进入对数期，细菌总数明显上升，36h后开始进入稳定期，这时候细菌总数变化不大，芽孢开始逐渐形成，40h后芽孢快速增长，到68h稳定期后期细菌总数开始下降，此时芽孢率达到最大值为95％，随着时间的增长细菌总数和芽孢产率开始逐渐下降。因此，贝莱斯芽孢杆菌BMF 03固态发酵的最佳发酵时间为68h。

3.3.3料水比

考察料水比对贝莱斯芽孢杆菌BMF 03菌株固态发酵的细菌总数和芽孢产率的影响，当料水比在1∶1.1～1∶1.5时，细菌总数逐渐增大；当料水比为1∶1.5时，细菌总数和芽孢产率达到最大，分别为5.57×10¹⁰个细胞/g和94％；随着料水比继续增大，细菌总数呈下降趋势，因此，贝莱斯芽孢杆菌BMF 03固态发酵的最佳料水比为1∶1.5。

3.3.5发酵温度

考察温度对贝莱斯芽孢杆菌BMF 03菌株固态发酵的细菌总数和芽孢产率的影响，温度在24℃～37℃时，细菌总数随温度的升高呈上升趋势，但当温度为24℃时，几乎无芽孢产生；当温度为37℃时，细菌总数和芽孢率都达到最高，分别为5.65×10¹⁰个细胞/g和95％，当温度超过37℃时细菌总数有明显下降。因此，贝莱斯芽孢杆菌BMF 03固态发酵发酵最适温度为37℃。

3.3.6pH值

考察pH对贝莱斯芽孢杆菌BMF 03菌株固态发酵的细菌总数和芽孢产率的影响，pH在5～7时细菌总数随pH增大而增加，在pH 7条件下培养基的细菌总数和芽孢率最高，为5.66×10¹⁰个细胞/g，芽孢产率为96％，pH大于7时，细菌总数和芽孢产率有所下降。因此，贝莱斯芽孢杆菌BMF 03固态发酵发酵的最佳pH为7。

3.4验证试验结果

2号培养基为优化后的培养基，1号为对比培养基，海洋细菌BMF 03在2号培养基中细菌总数和芽孢产率最高，分别为5.6×10¹⁰个细胞/g、96％。表明海洋细菌BMF 03最适合的发酵培养基为2号优化培养基。BMF 03菌株在2号培养基中优化条件下发酵的芽孢镜检图，可清晰见到数量较多的芽孢。

实施例4，海洋细菌BMF 03菌株对黄瓜幼苗生长的影响实验：

1实验目的

本试验采用盆栽的方式，将不同浓度BMF 03菌株发酵液通过灌根、浸种和拌土3种方法处理黄瓜种子和土壤，测定处理的黄瓜的发芽率、出苗率、地上部和地下部鲜重和干重，分析海洋细菌BMF 03发酵液对黄瓜幼苗生长的影响。

2材料与方法

2.1试验材料

2.1.1供试菌株

BMF 03菌株：本实验室从连云港海域分离获得并保存。

2.1.2黄瓜种子

试验供试黄瓜品种：新津研四号(购于连云港市种子站)。

2.1.3培养基

PDA培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，琼脂20g，水1000mL，自然pH。

PD培养基：马铃薯200g，葡萄糖20g，水1000mL，自然pH。

BMF 03菌株发酵培养基：黄豆粕粉15g，蔗糖5.55g，MgCl₂0.222 g，MnSO₄0.222 g，水1000mL，自然pH。

2.2试验方法

2.2.1 BMF 03菌株发酵液的制备

将本实验室保藏的BMF 03菌株接种至新制作的PDA斜面上，28℃条件下培养16h。挑取少量BMF 03菌株接种至盛有60mL种子液培养基的250mL三角瓶内，28℃，180rpm条件下震荡培养18h。按6％接种量将BMF 03种子液接种至盛有60mL发酵培养基的250mL三角瓶内，28℃，180rpm条件下在震荡培养48h，备用。

2.2.2 BMF 03菌株对黄瓜种子、幼苗、土壤的不同处理方法

(1)浸种法：

黄瓜种子分别放在浓度为6.25％、12.5％、25％、50％和100％的BMF 03菌株发酵液中，以50％的未接菌的培养基为对照组(CK)，28℃条件下处理24h，取出沥干后播种。每个浓度播种3个花盆，每盆栽种15粒种子。

(2)灌根法：

黄瓜正常播种，每盆栽种15粒种子，黄瓜幼苗长到一叶期后，分别用浓度为6.25％、12.5％、25％、50％和100％的BMF 03菌株发酵液进行灌根，每盆用量为50mL，5天灌根1次、连续灌根5次，以等量的50％浓度的未接菌的培养基作为对照组(CK)，共计灌溉5次。

(3)拌土法：

将浓度为6.25％、12.5％、25％、50％和100％的BMF 03菌株发酵液分别与土壤按照体积比为1:4的比例搅拌均匀置于花盆中，以等量的50％浓度未接菌的培养基做为对照组(CK)，每个浓度播种3个花盆，每盆栽种15株黄瓜。

(4)菌糠固态发酵物拌土法：

将采用固态发酵方法发酵好的固态发酵物与土壤按照体积比为1:15、1:7、1:3、1:1和全菌糠的比例搅拌均匀，装盆后播种黄瓜种子，以不添加固态发酵物的土壤为对照组(CK)，每个浓度播种3个花盆，每盆栽种15粒种子。

2.3结果调查与统计

分别于子叶期、一叶期、二叶期及三叶期从不同处理组花盆中随机抽取10株黄瓜幼苗，测定黄瓜幼苗的株高和茎粗。待黄瓜幼苗生长至三叶期，移出幼苗，测量其地上、地下部分鲜重、干重和须根数，比较BMF 03菌株不同处理方法对黄瓜幼苗生长的促进效果。

3结果与分析

3.1 BMF 03菌株发酵液不同处理对黄瓜种子发芽的影响

用BMF 03菌株发酵液处理黄瓜种子和土壤作后，除纯菌糠处理组外，浸种、拌土及固态发酵物拌土处理后的黄瓜种子的发芽率和出苗率与CK无明显差异，纯菌糠处理对黄瓜发芽和出苗有抑制作用，在未来做BMF 03菌肥的开发和利用时应注意避免纯菌糠条件。

3.2 BMF 03菌株发酵液浸种处理对黄瓜幼苗生长的影响

用不同浓度的BMF 03菌株发酵液对黄瓜种子浸种处理，所有BMF 03菌株发酵液浸种处理组的幼苗株高都普遍高于CK组，说明BMF 03菌株发酵液浸种处理对黄瓜幼苗生长具有促进作用，发酵液浓度低于25％时，发酵液浓度越高，幼苗的平均株高越高，发酵液浓度为25％时，黄瓜幼苗的平均株高相较于其它处理组为最高，且增长趋势最明显。当发酵液浓度大于25％时，幼苗的株高随BMF 03菌株发酵液浓度增加下降。

不同浓度发酵液浸种处理黄瓜幼苗茎粗都略高于CK，浓度为25％时黄瓜幼苗的茎粗最高。

待黄瓜幼苗长至三叶期时，移出幼苗，测量其地上、地下部分鲜重、干重及须根数。结果表明，当采用浓度为25％的菌株发酵液进行浸种处理时，幼苗地上、地下部分鲜重和干重最高，对幼苗的促生作用最明显。

3.3 BMF 03菌株发酵液拌土处理对黄瓜幼苗生长的影响

BMF 03菌株发酵液拌土处理组的黄瓜幼苗株高均高于CK组，浓度低于50％时，发酵液的浓度越大，黄瓜幼苗的株高越高，浓度为50％的BMF 03菌株发酵液进行拌土处理时，黄瓜幼苗的株高达到最大值。当发酵液浓度大于50％时，黄瓜幼苗的株高降低。因此说明对黄瓜幼苗的促生作用最高的BMF 03菌株发酵液拌土处理的浓度为50％。

用BMF 03菌株发酵液进行拌土处理，处理组的幼苗茎粗高于CK组，浓度为25％的处理黄瓜幼苗的茎粗达到最大值。

BMF 03菌株发酵液拌土处理浓度为50％时，黄瓜幼苗的地上、地下部分鲜重、干重及须根数最高，表明该浓度处理对黄瓜幼苗的促生作用最为明显。

3.4 BMF 03菌株发酵液灌根处理对黄瓜幼苗生长的影响

当BMF 03菌株发酵液灌根浓度为100％时，幼苗的株高、径粗、以及黄瓜幼苗地上、地下鲜重、干重及须根数最高，对黄瓜幼苗的生长具有明显促进作用。

3.5 BMF 03菌株菌糠的固态发酵物拌土处理对黄瓜幼苗生长的影响

BMF 03菌株菌糠的固态发酵物按不同比例进行拌土处理，黄瓜幼苗的株高、径粗、地上和地下部分的鲜重、干重及须根数都明显高于CK组，BMF 03菌株菌糠的固态发酵物与土壤比例为1:3时，各项指标最高，对黄瓜幼苗生长的促进作用最强。认为BMF 03菌株菌糠的固态发酵物与土壤的最佳比例为1:3。

Claims

1.一种贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)BMF 03，其特征在于：其保藏号为CCTCC NO：2017374。

2.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌BMF 03的用途，其特征在于：所述的用途为BMF 03菌株对植物病原真菌的抑制用途，所述的植物病原真菌选自：苹果腐烂病菌(Valsa mali)、葡萄白腐病菌(Coniella diplodiella)、芒果炭疽病菌(Colletotrichumgloesporioides)、小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)、黄瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporum)、苹果炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)、小麦雪腐镰刀菌(Fusarium nivale)、玉米弯孢霉叶斑病菌(Curvularia lunata)、蓝莓早疫病菌(Alternaria solani)、小麦纹枯病菌(Rhizoctonia cerealis)、大豆菌核病菌(Sclerotina sclerotiorum)、玉米叶枯病菌(Alternaria tenuis Nees)。

3.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌BMF 03的用途，其特征在于：所述的用途为BMF 03菌株的无菌发酵液对植物病原真菌的抑制用途，所述的植物病原真菌选自：小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)、苹果腐烂病菌(Valsa mali)、稻瘟病菌(Pyricularia oryzae)、小麦根腐病菌(Bipolaris sorokiniana)、斑点落叶病菌(Alternaria alternate)、黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum)、苹果炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)、草莓灰霉病菌(Botrytis cinerea)、、小麦雪腐镰刀菌(Fusarium nivale)、玉米弯孢霉叶斑病菌(Curvularia lunata)、玉米小斑病菌(Bipolaris maydis)、水稻纹枯病菌(Rhizoctoniasolani)、蓝莓早疫病菌(Alternaria solani)、大豆菌核病菌(Sclerotinasclerotiorum)、玉米叶枯病菌(Alternaria tenuis)。

4.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌BMF 03的用途，其特征在于：所述的用途为以BMF03菌株的无菌发酵液为有效成份制成抑细菌药物的用途，所述的细菌选自：角斑病菌(Pseudomonas syringae)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、青枯病菌(Ralstoniasolanacearum)。

5.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌BMF 03的无菌发酵液的发酵方法，其特征在于：将种子液按6％的接种量接种至盛有60mL发酵培养基的250mL三角瓶中，28℃、180r/min振荡培养48h，即得BMF 03菌株发酵液；将发酵液在4℃、10000r/min条件下离心20min，收集上清液，经直径为0.22μm的细菌过滤器过滤，即得无菌发酵液。

6.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌BMF 03产芽孢的发酵培养方法，其特征在于：贝莱斯芽孢杆菌BMF 03的产芽孢培养基配方为：乳糖20g/L，蛋白胨25g/L；发酵条件为：摇床培养时间40h，pH 6.0，装液量为50mL/250mL，温度28℃，接种量为6％，摇床转速为160r/min。

7.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌BMF 03固态发酵食用菌菌糠的方法，其特征在于：贝莱斯芽孢杆菌BMF 03菌株固态发酵培养基配方为：菌糠44.5％、玉米粉37％、豆粕18.5％、尿素0.75％、磷酸氢二钾0.2％；发酵条件为：接种量25％，发酵时间68h，料水比1∶1.5，温度37℃，pH7。

8.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌BMF 03促进黄瓜幼苗生长的用途。