CN110982760B - 一株贝莱斯芽孢杆菌及其在防治猪腹泻中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株贝莱斯芽孢杆菌及其在防治猪腹泻中的应用，本发明提供了一株贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus sp.)菌株LL2018013，将所述贝莱斯芽孢杆菌添加到断奶仔猪代乳品中，添加量为10⁷‑10⁹CFU/L，添加到其他生长期的猪饲料中，添加量为10⁶‑10⁸CFU/g。本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌能够提高猪肠道菌群的多样性，通过调剂菌群丰度，降低炎症因子，促进营养消化吸收，提高机体抗氧化能力，提高免疫力，提高对病毒的抵御能力，减少腹泻产生，能抑制常见的猪肠道病原菌大肠杆菌K88、鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌，降低腹泻率，提高日增重，能抑制饲料中的霉菌、提高机体对脂类的代谢效率，提高猪对饲料营养成分的消化吸收，同时均有降低粪便中药残的趋势。

Description

一株贝莱斯芽孢杆菌及其在防治猪腹泻中的应用

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株贝莱斯芽孢杆菌及其在防治 猪腹泻中的应用。

背景技术

当前，我国畜禽养殖随着畜牧业水平的提高，畜禽养殖业在我国的农业经济产业中起了重要的作用。随着产业的发展，抗生素、激素等药物带来了矛盾的现状，一方面带来丰厚的生产效益，如：促进生长，提高饲料报酬，降低发病率，另一方面则破坏菌群平衡，抑制免疫反应，抗生素的残留，动物排泄物中抗生素污染环境等问题，土壤环境恶化等等一系列反应。

猪是我国饲养量最大的家畜，猪腹泻是各个养猪场最担心的问题。导致猪腹泻的病因一般有传染性病因和非传染性病因，传染性病因包括病毒性腹泻、细菌性腹泻；非传染性病因主要是因为集约化养殖的猪自身抵抗力较低，对外界刺激比较敏感，当出现断奶、换饲料、天气变化、环境应激、过敏等诱因时，就会导致猪腹泻。传染性腹泻和非传染性腹泻互为因果，相互作用，交替重叠发生，使猪腹泻情况进一步恶化。一般来说，断奶应激对仔猪影响最大，7d早期断奶的仔猪腹泻比较容易死亡，其他生长期的猪腹泻轻则减重，拖累生产效率，重则死亡，是养猪场最为重视的疾病。

贝莱斯芽孢杆菌是芽孢杆菌属的一个新种,在农业生产上有促进植物生长和抵御病原微生物作用,具有广谱抗菌活性是一种新型的生物防治菌，目前主要应用于抑制植物病原菌的生长，具有良好的拮抗植物病原菌的作用。贝莱斯芽孢杆菌广泛存在于空气、土壤和水环境中，大部分关于贝莱斯芽孢杆菌的研究，都是从土壤中分离获得该菌菌株。近两年来，有少数研究发现，贝莱斯芽孢杆菌也可以从某些特定的动物肠道内分离到，比如公开号为 CN108676756B的中国专利《贝莱斯芽孢杆菌及其作为水产病原菌抑制剂的应用》，该贝莱斯芽孢杆菌就是从罗非鱼的肠道中分离获得；公布号为 CN110452848A的中国专利《一株贝莱斯芽孢杆菌及其应用》，该贝莱斯芽孢杆菌就是从梅花鹿粪便中分离获得，但是还未有报道将贝莱斯芽孢杆菌应用到猪的养殖生产上，也没有人分离到适合于用在猪养殖生产上的贝莱斯芽孢杆菌菌株。

发明内容

本发明的目的在于提供一株贝莱斯芽孢杆菌，这种贝莱斯芽孢杆菌具有 良好的生化防治猪腹泻的特性，可作为新型饲料添加剂，解决上述背景技术 中提出的问题。

本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus sp.)菌株LL2018013，于2019 年10月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：CGMCC NO.18711。

本发明所述贝莱斯芽孢杆菌在防治猪腹泻中的应用，将所述贝莱斯芽孢杆菌添加到断奶仔猪代乳品中，添加量为10⁷-10⁹CFU/L。

本发明所述贝莱斯芽孢杆菌在防治猪腹泻中的应用，将所述贝莱斯芽孢杆菌添加到其他生长期的猪饲料中，添加量为10⁶-10⁸CFU/g。

进一步，所述其他生长期的猪包括育成猪、育肥猪、妊娠母猪、围产期母猪、公猪。

进一步，用在哺乳仔猪代乳品中时，所述贝莱斯芽孢杆菌以新鲜菌液或干菌粉的形式添加到代乳品中。

进一步，用在其他生长期的猪饲料中时，所述贝莱斯芽孢杆菌以新鲜菌液或干菌粉的形式添加到饲料中。

进一步，所述新鲜菌液的制备方法为：将上述贝莱斯芽孢杆菌菌株 LL2018013按照体积百分比0.1％接种到LB液体培养基中，30～35℃培养20～24 h，获得新鲜菌液。

进一步，所述干菌粉的制备方法包括如下步骤：

1)菌体制备：将权利要求1所述贝莱斯芽孢杆菌菌株LL2018013按照体积百分比0.1％接种到LB液体培养基中，30～35℃培养20～24h，然后8000～10000 rpm离心获得菌体；

2)包埋：在上述菌体中加入适量纯化水混匀为泥状，与保护剂混匀后，再加入适量的纯化水，用包埋材料进行喷雾干燥，获得干菌粉；

其中，所述保护剂组分和比例为：脱脂奶粉10～20％、甘油2～5％、R3型抗性淀粉8～10％、维生素E1～2％、麦芽糊精3～5％、琼脂粉3～5％，其余为土豆抗性淀粉；所述包埋材料为土豆抗性淀粉，果胶，羟甲基纤维素钠，卡拉胶，将包埋材料按照1:1:1:1配制成5％的水溶液备用。

优选地，制备干菌粉时，所述菌体和保护剂的比例为：0.8～1:1～1.2。

优选地，所述干菌粉中贝莱斯芽孢杆菌的有效活菌数为10¹⁰～10¹¹CFU/g。

本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus sp.)菌株LL2018013，是从健康的迪庆藏猪的肠道中分离，经过筛选纯化培养后获得。

本发明的有益效果是：

1、提高肠道菌群多样性、减少腹泻：本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌能够提高猪肠道菌群的多样性，通过调剂菌群丰度，降低炎症因子，促进营养消化吸收。

2、提高机体抗氧化能力，提高免疫力：本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌能提高猪消化过程中的代谢产物——天竺葵素-3-槐糖苷和黑果酸，其中天竺葵素-3-槐糖苷是花青素的一种，主要作用为抗氧化剂，说明本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌能提高机体抗氧化能力，提高免疫力，提高对病毒的抵御能力，减少腹泻产生。

3、抑制肠道病原菌：本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌能抑制常见的猪肠道病原菌大肠杆菌K88、鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌，降低腹泻率，提高日增重。

4、提高对饲料营养的消化吸收：本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌能抑制饲料中的霉菌、提高机体对脂类的代谢效率，提高猪对饲料营养成分的消化吸收，同时均有降低粪便中药残的趋势。

5、使用范围广泛：本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌对营养和温度要求低，可耐受80℃高温，因此在饲料调制加工和使用过程中不容易死亡，具有广泛的使用范围。

附图说明

图1为芽孢杆菌菌株A1对鼠伤寒沙门氏菌的抑菌实验；

图2为芽孢杆菌菌株A1对大肠杆菌K88的抑菌实验；

图3为芽孢杆菌菌株A1对金黄色葡萄球菌的抑菌实验(打孔法)；

图4为芽孢杆菌菌株A1对金黄色葡萄球菌的抑菌实验(牛津杯法)；

图5为芽孢杆菌菌株A1的菌落形态图；

图6为芽孢杆菌菌株A1的800×显微镜检图；

图7为芽孢杆菌菌株A1的Gyr B和16S rDNA PCR产物电泳图；

图8为饲料中添加A1后猪肠道内微生物基于OUT水平的韦恩图分析；

图9为饲料中添加A1后猪肠道内微生物基于种水平的韦恩图分析；

图10为正负离子模式下猪粪便中差异代谢产物的聚类图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1：分离鉴定获得贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus sp.)菌株 LL2018013

步骤1)芽孢杆菌菌株的筛选

取迪庆藏猪小肠、盲肠及大肠内容物于灭菌生理盐水中(w/v＝1％)，充分震荡，80℃水浴10分钟，梯度稀释后，划板到LB固体培养基中培养，35℃培养12h后，挑取具有芽孢杆菌典型特征的单菌落纯化培养后获得芽孢杆菌。

步骤2)拮抗菌株的筛选

用步骤1)获得的芽孢杆菌制备为待测菌液，将大肠杆菌K88、鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌作为指示菌，用0.9％的盐水制得混悬菌液并调节浓度，加入到琼脂培养基中，制备约含有指示菌10⁵CFU/mL的琼脂平板，待冷却后，用凝胶打孔法在平板上打直径为4mm的孔径，加入待测菌液60uL，放置牛津杯，加入待测菌液60uL，35℃培养17h测定抑菌圈直径，综合挑选抑菌圈直径最大，抑菌圈边缘整齐的菌，命名为A1。A1的抑菌效果见图1-图4，小孔为打孔法测定，大孔为牛津杯法测定，均可见抑菌圈，测量抑菌圈直径，结果如表1：

表1 A1的抑菌效果

说明该芽孢杆菌菌株A1对大肠杆菌K88、鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄球菌都有抑菌效果，而且抑菌效果可靠。

步骤3)A1菌种的鉴定

1菌落形态

将A1接种在LB培养基中，经过35℃24h有氧培养后，菌落呈乳白色、类圆形，表面粗糙、边缘整齐，无色素沉着，容易挑起，有黏性。A1的菌落形态图见图5。

2革兰氏染色和显微镜检

革兰氏染色为阳性，菌体为杆状，单个或者两两呈现，有芽孢，见图6。

3生理生化

生理生化特性见下表：

表2 A1的生理生化鉴定

注：“+”为阳性反应，“～”为阴性反应

4 16S rDNA序列和GyrB序列分析

根据以上实验，将分离获得的芽孢杆菌菌株A1命名为贝莱斯芽孢杆菌 (Bacillussp.)菌株LL2018013，并提交保藏。

根据该贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus sp.)菌株LL2018013(A1)的gyr B 和16S rDNAPCR产物电泳图，见图7，基本推定所得到的条带是我们目的条带，比如16srDNA在1000kb和2000kb中间，说明条带大小也是在1500bp左右；gyrB基因则在1000kb条带左右，说明它的大小也是在1000bp左右将该贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus sp.)菌株LL2018013(A1)的16S rDNA序列和GyrB基因序列与GenBank中已知的序列进行Blast比对，结合生理生化、革兰氏染色，菌落形态等鉴定该菌株为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)。其中16S rDNA序列如SEQ ID NO:1所示，GyrB基因如SEQ ID NO:2所示。

实施例2断奶仔猪饲养实验

制备A1新鲜菌液：将上述贝莱斯芽孢杆菌菌株LL2018013按照体积百分比0.1％接种到LB液体培养基中，30～35℃培养20～24h，获得A1新鲜菌液。

饲养实验：选择迪庆藏猪7d断奶仔猪40头，随机分为两组，公母各半，试验组哺喂代乳品+A1新鲜菌液(10⁸CFU/L)，对照组哺喂代乳品，试验期为 21d，其中预试验7d，正试验14d，观察发病率和死亡率。

腹泻率＝腹泻头次数/(试验仔猪总数×正试验天数)×100％

表3断奶仔猪腹泻率与成活率

实施例3育成猪肠道菌群丰度试验

1)制备A1干菌粉：

将实施例1所述贝莱斯芽孢杆菌菌株LL2018013按照体积百分比0.1％接种到LB液体培养基中，35℃培养20h，然后10000rpm离心获得菌体；在上述菌体中加入适量纯化水混匀为泥状，与保护剂混匀后，再加入适量的纯化水，用包埋材料进行喷雾干燥，获得干菌粉；

其中，所述保护剂组分和比例为：脱脂奶粉15％、甘油5％、R3型抗性淀粉 8％、维生素E 2％、麦芽糊精3％、琼脂粉3％，其余为土豆抗性淀粉；所述包埋材料为土豆抗性淀粉，果胶，羟甲基纤维素钠，卡拉胶，将包埋材料按照 1:1:1:1配制成5％的水溶液备用。

所述菌体和保护剂的比例为：1:1.2。

所述干菌粉中贝莱斯芽孢杆菌的有效活菌数为10¹⁰～10¹¹CFU/g。

2)饲养实验：

试验在云南省畜牧兽医科学院进行，选择35.0Kg±1.0Kg的迪庆藏猪四元杂交猪20头，随机分为两组，公母各半，试验组饲喂基础日龄+A1干菌粉 (10⁷CFU/g)，对照组饲喂基础日粮。自由采食和饮水，常规免疫和驱虫，试验期内每天观察并记录仔猪的发病情况，试验期共21天(2019年8月24日 -2019年9月13日)，试验结束当天收集新鲜粪便，迅速放入液氮保存，进行多样性分析。

腹泻率＝腹泻猪头次数/(试验猪头数×试验天数)×100％

表4育成猪腹泻率与成活率

表5粪便成分分析％

3)饲养试验结果分析：

本试验地址选择在云南省畜牧兽医科学院(云南省昆明市盘龙区，东经 102°48'24”，北纬25°5'37”)，全试验期为21天(2019年8月24日 -2019年9月13日，此期间为阴雨季节，其中降雨天数占80.95％，多云天气占19.05％，平均温度为17.43℃～24.81℃，平均温差约为7.38℃)，此时期由于天气等原因，猪多发腹泻病。由表4中试验数据可以看出，本发明的添加剂能有效促进生长，提高日增重，降低猪腹泻。表5粪便成分分析结果显示，试验组粪便中水份显著降低，同时，粗脂肪和粗蛋白的含量也呈现下降趋势，粗灰分的含量升高，说明粪便中可消化的营养物质含量降低，由此可以分析，本发明添加剂能提高猪对饲料营养成分的消化吸收，提高日增重，降低腹泻率。

4)粪便微生物多样性分析：

4.1 OTU(Operational Taxonomic Units)是在系统发生学或群体遗传学研究中，为了便于进行分析，人为给某一个分类单元(品系，属，种、分组等)设置的统一标志。对实验组和对照组的猪粪便采用高通量测序技术分析，结果如下，基于OUT水平的图8的韦恩图分析结果显示，不管是否添加本发明的菌，实验猪肠道内OTU数为961，添加了干菌粉的试验组独有OTU数为125，未添加的对照组独有OTU数为52，试验组OTU数量较对照组多73, 而图9基于种水平的韦恩图分析显示，对照组细菌种类较试验组少7种，由此可看本发明的干菌粉添加剂可以提高猪肠道内细菌物种数量。

4.2 Alpha多样性是反映样品物种多样性的指标之一，其包括香农指数、 Ace指数、Chao指数和辛普森指数等。其中香农指数、Ace指数和Chao指数越高，辛普森指数越低，则物种的多样性则越高。从表6中可知试验组的的香农指数、Ace指数和Chao指数均高于对照组，辛普森指数则低于对照组，则说明试验组的微生物多样性较对照组高。

表6 Alpha多样性分析表

4.3属水平上的组间差异

粪便微生物属水平上的组间差异分析见表7。

表7微生物属水平上的相对丰度组间差异

萨特氏菌属(Sutterella)与猪腹泻呈正相关，从表7可见，本试验中试验组萨特氏菌属的相对丰度显著低于对照组。瘤胃菌属 (Ruminococcaceae_UCG-014)是肠道后段的优势菌，能够产生丁酸盐从而介导肠道的炎症反应，减少炎症的发生，并与纤维的降解呈正比，试验组的瘤胃菌属UCG-014较对照组极显著升高，说明本发明的菌株在降低炎症反应、促进营养消化吸收方面具有一定的潜力。Terrisporobacter(土孢杆菌属) 的相对丰度与补体C3呈反比，试验组中土孢杆菌属菌属相对丰度极显著降低，而补体C3与机体的防御机制密切相关，在疾病的条件下C3会出现下降的趋势，试验组中土孢杆菌属菌属相对丰度极显著降低说明补体C3显著升高，对提高机体防御能力有利。

因此，综上所述，本发明提供的贝莱斯芽孢杆菌能够提高猪肠道菌群的多样性，通过调剂菌群丰度，降低炎症因子，促进营养消化吸收。

实施例4育成猪粪便代谢物分析

采用非靶向代谢组学分析实施例3粪便样本中的差异代谢产物可知，在正负离子模式下，试验组的粪便样品中粪便检测出4748和5074种代谢物，其中阳离子条件下的差异代谢产物为237种，与对照组相比较，102种产物相对表达量上升，135种产物的相对表达量下降；阴离子条件下的差异代谢产物为 254种，其中112种产物相对表达量上种，142种产物的相对表达量下降，其中相对表达量前10的差异代谢物见表8，

表8正负离子模式下猪粪中相对表达量前10的差异代谢产物

B：试验组，C：对照组；FC：差异表达倍数

由表8可以看出天竺葵素-3-槐糖苷和黑果酸是正负离子模式下相对表达量最大的两个差异代谢产物，均属于极显著上调物质，其中天竺葵素-3-槐糖苷是花青素的一种，主要作用为抗氧化剂。黑果酸则为植物内生脱落酸的代谢产物。猪粪便中的化学药物中间体，如4-乙酰对氨基苯甲醛，对乙酰氨基苯甲醛，均呈现显著下调状态，吲哚-3-甲醇呈现下调状态，但差异不显著。说明添加A1后，有降低粪便中药残的趋势。黑麦酮酸为草酸青霉菌的代谢产物，试验组中黑莓酮酸呈现显著下调状态，间接说明A1有抑制黑麦青霉菌的趋势。猪粪便中与抗氧化相关的代谢物质，如N-阿魏酰基色胺、天竺葵素-3- 槐糖苷(差异极显著)呈现上调状态，与抗病毒相关代谢物质N-阿魏酰基色胺也呈现上调状态，说明添加A1后，具有增加猪抗病毒抗氧化的趋势。

差异代谢产物的聚类分析用于分析代谢产物的代谢模式，代谢模式相似或趋近的代谢产物具有趋同或相似的功能。

表9正负离子模式下猪粪中差异代谢产物的层级聚类热图数据表

如表9和对应的聚类图图10所示，试验组上调的代谢产物聚类在一起，下调的代谢产物聚类在一起，说明上调和下调的代谢物的表达模式是各不相同的。

实施例3中的猪粪便，用非靶向代谢组学中的KEEG通路富集分析得出的结果如表10所示：

表10正负离子模式下有差异的KEEG通路

由表10可知，代谢产物主要参与类固醇的生物合成、风湿性关节炎、β- 丙氨酸的代谢、维生素的代谢吸收、组氨酸的代谢、烟酸和烟酰胺的代谢、生物素的代谢、苯丙氨酸的代谢、色氨酸的代谢、氨基糖和核苷酸糖的代谢和α-亚麻酸的代谢，其中与类固醇的生物合成、风湿性关节炎和α-亚麻酸的代谢显著相关，由此可见，A1与脂类的代谢显著相关。

对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

序列表

<110> 云南省畜牧兽医科学院

<120> 一株贝莱斯芽孢杆菌及其在防治猪腹泻中的应用株

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1429

<212> DNA

<213> 贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus sp.)

<400> 1

tacatgcaag tcgagcggac agatgggagc ttgctccctg atgttagcgg cggacgggtg 60

agtaacacgt gggtaacctg cctgtaagac tgggataact ccgggaaacc ggggctaata 120

ccggatggtt gtttgaaccg catggttcag acataaaagg tggcttcggc taccacttac 180

agatggaccc gcggcgcatt agctagttgg tgaggtaacg gctcaccaag gcgacgatgc 240

gtagccgacc tgagagggtg atcggccaca ctgggactga gacacggccc agactcctac 300

gggaggcagc agtagggaat cttccgcaat ggacgaaagt ctgacggagc aacgccgcgt 360

gagtgatgaa ggttttcgga tcgtaaagct ctgttgttag ggaagaacaa gtgccgttca 420

aatagggcgg caccttgacg gtacctaacc agaaagccac ggctaactac gtgccagcag 480

ccgcggtaat acgtaggtgg caagcgttgt ccggaattat tgggcgtaaa gggctcgcag 540

gcggtttctt aagtctgatg tgaaagcccc cggctcaacc ggggagggtc attggaaact 600

gggggaactt gagtgcagaa gaggagagtg gaattccacg tgtagcggtg aaatgcgtag 660

agatgtggag gaacaccagt ggcgaaggcg actctctggt ctgtaactga cgctgaggag 720

cgaaagcgtg gggagcgaac aggattagat accctggtag tccacgccgt aaacgatgag 780

tgctaagtgt tagggggttt ccgcccctta gtgctgcagc taacgcatta agcactccgc 840

ctggggagta cggtcgcaag actgaaactc aaaggaattg acgggggccc gcacaagcgg 900

tggagcatgt ggtttaattc gaagcaacgc gaagaacctt accaggtctt gacatcctct 960

gacaatccta gagataggac gtccccttcg ggggcagagt gacaggtggt gcatggttgt 1020

cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac ccttgatctt 1080

agttgccagc attcagttgg gcactctaag gtgactgccg gtgacaaacc ggaggaaggt 1140

ggggatgacg tcaaatcatc atgcccctta tgacctgggc tacacacgtg ctacaatgga 1200

cagaacaaag ggcagcgaaa ccgcgaggtt aagccaatcc cacaaatctg ttctcagttc 1260

ggatcgcagt ctgcaactcg actgcgtgaa gctggaatcg ctagtaatcg cggatcagca 1320

tgccgcggtg aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacca cgagagtttg 1380

taacacccga agtcggtgag gtaacctttt aggagccagc cgccgaagg 1429

<210> 2

<211> 980

<212> DNA

<213> 贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus sp.)

<400> 2

gattgacctc atgtttgaga gaatcttatc aagtttggct ttctcaacgt tcagaatttt 60

accgcgcagc ggcagaatgg cttggaaatg acggtcccgt ccctgtttcg ctgatccgcc 120

cgcagagtca ccctctacga tatacagctc ggaaatgctc ggatctttag aagaacagtc 180

cgccagtttg cccggcagat tggaaatctc aagcgcactt ttgcgccggg tcaattcccg 240

cgcttttttc gccgccatcc gcgctcttgc ggccattaaa cctttttcaa cgattttgcg 300

ggctgagtcc ggattttcaa gaaggaatgt ttccagcgca gaagaaaaca gcgtatcagt 360

gatcgttctc gcttcggagt tgccgagctt cgttttcgtc tgcccttcga attgcggatc 420

agggtgctta attgaaataa tggcagtcag cccttctctc acatcatccc cgcttaaatt 480

cggatcattt tctttgaaaa tcccctttct tcttgcatag tcgtttatga cacgggtcag 540

accggtttta aatccggcct cgtgcgtgcc gccttcgtat gtgttgatat tatttgtgaa 600

agaataaata ttgcttgtat agctgtcgtt gtattgcaat gcaacttcaa ccgttatgcc 660

gtctttctcg ccttcgatat aaatcggctc ttcatgaacg acttctttgg aacggtttaa 720

gtactcaaca tagcttttga ttccgccttt gtagtggtac tcgtttttcc gttcttgtcc 780

ttcacgtttg tcttcaatcg tgatgtttac gccttttgtc aggaaggcca attcccggac 840

acggtttgaa agcagatcat agtcatatac agttgtttct ttgaaaattt ccgggtccgg 900

aacgaagtgc gtaatcgttc cggtcttatc agtttcgccg atcacttcaa gatcagccac 960

aggtacaccg cgctcgtacg 980

Claims (7)

1.一种可以提高藏猪肠道微生物多样性的贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）菌株 LL2018013，于2019年10月21日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC NO.18711。

2.一种贝莱斯芽孢杆菌在断奶仔猪代乳品中的应用，其特征在于，将权利要求1所述贝莱斯芽孢杆菌添加到断奶仔猪代乳品中，添加量为10⁷-10⁹CFU/L。

3.一种贝莱斯芽孢杆菌在猪饲料中的应用，其特征在于，将权利要求1所述贝莱斯芽孢杆菌添加到育成猪、育肥猪、妊娠母猪、围产期母猪或公猪的猪饲料中，添加量为10⁶-10⁸CFU/g。

4.根据权利要求2所述贝莱斯芽孢杆菌在断奶仔猪代乳品中的应用，其特征在于，所述贝莱斯芽孢杆菌以新鲜菌液或干菌粉的形式添加到代乳品中。

5.根据权利要求3所述贝莱斯芽孢杆菌在猪饲料中的应用，其特征在于，所述贝莱斯芽孢杆菌以新鲜菌液或干菌粉的形式添加到饲料中。

6.据权利要求4或5所述贝莱斯芽孢杆菌的应用，其特征在于，所述新鲜菌液的制备方法为：将权利要求1所述贝莱斯芽孢杆菌菌株 LL2018013按照体积百分比0.1%接种到LB液体培养基中，30~35℃培养20~24 h，获得新鲜菌液。

7.根据权利要求4或5所述贝莱斯芽孢杆菌的应用，其特征在于，所述干菌粉的制备方法包括如下步骤：

菌体制备：将权利要求1所述贝莱斯芽孢杆菌菌株 LL2018013按照体积百分比0.1%接种到LB液体培养基中，30~35℃培养20~24 h，然后8000~10000 rpm离心获得菌体；

包埋：在上述菌体中加入适量纯化水混匀为泥状，与保护剂混匀后，再加入适量的纯化水，用包埋材料进行喷雾干燥，获得干菌粉；

其中，所述保护剂组分和比例为：脱脂奶粉10~20%、甘油2~5%、R3型抗性淀粉8~10%、维生素E 1~2%、麦芽糊精3~5%、琼脂粉3~5%，其余为土豆抗性淀粉；所述包埋材料为土豆抗性淀粉，果胶，羟甲基纤维素钠，卡拉胶，将包埋材料按照1:1:1:1配制成5%的水溶液备用；

所述菌体和保护剂的比例为：0.8~1:1~1.2；

所述干菌粉中贝莱斯芽孢杆菌的有效活菌数为10¹⁰~10¹¹CFU/g。

Images