CN113943679B - 一株羊鼻腔源贝莱斯芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株羊鼻腔源贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）及其应用。本发明涉及的贝莱斯芽孢杆菌，属于芽孢杆菌属，并命名为NSV2，保藏编号为CGMCC No.20345。本发明菌株不仅可以抑制病原菌的生长，还可以抑制伪狂犬病毒（PRV）的感染，抑制率达到50%以上；并通过研究其抗病毒机制分离和鉴定到其代谢产物表面活性素，贝莱斯芽孢杆菌NSV2分泌的表面活性素既可以抑制PRV的感染也能够有效抑制流行性腹泻病毒（PEDV）的感染；最后通过构建羊贝莱斯芽孢杆菌‑羊鼻腔黏膜外植体免疫刺激模型，发现该菌株可以诱导先天免疫因子的表达，提高鼻腔先天免疫能力。综上，该贝莱斯芽孢杆菌菌株NSV2有望开发为增强羊鼻腔黏膜先天性免疫，抵御病原微生物入侵的呼吸道益生菌制剂。

Description

一株羊鼻腔源贝莱斯芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及微生物学以及分子生物学领域，属于生物防控技术领域，尤其涉及一株羊鼻腔源贝莱斯芽孢杆菌在抵抗病毒感染和提高羊鼻腔黏膜先天免疫力中的应用。

背景技术

1、羊鼻腔传染病的研究现状

羊的呼吸道是疾病的重要感染通道，目前在羊上主要的可以经呼吸道传播的病毒有伪狂犬病毒（Pseudorabies virus，PRV）、口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease virus，FMDV）、小反刍兽疫病毒（Peste des Petits Ruminants virus，PPR）、狂犬病毒（Rabiesvirus，RV）、绵羊肺腺瘤病病毒（Sheep pulmonary adenomatosisvirus，SPAS）、山羊三型副流感病毒（caprine parainfluenza virus type 3，CPIV3）、山羊痘病毒（Goatcapripoxvirus，GPV）、山羊关节炎-脑炎病毒（caprine arthritis-encephalitisvirus,CAEV）等，病原菌有多杀性巴氏杆菌、溶血曼氏杆菌、绿脓杆菌和链球菌等，此外还有一些支原体感染如：丝状支原体山羊亚种、山羊支原体山羊亚种以及绵羊肺炎支原体。并且，羊由呼吸道传染或发病的病原治疗困难，多为动物群体的常发病，影响羊只的健康养殖，造成经济损失。本实验室在对2020年江苏省13个地区规模化养猪场的流行病学调查发现，在健康羊群的鼻腔黏膜中能够检测到溶血曼氏杆菌（阳性率：89%）、绵羊肺炎支原体（阳性率：35.7%）、多杀性巴氏杆菌（阳性率：35.7%）、链球菌（阳性率：36.9%）和CPIV3（阳性率：2.4%）等病原的分布。而这些样本大部分为多病原的混合感染，这对传染病的流行和暴发构成极大的隐患。

2、羊鼻腔菌群的分布研究

鼻腔当中存在大量微生物，这些微生物不仅能够与鼻腔黏膜相互作用，影响疫苗的免疫效果，还可以影响宿主鼻腔的先天免疫应答，影响呼吸道的健康。研究表明，对野生绵羊的需氧菌群进行分离，共得到281株菌株，其中107株为革兰氏阳性菌，174株为革兰氏阴性菌，在革兰氏阳性菌中有36%为芽孢杆菌。而健康的绵羊与患肺炎的绵羊相比鼻腔中其病原菌如：溶血性支原体、多杀性巴氏杆菌、放线杆菌和梭菌等分离比率更高。对家养绵羊和野生的大角羊鼻腔微生物进行分离，共鉴定到了194株菌株，其中101株来自野生大角羊，93株来自家养绵羊。其中115株为革兰氏阳性菌，79株为革兰氏阴性菌。而葡萄球菌是数量是分离到的最多的革兰氏阳性菌，并且在家养绵羊样品中的发病率高于大角羊。这可能是因为野外放养或者野生的羊群与自然环境中的微生物接触更频繁，更多的益微有生物进入并定植于鼻腔前庭中，诱导鼻腔黏膜产生高水平的先天性免疫保护力。并且有研究报道对野生大角羊和和家养绵羊同时进行疫苗免疫，野生的大角羊抗体水平较家养绵羊更高。由此我们拟从放养羊群中分离一种益生菌可以定植在羊的鼻腔，提高羊鼻腔先天免疫力，抵御病原微生物入侵。

3、贝莱斯特芽孢杆菌作为益生菌的研究现状和应用

贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）属于芽孢杆菌属，可以抵御病原微生物，并且是一种具有广谱抗菌活性的新型生物防治菌，目前主要应用于抑制植物病原菌的生长，具有良好的拮抗植物病原菌的作用。贝莱斯芽孢杆菌广泛存在于空气、土壤和水环境中，大部分关于贝莱斯芽孢杆菌的研究，都是从土壤中分离获得该菌菌株。近年来，有研究发现，贝莱斯芽孢杆菌也可以从某些特定的动物肠道内分离到。并且在生产应用上可以通过在水产动物饲料中添贝莱斯特芽孢杆菌可以控制链球菌感染、增强先天免疫因子的表达并提高存活率。在猪、小鸡、鼠和鱼的饲料中添加贝莱斯特芽孢杆菌可以改善肠道健康，提高免疫力。在牛上使用枯草芽孢杆菌配合口蹄疫灭活病毒在鼻腔进行免疫可以有效的提高牛呼吸道先天免疫力。但由于鼻腔黏膜物理屏障的存在如黏液的分泌，导致一些枯草芽孢杆菌进入鼻腔后难以在黏膜处定植，无法维持长效的免疫增强作用。因此从放养的羊群鼻腔中筛选具有鼻腔黏膜定植能力、并能分泌表面活性素诱导鼻腔黏膜先天免疫反应的贝莱斯芽孢杆菌，作为一种益生菌制剂，将为有效抵御病毒经鼻腔感染提供一种可靠和有效的方法。

4、鼻腔黏膜研究瓶颈以及鼻腔黏膜外植体培养的优势及其应用

目前，国内外先天免疫的研究多采用细胞模型和体内动物模型，但是最广泛使用的分离细胞培养的实验模型不能再现我们在体内观察到的黏膜形态，也不能再现炎症机制的整体复杂性，而体内实验成本高，重复性差。而外置体培养模型相对于传统的细胞实验和体内实验模型具有不可替代的重要优势。外植体培养模型具有反应的特异性、保存了不同细胞之间的相互作用、可以在疾病的不同阶段进行研究并且具有获得原代细胞培养系得可能性。黏膜内产生免疫反应的复杂性只能通过复杂的实验模型进行研究，如活体动物模型或黏膜外置培养模型。早在1969年就有了长达24小时的人体黏膜组织得培养，而目前对于黏膜外植体培养已经涉及鼻腔、口腔、肠道和生殖道等，且外植体的培养时间状态均显著提升。有研究建立人类巨细胞病毒（HCMV）感染的黏膜外植体模型，用以探索HCMV在早期感染阶段的特点，并且此模型有助于评估针对HCMV水平传播的新干预措施，但是这些研究培养时间较短，可靠性低。不能在体外长时间观察病原微生物或者药品对外植体的影响。而羊鼻腔后侧的黏膜有大量的上皮内淋巴细胞和淋巴组织，是有效的免疫诱导位点。因此我们拟建立羊鼻腔黏膜可靠和有效的培养模型，用于评估益生菌对黏膜免疫的影响。

发明内容

发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了一株羊鼻腔源贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）NSV2，该贝莱斯芽孢杆菌具有良好的抗病毒、抗细菌和提高鼻腔先天免疫能力的特点，可作为一种新型的呼吸道益生菌制剂。

本发明还要解决的技术问题是提供了该贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）NSV2在制备抗病毒制剂或益生菌中的应用。

技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了一株贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）NSV2，所述贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）NSV2于2020年7月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.20345，分类命名为：贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis），保藏地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编：100101。

本发明内容还包括所述的贝莱斯芽孢杆菌NSV2在制备抗病原微生物制剂中的应用。

其中，所述病原微生物为抵抗伪狂犬病毒、多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌、流行性腹泻病毒中的一种或几种。

本发明内容还包括所述的贝莱斯芽孢杆菌NSV2在制备益生菌制剂中的应用。

本发明内容还包括抗病原微生物制剂或益生菌制剂，其分别含有所述的贝莱斯芽孢杆菌NSV2或其培养的产物、发酵培养液或发酵培养液的过滤液。

本发明所述的抗病原微生物制剂或所述的益生菌制剂，其剂型为口服液、喷剂或粉剂中的一种。

本发明内容还包括一种贝莱斯特芽孢杆菌-羊鼻腔黏膜外植体的免疫刺激模型，其含有所述的贝莱斯芽孢杆菌NSV2或其培养的产物、发酵培养液或发酵培养液的过滤液。

其中，所述模型是将羊鼻腔黏膜上皮进行气液培养，用所述的贝莱斯芽孢杆菌NSV2共培养获得。

本发明内容还包括所述贝莱斯特芽孢杆菌-羊鼻腔黏膜外植体的免疫刺激模型的构建方法，包括以下步骤：

1）羊鼻腔黏膜上的皮分离和气液培养的建立；

2）贝莱斯特芽孢杆菌-羊鼻腔黏膜外植体的免疫刺激模型建立。

有益效果：本发明的贝莱斯芽孢杆菌NSV2细菌菌株具有已被证明可以刺激鼻腔黏膜外植体先天免疫因子IL1、IL6和CCL20等产生的能力，并且可以分泌表面活性素，并因此显示出显著的抵抗PRV和PEDV的能力。此外贝莱斯芽孢杆菌NSV2细菌菌株还可以抑制呼吸道病原菌多杀性巴氏杆菌和金黄色葡萄球菌。因此本发明的贝莱斯芽孢杆菌NSV2细菌菌株显示出良好的免疫调节活性。

附图说明

图1：贝莱斯芽孢杆菌NSV2的分离鉴定。A：在LB培养基上的菌落形态；B：革兰氏染色过的细菌形态；C：16S rDNA序列的进化树分析；D：全基因组变异图谱，由外到里，分别是样品的InDel分布、SNP个数分布、reads覆盖深度、参考序列基因组GC含量、参考序列基因组GC skew值分布。

图2：牛津杯法验证对多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌和链球菌的抗菌作用，表一中统计了抑菌圈的大小。

图3：贝莱斯特芽孢杆菌NSV2对细胞活力的影响。

图4：贝莱斯特芽孢杆菌NSV2对PRV的抑制作用。A：试验设计三种处理方式贝莱斯特芽孢杆菌NSV2与细胞共孵育12h洗去接毒、贝莱斯特芽孢杆菌与病毒和细胞共孵育1h洗去以及接毒后与贝莱斯特芽孢杆菌共孵育12h；B和C在PK15细胞上进行定量和WB验证；D对图CWB条带进行灰度值分析的统计图，E图在STEC细胞上进行定量和WB验证，F图在VERO细胞上进行定量和WB验证；G：MOI=1时在PK15细胞上对PRV的抑制作用。

图5：免疫荧光检测对PRV的抑制作用。

图6：贝莱斯特芽孢杆菌NSV2对PRV的抑制特点。A和B：感染后收集0h、2h、4h、6h、12h和24hRNA水平定量检测病毒含量；C：感染后收集0h、2h、4h、6h、12h和24h蛋白水平检测病毒含量；D：贝莱斯特芽孢杆菌NSV2预处理12h后洗去，4℃与PRV孵育1.5h后收样；E：荧光定量检测其对PRV病毒的吸附含量。

图7：贝莱斯特芽孢杆菌NSV2分泌表面活性素的提取和鉴定。A：表面活性素的分子式；B：提取表面活性素固体以及甲醇溶解图；C：表面活性素标准品质谱图谱；D：贝莱斯特芽孢杆菌NSV2表面活性素提纯品质谱图谱。横坐标为荷质比，纵坐标为信号强度。主峰上标注了分子量与对应的表面活性素的粒子形式；E：提取的表面活性素质谱峰的统计。

图8：表面活性素对PRV的抑制作用。A和B：表面活性素对细胞的毒性检测；C、和D：定量和Western blot检测对PRV的抑制作用；E：在气管上皮细胞上贝莱斯特芽孢杆菌对PRV的抑制作用；F和G：定量和Western blot检测不同浓度表面活性素对PRV的抑制作用。

图9：免疫荧光检测贝莱斯特芽孢杆菌NSV2表面活性素对PRV的抑制作用。

图10：贝莱斯特芽孢杆菌NSV2表面活性素对PEDV的抑制作用。A：对细胞毒性的检测；B：荧光定量检测表面活性素对PEDV的抑制效果；C：WB检测表面活性素对PEDV的抑制效果；D：对图CWB检测结果进行灰度值分析的统计图；E：收集了表面活性素对PEDV的抑制的上清进行了空斑检测抗PEDV效果；F：对图E空斑结果数量的统计图。

图11：羊鼻腔黏膜外植体培养模型的建立。A：羊鼻腔黏膜的采集和在小室中培养；B：黏膜外植体的培养模式图；C：HE染色检测培养不同时间的黏膜外植体形态；D：Westernblot检测培养不同时间点的鼻腔黏膜组织凋亡水平；E：Western blot检测培养不同时间点的鼻腔黏膜组织增殖水平。

图12：贝莱斯特芽孢杆菌NSV2对羊鼻腔黏膜外植体的先天免疫水平的影响。A：贝莱斯特芽孢杆菌对羊鼻腔黏膜外植体的刺激模型；B：定量检测贝莱斯特芽孢杆菌NSV2对羊鼻腔黏膜外植体先天免疫因子表达的影响。

图13：ELISA检测贝莱斯特芽孢杆菌对羊鼻腔黏膜外植体IL6（图13A）和CLL20（图13B）的影响。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。具体涉及的材料、试剂和方法如下：

实施例1：分离鉴定贝莱斯芽孢杆菌NSV2细菌菌株

1.1样品采集

选取来自于江苏省南京市某葡萄园散放健康羊群，用无菌棉拭子插入鼻腔中约10cm以上，反复转动采集鼻腔粘液。采集完成后迅速放入无菌采样管当中，做好标记，4℃带回实验室。

参考GB/T 1.1-2009分离猪鼻腔拭子中的芽孢杆菌，具体步骤如下：1）超净台中无菌打开装有鼻拭子的离心管，每管加入500 μL的PBS溶液，随后反复振荡离心管三次，每次振荡15s后，放入4℃冰箱静置15 min；2）打开离心管，用镊子将拭子残留的浸出液挤入离心管内，80℃水浴加热15min；3）吸取100 μL浸出液转移至LB液体中，37℃，200 rpm培养过夜；4）对菌液进行梯度稀释后，吸取菌液至LB固体平板培养基中，均匀涂布后，于37℃温箱内倒置培养12-16h，直至长出单菌落。

贝莱斯芽孢杆菌在LB平板上菌落呈乳白色、类圆形，表面粗糙、边缘参差不齐，无色素沉着，容易挑起，有黏性。NSV2的菌落形态图（图1A），革兰氏染色为阳性（图1B），菌体为杆状，单个或者两两呈现，有芽孢。

1.2贝莱斯芽孢杆菌NSV2的分子鉴定

根据菌落形态以及革兰氏染色结果选取疑似单菌落，制备菌落悬液后（麦氏比浊度=0.5）后，以16S rDNA通用引物27F和1492R为上下游引物，进行PCR扩增。

引物序列如下：

27F: AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，

1492R: TACCTTGTTACGACTT

引物由上海生工生物合成，细菌基因组直接使用天根细菌基因组提取试剂盒（DP302），参考说明书提取贝莱斯芽孢杆菌NSV2细菌基因组。反应采用25 μl体系（12.5 μlTaq PCR Master Mix（Takara，中国），2 μl模板DNA（贝莱斯芽孢杆菌NSV2细菌基因组），上下游引物各1 μl，8.5 μl ddH₂O）在PCR仪（Eppendorf，美国）进行，反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，35个循环；72℃延伸5 min。PCR产物经1%的琼脂糖凝胶电泳，可见目的片段大小为：1398bp。PCR扩增产物送上海生工生物工程股份有限公司进行测序，PCR产物测序所得的SEQ ID NO:1序列经NCBI Blast比对，综合贝莱斯芽孢杆菌NSV2的菌落和革兰氏染色特点特性及16S rDNA序列分析结果从而确定为贝莱斯芽孢杆菌NSV2，该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.20345。

1.3贝莱斯芽孢杆菌NSV2的进化树制作

对于步骤2测序结果，在NCBI进行比，选取序列相似性前10的菌种，制作进化树（图1C），由图可见，贝莱斯特芽孢杆菌NSV2与Bacillusvelezensisstrain CBMB205 16S序列相似性达到100%。

1.4贝莱斯芽孢杆菌NSV2的全基因组重测序分析

将分离到的贝莱斯特芽孢杆菌NSV2，摇菌后，浓缩，总菌液送至北京诺禾致源生物信息科技有限公司。整个基因组的变异图谱由Circos（V0.64，http://circos.ca/）显示阅读覆盖率以及SNP和InDel信息的分布（图1D）。结果表明，贝莱斯特芽孢杆菌NSV2与参考基因组相比突变多，可能是鼻腔微生物长期进化的特点。

1.5贝莱斯特芽孢杆菌NSV2的抑菌作用

菌种活化平板划线后，用牙签挑取单菌落（贝莱斯芽孢杆菌NSV2）放入装有5 mLLB液体培养基的管试中，并于摇床内37℃、220 rpm振荡培养12-16 h备用。超净工作台内，向每个灭菌培养皿中倾注10 mL-15 mL的高压灭菌过的素琼脂（1.5%琼脂）进行铺底，每个培养皿厚度均一，待素琼脂冷却凝固后，备用。吸取20 μL~30 μL金黄色葡萄球菌液加入到100 mL恒温至50±5℃的LB固体培养基中，轻轻摇匀（避免起泡）。将上述加过菌液的固体培养基倒入铺过素琼脂的培养皿中，每个平皿倒5-7mL，该层一定要均匀铺平，待其冷却凝固。用镊子夹取牛津杯放在制好的抑菌圈培养皿内，并在培养皿外延做好标记。吸取浓度10⁶、10⁷和10⁸每毫升的贝莱斯芽孢杆菌NSV2菌液150μL，注入到相应的牛津杯内。将培养皿移入37℃培养箱培养。在接下来的6~12h内观察菌体的生长情况及抑菌效果。由图2可见NSV2对多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌有显著的抑制作用。图2中的表一统计了抑菌圈的大小，其中对多杀性巴氏杆菌的抑菌圈最大，表明抑制效果最明显。

实施例2：贝莱斯芽孢杆菌NSV2抗病毒作用

2.1贝莱斯芽孢杆菌NSV2及其分泌产物对细胞毒性评价

试验前一天接种100μL 10⁸/mL新鲜贝莱斯芽孢杆菌NSV2菌液至液体5mL LB培养基中，37℃ 220rpm 培养12-16h。300g离心10min分别收集上清和细菌沉淀。细菌用PBS洗三遍，计数后用培养基稀释至10⁴，10⁵，10⁶，10⁷和10⁸，备用。上清再次高速离心（10000g，10min），再次收集上清并用0.22μM滤膜过滤，并按比例稀释至100%，50%，25%，5%和1%，备用。将上述稀释好的待测物分别加入，培养至铺满90%的单层的96孔板的VERO细胞上，每个浓度设5个重复，并同时设置空白孔，对照孔。37℃、5%CO2培养箱中培养2 h后洗涤，加入10μLCCK8试剂，继续培养1-4小时。用酶标仪读取OD560。结果表示为试验组与空白组数据的百分比值。细胞毒性=（对照组OD450-处理组OD450）/（对照组OD450-空白组OD450）×100%。如图3（A、B和C）。与VERO细胞相同的操作，同时检测贝莱斯芽孢杆菌NSV2及其分泌产物对PK15（猪肾细胞）和STEC（猪气管上皮细胞）的细胞毒性影响。试验结果表明：10⁸-10⁴浓度的NSV2对PK15和VERO细胞活力并显著影响，并且100%-1%的NSV2培养上清对VERO和STEC细胞活力也并无显著影响。

2.2贝莱斯特芽孢杆菌NSV2对PRV的抑制作用

以下操作均使用贝莱斯特芽孢杆菌NSV210⁶/ml为处理浓度，按图4A所示，试验设计的三种处理方式：

预处理组：贝莱斯特芽孢杆菌NSV2500μL分别与汇合度90%的PK15细胞共孵育12h以后，吸去菌液，加入空培养基轻轻摇晃，弃掉，重复三次，以此去除残余的贝莱斯特芽孢杆菌NSV2，接种PRV病毒1h（MOI=0.1/1），吸去用空培养基洗去未吸附的PRV，加维持液500μL（2%FBS+1%青霉素链霉素的DMEM培养基），12h以后收样；

共孵育组：贝莱斯特芽孢杆菌NSV2与PRV和细胞汇合度90%的PK15细胞三者共孵育（MOI=0.1）1h，吸去PRV和细菌孵育液，加入空培养基轻轻摇晃，弃掉，重复三次，以此去除残余的贝莱斯特芽孢杆菌NSV2，加维持液500μL，12h以后收样；

后处理组：汇合度90%的PK15细胞接种PRV 1h后（MOI=0.1），吸去PRV孵育液，加入空培养基轻轻摇晃，弃掉，重复三次，再添加贝莱斯特芽孢杆菌NSV2500μL，共孵育12h后收样。

与上述PK15细胞三种处理方式相同的操作，同时检测贝莱斯芽孢杆菌NSV2在VERO和STEC细胞上发挥的抗病毒作用。

预处理组、共孵育组和后处理组的蛋白样使用RIPA裂解液+1%PMSF混合液进行裂解，反复吹打细胞收集到1.5ml离心管中，再加入5x蛋白上样缓冲液，混匀后，沸水中变性15min。然后进行蛋白免疫印迹试验（Western blot），检测PRV的含量。

预处理组、共孵育组和后处理组的蛋白样的RNA样使用TRIZOL裂解液收集，将裂解液加入细胞种反复吹打后收集到1.5mL离心管中，加入200μL氯仿，混匀后4℃12000g离心15min，收集上清于新的1.5mL离心管中，加入等体积异丙醇，涡旋振荡混匀，4℃12000g离心10min，弃去上清，加入500μL 预冷75% 无水乙醇进行洗涤，混匀后，离心5min，弃去上清，重复洗涤步骤一次。弃去上清，晾干，加入20-30μL DEPC水，溶解，测定浓度，使用TakaraRR036TA反转录试剂盒进行反转录。荧光定量使用Takara DRR420A试剂盒进行检测，试验步骤参考其说明书进行，结果使用EXCEL和SPSS软件进行计算。

荧光定量引物序列如下：

PRV-gB -F：GTCCGTGAAGCGGTTCGTGAT

PRV-gB-R：ACAAGTTCAAGGCCCACATCTAC

GAPDH-pig-F：TCATCATCTCTGCCCCTTCT

GAPDH-pig-R：GTCATGAGTCCCTCCACGAT

GAPDH-Monkey-F：ACATCATCCCTGCCTCTACTG

GAPDH-Monkey-R：CCTGCTTCACCACCTTCTTG

结果表明：在PK15细胞上预处理和后处理组抗病毒效果显著（P<0.05）（图4B,C和D），抑制率达到50%以上。在气管上皮细胞和VERO细胞上也有相似的显著抗病毒作用（P<0.05）（图4E和F）。而在MOI=1时这种对病毒的抑制作用依然显著（P<0.05）（图4G）。

进一步使用免疫荧光进一步验证贝莱斯特芽孢杆菌NSV2对PRV的抑制作用。将培养好的PK15细胞，用0.25%的胰酶消化后，重悬，铺加在24孔板中的爬片上，待细胞汇合度长至85%左右时，参考试验处理方法参考实施例2，步骤2.2，开展试验。收样使用4%多聚甲醛固定液固定，每孔添加300μL，固定2h，PBS漂洗5min 3次，0.5% Triton穿孔15min；PBS漂洗3次，每次5min；BSA封闭30min；加入PBS稀释的一抗，于4℃杂交过夜，PBS漂洗3次，每次5min；加入PBS稀释的二抗，于37℃杂交1h；PBS漂洗3次，每次5min；DAPI染色10min；抗淬灭封片剂封片，共聚焦显微镜观察。图5结果表明：与对照组相比预处理组和后处理组荧光强度较弱，而共孵育组无显著的变化。

实施例3：贝莱斯特芽孢杆菌NSV2抑制PRV感染的作用特点

试验处理方法参考实施例2，步骤2.2的预处理组。贝莱斯特芽孢杆菌NSV2预处理PK15细胞后收集0h、2h、4h、6h、12h和24h蛋白和RNA样品。检测步骤参考实施例2的2.2。经Western blot和荧光定量检测贝莱斯特芽孢杆菌NSV2预处理后，PRV在6h开始出现显著降低（P<0.05），表明贝莱斯特芽孢杆菌NSV2抵抗PRV感染，可能时抑制其复制阶段（图6A、B和C）。

进一步如图6D所示，在贝莱斯特芽孢杆菌NSV2预处细胞12h以后，吸去菌液，加入空培养基轻轻摇晃，弃掉，重复三次洗去残余的贝莱斯特芽孢杆菌NSV2。将细胞和病毒在4℃孵育1.5h后，直接洗去，收集RNA样品。经荧光定量检测，与对照组相比贝莱斯特芽孢杆菌NSV2处理后其吸附的PRV量并无显著差异，图6E试验结果表明：贝莱斯特芽孢杆菌NSV2抑制PRV，并不是通过影响PRV吸附细胞。

实施例4：贝莱斯特芽孢杆菌NSV2分泌表面活性素的分离和鉴定

4.1表面活性素的提纯和鉴定

将5mL 10⁸/mL贝莱斯特芽孢杆菌NSV2接种到100 mLLB培养液中，37℃培养，220rpm，培养16-24h后，新鲜菌液按3%体积接种Landy培养液（L-glutamic acid 5 g，MgSO₄0.5 g，KCl 0.5 g，Yeast Extract 1 g，MnSO₄·H₂O 5 mg，FeSO₄·6H₂O 0.15 mg，CuSO₄·5H₂O 0.16 mg，L-苯丙氨酸 2 mg，加800 mL去离子水，加氢氧化钠使粉末完全溶解，并调pH至7.0，定容950 ml，高压冷却后，将50mL蔗糖20g、KH₂PO₄ 1 g溶液过滤除菌加入营养液中）。30℃ 200 rpm培养36小时。离心（11℃，8 000 g，10分钟），取上清。加入盐酸调节pH至2.0，4℃过夜。离心（11℃，8 000 g，10分钟），弃上清。沉淀中滴加少量浓氢氧化钠溶液，溶解沉淀调节pH至7.0，获得表面活性素粗提液。适当稀释表面活性素粗提液后，用100 kDa滤膜进行超滤，弃去滤液。继续补加去离子水并超离三次，收集上室液，置玻璃烧杯中，加入3倍体积无水乙醇，混匀。用100 kDa滤膜进行超滤，收集滤过液。旋转蒸发干燥后，称量，分装，甲醇溶解备用，如图7B得到表面活性素固体和甲醇溶解的液体。进一步进行液质联用分析，取2μL样品注入超高效液相色谱柱中，流速0.4 mL/min。Buffer A（0.1%甲酸的水溶液）和BufferB（0.1%甲酸的乙腈溶液），按5% Buffer B 2分钟，5–95% Buffer B 15分钟，95% Buffer B2分钟进行色谱试验。质谱部分采用正电荷MSe acquisition模式，检测荷质比范围50–1200。电离参数如下：毛细管电压为2.5kV，碰撞能量为40 eV，源温度为120℃，去溶剂化气体温度为400℃。使用Masslynx 4.1进行数据采集和处理。

对照组所使用的表面活性素标准品（维克奇生物，24730-31-2）的纯度为98%，几乎所有的质谱峰均对应于表面活性素的各种同系物。例如，图7D中m/z值为1036.7的峰对应于图7E中碳链长度为15的表面活性素分子。主峰之后m/z值相差几个整数的小峰，是由于在同一分子中存在一个或多个较重的同位素原子。显然，他们也是表面活性素。纯化产物中表达蛋白同源物的分子量与标准品的分子量一致，但同系物的比例不同（图7D，E）。通过将样品中积分峰面积与标准品进行比较，得到纯化产物中的表面活性素浓度。测量表面活性素样品的干重，计算纯度达到85%以上。

4.2贝莱斯特芽孢杆菌NSV2分泌表面活性素对细胞活力的影响

将4.1提取的表面活性素浓度稀释到160、80、40、20、10、5、2.5、1.2和0.625μg/mL，然后取100μL添加到生长至汇合度80%的96孔板中的PK15或STEC细胞，处理2h后，加入10μLCCK8试剂，继续培养4小时，同时设置对照组和空白组。用酶标仪读取OD560。结果表示为试验组与空白组数据的百分比值。超过20 μg/ml的表面活性素将对PK15和STEC细胞有毒性（图8 A和B）。因此下一步实验选取20μg/mL及以下浓度进行抗病毒实验。

实施例5：贝莱斯特芽孢杆菌NSV2分泌表面活性素对PRV和PEDV的抑制作用

5.1贝莱斯特芽孢杆菌NSV2分泌表面活性素抑制PRV感染细胞

提取的表面活性素稀释到20μg/mL，试验方法参考实施例2，步骤二的三种处理方式，收集蛋白样和RNA样品。经Western blot和定量检测，结果表明：预处理、共孵育和后处理均能够有效的抑制伪狂病毒感染PK15和STEC细胞，抑制率达到90%以上（图8C、D和E）。进一步使用不同浓度梯度提取的表面活性素预处理细胞以后，经Western blot和定量检测随着浓度的降低，表面活性素对PRV的抑制作用减弱（图8F和G）。在最低5μg/ml浓度时仍具有90%的抑制率，这表明贝莱斯特芽孢杆菌NSV2分离的表面活性素是一种高效抗病产物。

试验方法参考实施例2，步骤2.2免疫荧光，如图9所示：与对照组相比贝莱斯特芽孢杆菌NSV2分泌的表面活性素经预处理、共孵育和后处理三种方式处理后，病毒荧光强度明显减弱，其中预处理组和共孵育组几乎观察不到，后处理组有少量的荧光存在。

5.2贝莱斯特芽孢杆菌NSV2分泌表面活性素抑制PEDV感染细胞

参考实施例4，4.2步骤，检测表面活性素对VERO细胞的毒性，将表面活性素分别稀释到0.1，0.5，1..25，2.5，5，10，20，40和80μg/ml。结果表明：表面活性素浓度在10μg/ml以上时对VERO细胞活力有显著影响（图10A）。

将不同浓度（1，2.5，5和10 μg/ml）提取的表面活性素与10⁵ CFU PEDV，37℃共孵育1h。孵育产物加入细胞孔中，37℃培养1小时后，弃去上清，空培养基洗三遍。加入维持液37℃培养24小时，收集细胞样品用于检测病毒的核酸、蛋白水平和空斑水平。细胞样品经过RNA提取、反转录后，以GAPDH为内参通过荧光定量检测PEDV的N蛋白含量。引物序列如下：

PEDV-N-F：AAGGCGCAAAGACTGAACCC

PEDV-N-R：TGTTGCCATTACCACGACTCC

GAPDH-V-F：ACATCATCCCTGCCTCTACTG

GAPDH-V-R：CCTGCTTCACCACCTTCTTG

细胞样品中的PEDV的N蛋白通过Western-blot方法检测，以GAPDH为内参。空斑检测：前面实验收集的处理后的上清，处理12孔板细胞37℃孵育1h，洗去。加入1%低熔点琼脂DMEM，室温待琼脂凝固后，培养48-72h小时。每孔加入1 mL 4%多聚甲醛固定1小时，流水冲去琼脂后，加入结晶紫染色1小时。洗去多余结晶紫，晾干后拍照。对每孔空斑数进行计数。结果表明：浓度为10 μg/mL的表面活性素几乎完全可以抑制所检测病毒的入侵，随着表面活性素浓度的降低，这种抗病毒效果也逐渐减弱（图10 B、C、D、E和F）。因此，对于表面活性素，在浓度范围为10~2.5 μg/mL，能发挥强力的抗病毒作用，而不会对细胞造成伤害。

实施例6：羊鼻腔黏膜外植体模型的建立

6.1羊鼻腔黏膜外植体的分离和培养

如图11A所示，选取健康绵羊（湖羊和乌骨羊），宰杀后打开鼻腔将鼻腔黏膜连带鼻甲骨或者鼻中隔，浸入含有5%双抗，1%两性霉素和庆大的1640培养基当中。1-2小时内运送至实验室，转移至含有30mL含5%双抗，1%两性霉素和庆大的生理盐水的50mL离心管中，反复摇晃清洗6-7次，洗净组织快上附着的细菌、真菌和其它杂质，保证无污染发生。洗净后，用眼科镊子和眼科剪轻轻剥离组织块上的黏膜组织，转移至含有清洗液的平皿当中，利用圆形打孔器，将组织处理成一样大小的圆形黏膜组织块。

将预处理好的黏膜组织，黏膜的纤毛面向上置于12孔Transwell小拭上室中孔径的滤膜上（图11A），整个小拭中加入约600μL的完全培养液（1640培养基+10%胎牛血清+1%双抗），培养液刚好浸过黏膜组织厚度的一半，构成气液培养模型（图11B）。37℃，5% CO2培养，每隔18-24h全量换新的培养液。

6.2羊鼻腔黏膜外植体组织结构观察

取培养不同时间点（1d、3d、5d、7d和9d）培养的黏膜外植体，4%多聚甲醛固定，梯度酒精脱水（75%、85%、95%和100%），100%二甲苯透明，石蜡包埋，切片，烘干后备用。通过苏木精盒伊红（HE染色）染色观察组织形态结构完整性。如图11C所示，通过HE染色观察培养第1天可见清晰肠黏膜上皮、纤毛、腺体及黏膜和固有层结构，培养第9天时组织结构依然良好。

6.3羊鼻腔黏膜外植体的凋亡和活力检测

收集培养后不同时间点鼻腔黏膜外植体组织（2h、6h、12h、1d、2d、3d、5d、7d和9d），加入蛋白裂解液（RIPA），匀浆后离心，离心收集上清，加入蛋白上样缓冲液，变性。取12孔预制胶，每孔加样15μL，120v电泳。使用PVDF（甲醇预活化1min）膜湿转，15min。转膜完成后，5%BSA中封闭2h，按比例稀释一抗Caspase3/Caspase9，摇床孵育过夜。TBST洗三次，加入二抗孵育1h，TBST洗三次，蛋白显影仪曝光并拍照。如图11D可知，黏膜外植体在9天内的不同时间点其早期凋亡没有显著差异。

进一步使用Western blot（步骤参考实施例2的2.2）检测增殖蛋白PCNA在不同时间点（2h、6h、12h、1d、2d、3d、5d、7d和9d）黏膜外植体中的变化。如图11E结果表明，黏膜外植体在第2天其增殖能力最强，但在3d以后其增殖能力下降。

实施例7：贝莱斯特芽孢杆菌NSV2-羊鼻腔黏膜外植体刺激模型的建立

试验前一天接种100μL 10⁸/mL新鲜贝莱斯芽孢杆菌NSV2菌液至液体5Ml LB培养基中，37℃ 220rpm 培养12-16h。收集菌液PBS洗三遍，最后用PBS重悬，调整浓度中5×10⁶每毫升备用。用移液枪吸去Transwell小拭上室和下室当中的液体。如图12A所示：取10的6次方菌液约200μL，滴加接种至黏膜培养的小拭上室孔中，下室当中加入600μL的完全培养，刚好淹没黏膜外植体高度的一半。37℃，5% CO₂，培养箱培养36h后收集黏膜组织。组织样品经过RNA提取、反转录后，以羊GAPDH为内参，荧光定量检测因子IL10、IL5、IL6、IL10、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL20、CXCL10、IFNγ和TNFa含量。序列如下：

结果表明，贝莱斯芽孢杆菌NSV2刺激的鼻腔黏膜外植体模型，可显著的提高先天免疫因子的表达（图12B），包括：IL1、IL6和CCL20等细胞因子。

进一步称取黏膜外植体组织0.1g，加入900μLPBS匀浆机充分匀浆。离心20min（2000转-3000转），收集上清。使用BCA蛋白浓度（Biosharp，BL521A）检测试剂盒，检测蛋白提取液总蛋白浓度。进一步使用羊ELISA试剂盒（江苏酶免实业有限公司）检测了IL6和CCL20因子水平的变化。参考试剂和试用操作，最后使用酶标仪在450nm波长下检测吸光度，计算，并与总蛋白进行比较，计算其单位总蛋白中目标蛋白的含量比例。结果表明贝莱斯特芽孢杆菌NSV2可以显著诱导IL6和CCL20的表达（图13A和B），提高先天免疫力。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 一株羊鼻腔源贝莱斯特芽孢杆菌及其应用

<160> 11

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1447

<212> DNA

<213> 贝莱斯特芽孢杆菌NSV2(Bacillus velezensis strain)

<400> 1

cggatgcggg ctatcatgca gtcgagcgga cagatgggag cttgctccct gatgttagcg 60

gcggacgggt gagtaacacg tgggtaacct gcctgtaaga ctgggataac tccgggaaac 120

cggggctaat accggatggt tgtttgaacc gcatggttca gacataaaag gtggcttcgg 180

ctaccactta cagatggacc cgcggcgcat tagctagttg gtgaggtaac ggctcaccaa 240

ggcgacgatg cgtagccgac ctgagagggt gatcggccac actgggactg agacacggcc 300

cagactccta cgggaggcag cagtagggaa tcttccgcaa tggacgaaag tctgacggag 360

caacgccgcg tgagtgatga aggttttcgg atcgtaaagc tctgttgtta gggaagaaca 420

agtgccgttc aaatagggcg gcaccttgac ggtacctaac cagaaagcca cggctaacta 480

cgtgccagca gccgcggtaa tacgtaggtg gcaagcgttg tccggaatta ttgggcgtaa 540

agggctcgca ggcggtttct taagtctgat gtgaaagccc ccggctcaac cggggagggt 600

cattggaaac tggggaactt gagtgcagaa gaggagagtg gaattccacg tgtagcggtg 660

aaatgcgtag agatgtggag gaacaccagt ggcgaaggcg actctctggt ctgtaactga 720

cgctgaggag cgaaagcgtg gggagcgaac aggattagat accctggtag tccacgccgt 780

aaacgatgag tgctaagtgt tagggggttt ccgcccctta gtgctgcagc taacgcatta 840

agcactccgc ctggggagta cggtcgcaag actgaaactc aaaggaattg acgggggccc 900

gcacaagcgg tggagcatgt ggtttaattc gaagcaacgc gaagaacctt accaggtctt 960

gacatcctct gacaatccta gagataggac gtccccttcg ggggcagagt gacaggtggt 1020

gcatggttgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa cgagcgcaac 1080

ccttgatctt agttgccagc attcagttgg gcactctaag gtgactgccg gtgacaaacc 1140

ggaggaaggt ggggatgacg tcaaatcatc atgcccctta tgacctgggc tacacacgtg 1200

ctacaatgga cagaacaaag ggcagcgaaa ccgcgaggtt aagccaatcc cacaaatctg 1260

ttctcagttc ggatcgcagt ctgcaactcg actgcgtgaa gctggaatcg ctagtaatcg 1320

cggatcagca tgccgcggtg aatacgttcc cgggccttgt acacaccgcc cgtcacacca 1380

cgagagtttg taacacccga agtcggtgag gtaaccttta tggagccagc cgccgagtga 1440

agaaaat 1447

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> PRV-gB -F(Artificial Sequence)

<400> 2

gtccgtgaag cggttcgtga t 21

<210> 3

<211> 23

<212> DNA

<213> PRV-gB-R(Artificial Sequence)

<400> 3

acaagttcaa ggcccacatc tac 23

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> GAPDH-pig-F(Artificial Sequence)

<400> 4

tcatcatctc tgccccttct 20

<210> 5

<211> 20

<212> DNA

<213> GAPDH-pig-R(Artificial Sequence)

<400> 5

gtcatgagtc cctccacgat 20

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> GAPDH-Monkey-F(Artificial Sequence)

<400> 6

acatcatccc tgcctctact g 21

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> GAPDH-Monkey-R(Artificial Sequence)

<400> 7

cctgcttcac caccttcttg 20

<210> 8

<211> 20

<212> DNA

<213> PEDV-N-F(Artificial Sequence)

<400> 8

aaggcgcaaa gactgaaccc 20

<210> 9

<211> 21

<212> DNA

<213> PEDV-N-R(Artificial Sequence)

<400> 9

tgttgccatt accacgactc c 21

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> GAPDH-V-F(Artificial Sequence)

<400> 10

acatcatccc tgcctctact g 21

<210> 11

<211> 20

<212> DNA

<213> GAPDH-V-R(Artificial Sequence)

<400> 11

cctgcttcac caccttcttg 20

Claims (6)

1.一株羊鼻腔源贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）NSV2，其特征在于，所述贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）NSV2于2020年7月13日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.20345。

2.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌NSV2在制备抗病原微生物制剂或益生菌制剂中的应用，所述的病原微生物为抵抗伪狂犬病毒、多杀性巴氏杆菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌、流行性腹泻病毒中的一种或几种。

3.抗病原微生物制剂，其特征在于，其含有权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌NSV2。

4.益生菌制剂，其特征在于，其含有权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌NSV2。

5.权利要求3所述的抗病原微生物制剂或权利要求4所述的益生菌制剂，其特征在于，其剂型为口服液、喷剂或粉剂中的一种。

6.一种贝莱斯芽孢杆菌-羊鼻腔黏膜外植体的免疫刺激模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）羊鼻腔黏膜上的皮分离和气液培养的建立；

2）贝莱斯芽孢杆菌-羊鼻腔黏膜外植体的免疫刺激模型建立，所述贝莱斯芽孢杆菌为权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌NSV2。

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