CN113832057B

CN113832057B - 一株贝莱斯芽孢杆菌及其应用

Info

Publication number: CN113832057B
Application number: CN202111108330.9A
Authority: CN
Inventors: 黄艳红; 张兴荣; 徐慧; 贺连智
Original assignee: Shandong Food Ferment Industry Research & Design Institute
Current assignee: Shandong Food Ferment Industry Research & Design Institute
Priority date: 2021-09-22
Filing date: 2021-09-22
Publication date: 2023-04-11
Anticipated expiration: 2041-09-22
Also published as: CN113832057A

Abstract

本发明提供一株贝莱斯芽孢杆菌及其应用，属于微生物技术领域。经研究发现，本发明筛选得到的菌株其具有产吡嗪类香气成分的能力，同时该贝莱斯芽孢杆菌能够代谢产生伊枯草菌素、芬介素和表面活性素等肽酯类抗生素，具有广谱抗菌性，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、黄曲霉和赭曲霉等多种食源性病原菌具有显著抑制作用，从而减少内源危害物(如黄曲霉素、赭曲霉素等)的产生，且该菌株抗逆性强，具有极佳的耐盐性，因此特别适合作为食醋、酱油等传统发酵食品的生产菌剂使用，具有良好的实际应用之价值。

Description

一株贝莱斯芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株贝莱斯芽孢杆菌及其应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

食醋是我国各大菜系中传统的调味品，有着三千多年的酿造历史。随着生活质量的提高，人们对高品质食醋的需求也呈现出递增趋势，其口感和保健功能也逐渐受到重视。传统食醋酿造是在一个开放的环境下进行的、多菌种参与的混合发酵的过程，酿造过程微生物代谢产物除乙酸外，还有大量的有机酸(乳酸、柠檬酸、苹果酸等)、氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、丙氨酸等)、挥发性成分(酯类、酮类、醇类、醛类等)及功能性物质(吡嗪类、多酚类)等。

其中吡嗪是食醋中重要的香气及功能活性成分，该类化合物蒸汽压低，易挥发，且香势强，气味阈值低，具有焙烤和坚果的香气，有降血压、活血化瘀、清除自由基等医疗保健价值。在食醋的酿造过程中，该类物质是由微生物发酵和美拉德反应共同作用产生的。因此将产吡嗪类物质的功能性微生物应用到食醋的实际生产中，通过改变醋酸发酵过程中细菌的微生物群落结构和丰度，对发酵过程进行针对性的调控，可以增加食醋生成过程中功能活性物质特别是吡嗪类物质的含量，在改善产品风味的同时增强其保健功能，为食醋的品质提升提供一定的数据参考，也为食醋工艺的改革和食醋行业的发展提供理论依据。因此筛选此类功能性微生物对食醋等发酵食品生产无疑具有重要的意义。

发明内容

基于上述现有技术的不足，本发明提供一株贝莱斯芽孢杆菌及其应用，经香气成分分析，其具有产吡嗪类成分的能力，同时经研究发现，该贝莱斯芽孢杆菌能够代谢产生肽酯类抗生素，对多种食源性病原菌具有显著抑制作用，从而减少内源危害物的产生，且该菌株抗逆性强，能够耐受15％浓度的盐溶液，因此特别适合用于食醋等发酵食品的生产。

为实现上述技术目的，本发明涉及以下技术方案：

本发明的一个方面，提供一株贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)T-D-1，该菌株已于2021年4月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，(地址：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学)，其生物保藏号为CCTCC NO：M 2021421。

所述贝莱斯芽孢杆菌T-D-1的特征特性如下：革兰氏阳性菌，菌体短杆状，单个排列，不运动；菌落3-4mm，圆形，凸起，乳黄色，较粘稠，边缘整齐，无褶皱。

本发明的第二个方面，提供上述贝莱斯芽孢杆菌T-D-1的发酵生产方法，所述发酵生产方法包括：将所述贝莱斯芽孢杆菌T-D-1接种至发酵培养基中进行发酵培养即得。

本发明的第三个方面，提供一种微生物菌剂，其含有所述贝莱斯芽孢杆菌T-D-1或其发酵物或其代谢产物。

上述病原菌抑制剂的活性成分可以是贝莱斯芽孢杆菌T-D-1或其发酵物或其代谢产物，上述病原菌抑制剂的活性成分还可含有其他生物成分或非生物成分，上述病原菌抑制剂的其他活性成分本领域技术人员可根据对病原菌的抑制效果确定。

上述增香/调香剂的活性成分可以是贝莱斯芽孢杆菌T-D-1或其发酵物或其代谢产物，上述增香/调香剂的活性成分还可含有其他生物成分或非生物成分，上述增香/调香剂的其他活性成分本领域技术人员可根据对增香/调香的具体效果确定。

本发明的第四个方面，上述贝莱斯芽孢杆菌T-D-1或其发酵物或其代谢产物在如下1)-6)中全部或部分中的应用也是本发明保护的范围：

1)在抑制病原菌中的应用；

2)在制备病原菌抑制剂中的应用；

3)在增香和/或调香中的应用；

4)在制备增香/调香剂中的应用；

5)在发酵食品生产中的应用；

6)在制备发酵食品生产菌剂中的应用。

上文中，所述病原菌可以为食源性病原菌，包括食源性病原细菌和病原真菌，所述食源性病原细菌包括大肠杆菌和金黄色葡萄球菌；所述病原真菌包括黄曲霉和赭曲霉。

所述发酵食品包括但不限于食醋、酱油、酱和白酒等。

本发明的第五个方面，提供一种发酵食品进行发酵生产的方法，所述方法包括：在生产过程中施加上述贝莱斯芽孢杆菌T-D-1、上述贝莱斯芽孢杆菌T-D-1的发酵物、上述贝莱斯芽孢杆菌T-D-1的代谢产物和/或上述微生物菌剂。

需要说明的是，本发明的贝莱斯芽孢杆菌T-D-1还具有极佳的抗逆性，能够耐受高达15％的盐浓度，有利于其在高盐发酵食品的发酵生产环境中发挥作用。

所述发酵食品包括但不限于食醋、酱油、酱和白酒等。

上述一个或多个技术方案的有益技术效果：

上述技术方案首次报道一株贝莱斯芽孢杆菌，其具有产吡嗪类香气成分的能力，该贝莱斯芽孢杆菌能够代谢产生伊枯草菌素、芬介素和表面活性素等肽酯类抗生素，具有广谱抗菌性，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、黄曲霉和赭曲霉等多种食源性病原菌具有显著抑制作用，从而减少内源危害物(如黄曲霉素、赭曲霉素等)的产生，且该菌株抗逆性强，具有极佳的耐盐性，因此特别适合作为食醋、酱油等传统发酵食品的生产菌剂使用，具有良好的实际应用之价值。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明贝莱斯芽孢杆菌T-D-1的平板和显微镜图。

图2为三种抗生素基因扩增结果图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

本发明的一个典型具体实施方式中，提供一株贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)T-D-1，该菌株已于2021年4月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，(地址：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学)，其生物保藏号为CCTCC NO：M 2021421。

本发明的又一具体实施方式中，提供上述贝莱斯芽孢杆菌T-D-1的发酵生产方法，所述发酵生产方法包括：将所述贝莱斯芽孢杆菌T-D-1接种至发酵培养基中进行发酵培养即得。

发酵培养条件具体为：在26～30℃(优选为28℃)培养20～30h(优选为24h)，转速：100-150rpm(优选为120rpm)。

其中，所述发酵培养基可采用常规细菌培养基，如LB培养基或NB培养基；

本发明的又一具体实施方式中，所述LB培养基配方(g/L)：蛋白胨10，酵母提取物5，氯化钠10，pH7.2。

本发明的又一具体实施方式中，所述NB培养基配方(g/L)：蛋白胨10，牛肉膏5，氯化钠5，pH7.2。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种微生物菌剂，其含有所述贝莱斯芽孢杆菌T-D-1或其发酵物或其代谢产物。

术语“发酵物”用于指代发酵产品。相应的发酵物可以是从发酵培养贝莱斯芽孢杆菌T-D-1的过程获得的液体，因此，也可称为发酵液；液体可以含有细菌(菌体)，但并不必然需要含有细菌。液体优选的含有由本发明的贝莱斯芽孢杆菌T-D-1产生的代谢产物。

以及，在本发明的实施方式中，包含菌体的发酵液或培养液经离心、过滤、沉降或所属领域中已知的其他手段将在发酵液或培养液中生长的菌体细胞与液体分离，去除菌体细胞时所剩余的液体为“上清液”，并且在本发明中，上清液内含有贝莱斯芽孢杆菌T-D-1的胞外代谢产物。在本发明的实施方式中，所述菌剂也可以包含该上清液。

以及，在本发明的实施方式中，包含菌体的发酵液或培养液经离心、过滤、沉降或所属领域中已知的其他手段将在发酵液或培养液中生长的菌体细胞与液体分离获取菌体，菌体可进行破碎获取菌体破碎物，破碎方式可以为超声(比如冰浴超声破碎细胞)或者本领域已知的其他手段，或者，更进一步的，对该菌体破碎物离心收集上清液，该上清液记为无细胞提取物，并且在本发明中，该菌体破碎物或无细胞提取物内含有贝莱斯芽孢杆菌T-D-1的胞内代谢产物。在本发明的实施方式中，所述菌剂也可以包含该菌体破碎物或无细胞提取物。

以及，在本发明的实施方式中，为方便存储、运输，提高菌株存活率等，所述菌剂也可以是固体，进一步优选为冻干粉剂。即针对上述贝莱斯芽孢杆菌T-D-1或其发酵物或其代谢产物进一步进行冷冻干燥获得，所述冷冻干燥技术(包括真空冷冻干燥技术)可采用常规方法进行，在此不再赘述。

经试验研究发现，该贝莱斯芽孢杆菌具有产吡嗪等多种香气成分的功能，同时还能够代谢产生伊枯草菌素(Iturin)、芬介素(Fengycin)和表面活性素(Surfactin)等肽酯类抗生素，具有广谱抗菌性，同时该菌株具有极佳的耐盐性，因此非常适合作为食醋、酱油等发酵食品生产菌剂使用。

因此，本发明的又一具体实施方式中，上述微生物菌剂具体可以是病原菌抑制剂或增香/调香剂。

本发明的又一具体实施方式中，上述贝莱斯芽孢杆菌T-D-1或其发酵物或其代谢产物在如下1)-6)中全部或部分中的应用也是本发明保护的范围：

1)在抑制病原菌中的应用；

2)在制备病原菌抑制剂中的应用；

3)在增香和/或调香中的应用；

4)在制备增香/调香剂中的应用；

5)在发酵食品生产中的应用；

6)在制备发酵食品生产菌剂中的应用。

上文中，所述病原菌可以为食源性病原菌，包括食源性病原细菌和病原真菌，所述食源性病原细菌包括大肠杆菌和金黄色葡萄球菌；所述食源性病原真菌包括黄曲霉和赭曲霉。

所述发酵食品包括但不限于食醋、酱油、酱和白酒等。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种发酵食品进行发酵生产的方法，所述方法包括：在生产过程中施加上述贝莱斯芽孢杆菌T-D-1、上述贝莱斯芽孢杆菌T-D-1的发酵物、上述贝莱斯芽孢杆菌T-D-1的代谢产物和/或上述微生物菌剂。

需要说明的是，本发明的贝莱斯芽孢杆菌T-D-1还具有极佳的抗逆性，能够耐受高达15％的盐浓度，有利于其在传统发酵食品高盐的发酵生产环境中发挥作用。

所述发酵食品包括但不限于食醋、酱油、酱和白酒等。

以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中，LB培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母提取物5，氯化钠10，pH7.2；121℃灭菌20min；PDA培养基(g/L)：马铃薯200，葡萄糖20，琼脂15～20，121℃灭菌20min。实施例中供试病原菌均由山东省食品发酵工业研究设计院分离保存所有。

实施例1贝莱斯芽孢杆菌的分离、鉴定

以耐盐性(盐浓度2％)作为指标，从曲块中筛选出一株具有耐盐特性的菌株，命名为菌株T-D-1。经检测，其为革兰氏阳性菌，菌体短杆状，单个排列，不运动；菌落3-4mm，圆形，凸起，乳黄色，较粘稠，边缘整齐，无褶皱。对菌株T-D-1的16S rDNA序列进行测序，结合菌体形态特征和16S rDNA序列等，菌株T-D-1鉴定为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillusvelezensis)。

菌株T-D-1的16S rDNA序列如SEQ ID NO.7所示。

生物保藏说明如下：

菌株T-D-1，分类命名：贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，于该菌株已于2021年4月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，(地址：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学)，其生物保藏号为CCTCC NO：M 2021421。

实施例2贝莱斯芽孢杆菌的耐盐特性研究

为进一步研究该菌株的耐盐特性，取菌株T-D-1分别接种至含有1％-21％的NaCl的LB培养基中，28℃120rpm/min培养48h后观察各菌株在不同的盐浓度下的生长情况。结果如下表1所示。结果表明，菌株T-D-1具有极佳的耐盐特性，在盐浓度达到15％时，依然可以生长。远超一般芽孢杆菌的耐盐性，表明该菌株非常适于应用于酱油、酱等高盐发酵食品的生产。

表1贝莱斯芽孢杆菌T-D-1在不同浓度NaCl下的生长情况

注：“+”生长，“-”不生长。

实施例3贝莱斯芽孢杆菌抑菌能力测定

菌株T-D-1采用对峙培养法测定其抑菌活性，用灭菌打孔器打取已活化好的病原菌菌饼，先将病原菌菌饼接在新鲜的LB或PDA平板中央，再将拮抗菌贝莱斯芽孢杆菌T-D-1点接至菌饼旁，以仅接菌饼的平板为对照。放入30℃恒温培养箱倒置培养。结果显示菌株T-D-1对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌为代表的食源性病原细菌，以及黄曲霉和赭曲霉为代表的食源性病原真菌均具有显著的拮抗作用，结果见表2。考虑到上述食源性病原菌在食醋、酱油、酱等发酵食品生产中存在的可能性，因此将菌株T-D-1应用于上述发酵食品生产有助于抑制上述病原菌生长，减少内源危害物，提升发酵食品生产品质。

表2贝莱斯芽孢杆菌T-D-1对病原菌的抑菌效果

名称	抑菌圈直径(mm)
		大肠杆菌	14.57±0.52
金黄色葡萄球菌	16.45±0.68
		黄曲霉	24.25±1.63
赭曲霉	26.57±1.18

实施例4贝莱斯芽孢杆菌酯肽类成分基因扩增

使用柱式DNA提取试剂盒提取贝莱斯芽孢杆菌T-D-1菌株总DNA，扩增引物序列见下表3。采用PCR程序(反应条件：94℃5min，94℃1min；58℃30s，72℃1.5min，30个循环；72℃10min)进行扩增。扩增产物结果如图1所示，确认贝莱斯芽孢杆菌T-D-1含有ituA、fenB和srfAA等3个基因。从基因层面证明其含有伊枯草菌素、芬介素和表面活性素。

表3扩增ituA、fenB和srfAA的引物

实施例5贝莱斯芽孢杆菌产香气成分鉴定

取菌株T-D-1接种至LB培养基中，28℃120rpm/min培养48h，取上述发酵液以5000rpm离心5分钟，取上清液进行HPLC-MS分析。香气成分见表4。可见，该贝莱斯芽孢杆菌能够产出吡嗪类等众多香气成分，因此可作为增香/调香剂使用。

综上，本发明筛选到一株贝莱斯芽孢杆菌，其具有产吡嗪类香气成分的能力，且对多种食源性病原菌具有拮抗作用，从而减少内源危害物(如黄曲霉素、赭曲霉素等)的产生，同时具有极佳的耐盐性，因此特别适合作为食醋、酱油等传统发酵食品的生产菌剂使用。

最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。

SEQUENCE LISTING

<110> 山东省食品发酵工业研究设计院

<120> 一株贝莱斯芽孢杆菌及其应用

<130> 2010

<160> 7

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

attgccgagc gcatagaaca ga 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tggctaacac ggaaggaaga tt 22

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

tcggtttggg gcgtatttgc tt 22

<210> 4

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

gcggattttc atttgcctgt ca 22

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

tcgggacagg aagacatcat 20

<210> 6

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ccactcaaac ggataatcct ga 22

<210> 7

<211> 1427

<212> DNA

<213> 贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus aryabhattai）

<400> 7

ttcggcggct ggctccataa aggttacctc accgacttcg ggtgttacaa actctcgtgg 60

tgtgacgggc ggtgtgtaca aggcccggga acgtattcac cgcggcatgc tgatccgcga 120

ttactagcga ttccagcttc acgcagtcga gttgcagact gcgatccgaa ctgagaacag 180

atttgtggga ttggcttaac ctcgcggttt cgctgccctt tgttctgtcc attgtagcac 240

gtgtgtagcc caggtcataa ggggcatgat gatttgacgt catccccacc ttcctccggt 300

ttgtcaccgg cagtcacctt agagtgccca actgaatgct ggcaactaag atcaagggtt 360

gcgctcgttg cgggacttaa cccaacatct cacgacacga gctgacgaca accatgcacc 420

acctgtcact ctgcccccga aggggacgtc ctatctctag gattgtcaga ggatgtcaag 480

acctggtaag gttcttcgcg ttgcttcgaa ttaaaccaca tgctccaccg cttgtgcggg 540

cccccgtcaa ttcctttgag tttcagtctt gcgaccgtac tccccaggcg gagtgcttaa 600

tgcgttagct gcagcactaa ggggcggaaa ccccctaaca cttagcactc atcgtttacg 660

gcgtggacta ccagggtatc taatcctgtt cgctccccac gctttcgctc ctcagcgtca 720

gttacagacc agagagtcgc cttcgccact ggtgttcctc cacatctcta cgcatttcac 780

cgctacacgt ggaattccac tctcctcttc tgcactcaag ttccccagtt tccaatgacc 840

ctccccggtt gagccggggg ctttcacatc agacttaaga aaccgcctgc gagcccttta 900

cgcccaataa ttccggacaa cgcttgccac ctacgtatta ccgcggctgc tggcacgtag 960

ttagccgtgg ctttctggtt aggtaccgtc aaggtgccgc cctatttgaa cggcacttgt 1020

tcttccctaa caacagagct ttacgatccg aaaaccttca tcactcacgc ggcgttgctc 1080

cgtcagactt tcgtccattg cggaagattc cctactgctg cctcccgtag gagtctgggc 1140

cgtgtctcag tcccagtgtg gccgatcacc ctctcaggtc ggctacgcat cgttgccttg 1200

gtgagccgtt acctcaccaa ctagctaatg cgccgcgggt ccatctgtaa gtggtagccg 1260

aagccacctt ttatgtctga accatgcggt tcaaacaacc atccggtatt agccccggtt 1320

tcccggagtt atcccagtct tacaggcagg ttacccacgt gttactcacc cgtccgccgc 1380

taacatcagg gagcaagctc ccatctgtcc gctcgacttg catgtat 1427

Claims

1.一株贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）T-D-1，该菌株已于2021年4月21日保藏于中国典型培养物保藏中心，其生物保藏号为CCTCC NO：M2021421。

2.权利要求1所述贝莱斯芽孢杆菌T-D-1的发酵生产方法，其特征在于，所述发酵生产方法包括：将所述贝莱斯芽孢杆菌T-D-1接种至发酵培养基中进行发酵培养即得。

3.如权利要求2所述的发酵生产方法，其特征在于，发酵培养条件具体为：在26~30℃培养20~30h，转速：100-150rpm。

4.如权利要求3所述的发酵生产方法，其特征在于，发酵培养条件具体为：在为28℃培养24h，转速为120rpm。

5.如权利要求2所述的发酵生产方法，其特征在于，所述发酵培养基组成为LB培养基或NB培养基。

6.一种微生物菌剂，其特征在于，其含有权利要求1所述贝莱斯芽孢杆菌T-D-1。

7.权利要求1所述贝莱斯芽孢杆菌T-D-1在如下1）-2）任意一种中的应用：

1）在制备病原菌抑制剂中的应用；

2）在增香或调香中的应用；

所述病原菌为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、黄曲霉、赭曲霉。