CN111826306B - 一株牛源解淀粉芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

一株牛源解淀粉芽孢杆菌及其应用 Download PDF

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Abstract

一种家畜微生物及用途，即一种可致疫致死的牛源解淀粉芽孢杆菌及其应用，所述牛源解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2019年04月25日，保藏号为CGMCC No.17627，分类命名解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens），所述菌株信息如下：分离自猝死病牛的肝脏和脾脏；菌落染色镜下可见该菌呈长杆状，多以两节短链形式存在，为格兰氏阳性菌；16SrDNA序列如序列表；该菌株对头孢曲松钠、磺胺甲基异噁唑、多西环素敏感，对阿莫西林敏感性较差，对头孢吡肟不敏感；该菌具有较强的耐碱性和耐盐性；且具有较强的抗高温性；通过动物实验证明该菌具有致病性及致死性。所述解淀粉芽孢杆菌用于牛疫病检疫对照样品。亦可作为牛疫病预防疫苗的菌种。

Description

一株牛源解淀粉芽孢杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及一种家畜微生物及用途，即一种可致死性的牛源解淀粉芽孢杆菌及其应用。
背景技术
解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens) 一直被认为是动植物的益生菌，可抑制其它动植物危害菌的生长，未见该细菌感染致死的相关报道。可是，2018年内蒙古自治区通辽市多地出现牛猝死病现象，通过对病死牛进行炭疽杆菌病、口蹄疫病毒病等传染性疾病的排查后，对其进行剖检，在肝脏和脾脏中分离出了一种细菌。对该细菌进行分离鉴定，确定为解淀粉芽孢杆菌。深入研究解淀粉芽孢杆菌的致病性及防治措施，对于发展养牛业，降低疫病损失，具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种牛源解淀粉芽孢杆菌及其应用。
上述目的是由以下技术方案实现的：一种牛源解淀粉芽孢杆菌，其特征在于：牛源解淀粉芽孢杆菌 (Bacillus amyloliquefaciens) 保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期 2019 年 04 月 25日，保藏号为 CGMCC No.17627，分类命名解淀粉芽孢杆菌 (Bacillus amyloliquefaciens，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路1 号院 3 号。
所述菌株信息如下：
⑴.来源：该菌株分离自猝死病牛的肝脏和脾脏。
⑵.形态学特征：菌落染色镜下检查可见该菌呈长杆状，多以两节短链形式存在，为革兰氏阳性菌。
⑶.生理生化特征：
1)16SrDNA 序列如序列表。
2)抗生素敏感性：该菌株对头孢曲松钠、磺胺甲基异噁唑、多西环素敏感，对阿莫西林敏感性较差，对头孢吡肟不敏感。
3)生长特性：该菌在PH为5-8时生长状态较好，具有较强的耐碱性。氯化钠浓度在0-10g/L时该菌生长较好，具有较强的耐盐性。此菌置于100℃可存活10min，具有较强的抗高温性。
4)致病性：通过动物实验证明该菌具有致病性及致死性。
所述的解淀粉芽孢杆菌的应用，其特征在于：所述解淀粉芽孢杆菌用于牛疫病检疫对照样品。
所述的解淀粉芽孢杆菌的应用，其特征在于：所述解淀粉芽孢杆菌用作为牛疫病预防疫苗的菌种。
本发明的有益效果是：找到牛猝死疫病的致病细菌，为防治牛猝死病提供了可参照的样品、参数及防疫用品，可大幅缩短疫病的确诊时间，降低牛的疫病损失，为发展养牛业提供保障。
附图说明
图1是菌落镜下形态图；
图2为进化树图谱。
具体实施方式
年通辽市多地出现牛猝死病例，其中一户养殖户出现了牛猝死现象。我们对病死牛进行炭疽杆菌病、口蹄疫病毒病等传染性疾病的排查后，对其进行剖检，在肝脏和脾脏中分离出了细菌。对该细菌进行分离鉴定，最后确定其为解淀粉芽孢杆菌。在此之前并未查找到该细菌感染致死的相关报道，因此对其进行生物学鉴定。
用病死牛的内脏在普通琼脂培养基上进行触板，37℃条件下培养12h，培养基上出现菌落，挑取菌落进行染色，镜下检查可见该菌为革兰氏阳性菌，呈长杆状，多以两节短链形式存在（图1）。
对该细菌进行16s rDNA序列分析：菌株接种于LB液体培养基中，37℃，200 r/min，培养12h。取1mL菌液经离心进行具体收集，之后进行DNA提取。设计细菌16SrRNA通用引物(F:5/-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3/,R:5/-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3/)进行PCR实验。PCR条件：95℃预变性5min；94℃变性1min，52℃退火1min，72℃延伸1min30s，35个循环；72℃延伸10min。之后进行电泳分析，得出1500bp左右条带。将目的条带进行胶回收，之后送至生物公司进行测序，获得其核酸序列（见序列表）。
将所获序列在核酸数据库NCBI中进行检索，匹配结果显示，该菌为解淀粉芽孢杆菌。对其进行进化树分析，结果如图2。结果表明该菌株16SrDNA序列与KT986121为一簇，因此表明其为解淀粉芽孢杆菌。
生化实验：使用生化分析仪对该细菌进行鉴定，结果也显示该菌为解淀粉芽孢杆菌（见表1）。
表1 ：
项目 结果
精氨酸-精氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素 —
甘氨酸-脯氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素 —
L-丙氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素 —
L-组氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素 —
L-异亮氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素 —
L-亮氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素 —
L-苯丙氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素 —
L-脯氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素 +
L-焦谷氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素 —
L-精氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素 —
L-色氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素 +
甲硫氨酸-7-氨基-4-甲基香豆素 —
3-甲基戊二酸 —
D-果糖 +
黏菌素 +
D-葡萄糖酸 +
D-甘露糖 +
亚氨基二乙酸 +
α-酮戊二酸 —
3-甲基己二酸 +
多粘菌素B —
胸腺嘧啶脱氧核苷 +
4甲基伞型酮-AD-葡萄糖苷酸 —
4甲基伞型酮-BD-纤维素二糖甙 +
4甲基伞型酮--BD-半乳糖苷 —
4甲基伞型酮-BD-葡萄糖苷酸 —
4甲基伞型酮-BD-葡萄糖苷 +
4甲基伞型酮-N-乙酰-BD-氨基葡糖苷 —
4甲基伞型酮-磷酸 +
4甲基伞型酮-磷酸（带海藻糖） +
丙氨酸-丙氨酸-对硝基苯胺 —
L-脯氨酸-对硝基苯胺 +
缬氨酸-丙氨酸-对硝基苯胺 —
对硝基苯-AD-葡萄糖苷 +
对硝基苯-磷酸 —
β-龙胆二糖 —
右旋糖 +
D-蔗糖 +
D-塔格糖 —
D-海藻糖 —
麦芽糖 —
麦芽三糖 —
N-乙酰-葡萄糖胺 —
项目 结果
尿素 —
七叶苷 +
麦芽三糖 —
N-乙酰-葡萄糖胺 —
α-甲基葡萄糖苷 —
2.药敏实验：选择多种药物对其进行药敏试验，结果显示该菌株对头孢曲松钠、磺胺甲基异噁唑、多西环素敏感，对阿莫西林敏感性较差，对头孢吡肟不敏感（见表2）。
表2
药物名称 抑菌环直径（mm）
头孢曲松钠 20
磺胺甲基异噁唑 32
多西环素 32
氨苄西林 10
阿莫西林 16
头孢吡肟 0
3.生长特性实验：
将LB液体培养基的PH值进行梯度设定之后对该菌进行培养，检测PH对该菌生长的影响。结果显示该菌在PH为5-8时生长状态较好，表示其具有较强的耐碱性。与PH检测方法相同，分别设计了氯化钠及温度对该菌的影响，结果显示氯化钠浓度在0-10g/L时该菌生长较好，显示其具有较强的耐盐性。将此其置于100℃后，经检测此菌可存活10min，表明其具有较强的抗高温性。
致病性实验：为检测该菌的致病性进行动物实验。取生长良好的昆明小鼠9只分3组，每只注射0.6mL菌液，3组菌液浓度分别为104 CFU/mL,106 CFU/mL,108CFU/mL。注射12h后108CFU/mL组小鼠全部死亡，其余两组也出现死亡及程度不等的病态。对死亡小鼠进行剖检在其实质性脏器内重新分离到该菌，即该菌具有致病性及致死性。
应用简介
（1）为牛疫病防治提供理论依据。此研究表明解淀粉芽孢杆菌已存在致病性且可致死。在此之前解淀粉芽孢杆菌一直被认为是动植物的益生菌，可抑制其他植物危害菌的生长。此次致病性的发现，提醒我们要加强对解淀粉芽孢杆菌的研究，做好整体生物性防控，降低该菌对牛的致病性，减少牛产业发展中带来的经济损失。
（2）为检疫提供对照样品。目前所获得的菌株以及相关资料，均成为牛检疫的标准对照品。
（3）疫苗制备。本菌株为制备疫苗提供了基础资料。
序列表：
CAATCTGTCACTTCGGCGGCTGGCTCCATAAAGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGAACAGATTTGTGGGATTGGCTTAACCTCGCGGTTTCGCTGCCCTTTGTTCTGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGCCCCCGAAGGGGACGTCCTATCTCTAGGATTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAGGGGCGGAAACCCCCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGTTCCCCAGTTTCCAATGACCCTCCCCGGTTGAGCCGGGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCGCCTGCGAGCCCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCG
疫苗制备
1.制备方法
将解淀粉芽孢杆菌划线接种于普通琼脂平板，37℃过夜培养，挑取单个菌落接种到LB液体培养基，37℃培养12h后，加入菌液总量1%的甲醛溶液，混匀，继续培养24 h。将灭活后的菌液按照体积比加入1:3的铝胶佐剂，混匀，4℃保存备用。
灭活疫苗的质量检验
（1）无菌检验：取灭活疫苗接种于营养琼脂培养基，观察细菌生长情况。
（2）安全性试验：取20只昆明鼠，随机分为2组（n=10），第1组通过肌肉注射接种铝胶佐剂疫苗，第2组接种生理盐水作为阴性对照，剂量皆为0.4 mL /只。在相同条件下饲养并观察昆明鼠10日内的临床表现。
质量检验结果：
经甲醛灭活后的菌液在营养琼脂培养基上无菌落生长，灭活效果良好；二组小鼠注射部位的皮肤均正常，无红肿现象，生长正常，未表现出任何明显临床症状。
灭活疫苗的效力试验
取90只昆明鼠，随机分为9组（n=10），第1组至第8组分别肌肉注射灭活疫苗0.05mL、0.1mL、0.15mL、0.2mL、0.25mL、0.3mL、0.35mL、0.4mL，第九组肌肉注射PBS作为阴性对照。免疫后第14天，用解淀粉芽孢杆菌通过腹腔注射攻毒，攻毒菌液量为0.2mL /只(活菌量为3×106CFU/mL)，观察其临床表现。
效力试验结果：
如表3所示。用小剂量（0.05mL/只）疫苗免疫后对鼠无免疫保护作用；用0.10mL-0.25mL /只的剂量免疫可产生一定免疫保护效果，但不能完全保护；只有用稍大一些的剂量（0.3mL/只）疫苗免疫才可完全产生免疫保护作用。但如果继续增大疫苗剂量，也只能够产生一定的免疫保护效果。
表3
Figure 812054DEST_PATH_IMAGE002

Claims (4)

1.一 种牛源解 淀 粉 芽 孢 杆 菌，其 特 征 在 于 ：所述牛源解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期 2019 年 04 月 25 日，保藏号为 CGMCC No.17627，分类命名 解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens ，保藏单位地址为北京市朝阳区北辰西路 1 号院 3 号。
2.根据权利要求1所述牛源解 淀 粉 芽 孢 杆 菌，其特征在于：所述菌株信息如下 ：
（1）来源：该菌株分离自猝死病牛的肝脏和脾脏；
（2）形态学特征：菌落染色镜下检查可见该菌呈长杆状，多以两节短链形式存在，为格兰氏阳性菌；
（3）生理生化特征：
1) 16SrDNA 序列如序列表；
2) 抗生素敏感性：该菌株对头孢曲松钠、磺胺甲基异噁唑、多西环素敏感，对阿莫西林敏感性较差，对头孢吡肟不敏感；
3) 生长特性：该菌在PH为5—8时生长状态较好，具有较强的耐碱性，氯化钠浓度在0—10g/L时该菌生长较好，具有较强的耐盐性，此菌置于100℃可存活10min，具有较强的抗高温性；
4)致病性：该菌具有致病性及致死性。
3.根据权利要求1所述牛源解 淀 粉 芽 孢 杆 菌的应用，其特征在于 ：所述解淀粉芽孢杆菌用于制备牛疫病检疫对照样品。
4.根据权利要求1所述牛源解 淀 粉 芽 孢 杆 菌的应用，其特征在于 ：所述解淀粉芽孢杆菌用作制备牛疫病预防疫苗的菌种。
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