CN106701639A - 一种新型致病性蜡样芽孢杆菌hb‑ss‑1及其培养方法和应用 - Google Patents

一种新型致病性蜡样芽孢杆菌hb‑ss‑1及其培养方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种新型致病性蜡样芽孢杆菌HB‑SS‑1及其培养方法和应用，所述菌株于2016年11月24日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M2016672。本发明人对该菌株进行了一系列生物学特性试验如：细菌纯化培养、涂片染色镜检、生化试验、药敏试验、PCR鉴定、动物试验、疫苗免疫保护试验。试验结果证实该菌株16SrDNA序列与炭疽杆菌部分菌株序列一致，通过动物实验证明HB‑SS‑1有较强毒力，能够致死实验小白鼠，该毒株可作为以后防疫麋鹿细菌病的候选疫苗菌株，可用于制备蜡样芽孢杆菌病疫苗。

Description

一种新型致病性蜡样芽孢杆菌HB-SS-1及其培养方法和应用
技术领域
本发明涉及菌株领域，具体涉及一种新型致病性蜡样芽孢杆菌HB-SS-1及其培养方法和应用。
背景技术
蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus，B.C)在土壤等环境中广泛存在，是一种需氧型的芽孢杆菌，其产生丰富的蛋白酶、SOD、淀粉酶及抑菌物质等代谢产物。微生态制剂，以蜡样芽孢杆菌为主要细菌，可以克服很多副作用，例如使用抗生素作为饲料和药品添加剂所带来的副作用，人和动物肠道微生态系统失调、免疫力下降、药物残留及产生抗药性等。B.C菌类制剂大多为非消化性药剂或食品添加剂，能选择性促进生活在肠道的微生物的活性，同时抑制肠道内有害病菌的生长，降低宿主染病的机会，使宿主保证健康。另外，B.C菌在生长过程中还会产生有益的代谢产物，刺激和促进宿主的生长。
B.C菌虽然在其作为有益菌方面已获得了长足的发展和足够的重视，但是B.C菌也是一种条件致病菌，在一定旳条件下也会对动物机体造成很强的致病性，因此它危害也应该引起我们足够的重视。研究表明，该菌同昆虫病原菌苏云金杆菌、人畜病原菌、炭疽芽孢杆菌、蕈状芽孢杆菌、韦氏芽抱杆菌组成芽孢杆菌属蜡样芽孢杆菌组，它们的形态特征、生理生化特征非常相似并有着极高的同源性，该菌也曾被多次报道引起人食物中毒、以及在养殖过程中引发部分动物疾病等。鉴于B.C菌包含有益菌株和致病性菌株，因此在使用前应首先确定菌株是否为致病菌株，确保其安全性。
发明内容
为解决上述问题，本发明提供了一种新型致病性蜡样芽孢杆菌HB-SS-1及其培养方法和应用。
为实现上述目的，发明人从发病麋鹿群中分离到了一株新型致病性蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)HB-SS-1，所述菌株于2016年11月24日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址为中国武汉武昌珞珈山，保藏编号为：CCTCC NO：M2016672。
所述(Bacillus cereus)HB-SS-1的16SrDNA序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明还提供了上述新型致病性蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)HB-SS-1的分离纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、培养基配制
TSA固体培养基配制：准确称取TSA粉末40g，溶于940mL蒸馏水，充分摇匀后121℃高压蒸汽灭菌15min，冷却至50-60℃时，加入过滤除菌的羊血清60mL，混合均匀后倒板备用；
TSB液体培养基配制：准确称取TSB粉末30g，溶于940mL蒸馏水，充分摇匀后121℃高压蒸汽灭菌15min，临用前加入过滤除菌的羊血清60mL即可；
S2、分离纯化
选取发病麋鹿的肺、胸水、心包液、关节液接种TSA/NAD固体培养基，置37℃、5％CO2条件下培养24-48小时，挑取乳白色的圆形光滑小菌落涂片，革兰氏染色镜检，选取革兰氏阳性小杆状菌，再进行两次TSA/NAD固体培养基亚克隆培养。
本发明人对该菌株进行了一系列生物学特性试验如：细菌纯化培养、涂片染色镜检、生化试验、药敏试验、PCR鉴定、动物实验。试验结果证实该菌株16SrDNA序列与炭疽杆菌部分菌株序列一致，通过动物实验证明HB-SS-1有较强毒力，能够致死实验小白鼠，该毒株可作为以后防疫麋鹿细菌病的候选疫苗菌株，可用于制备蜡样芽孢杆菌病疫苗。
附图说明
图1为本发明实施例中HB-SS-1菌株培养基生长形态。
图2为本发明实施例中HB-SS-1菌株革兰氏染色镜检。
图3为本发明实施例中HB-SS-1菌株16SrDNA基因进化树。
表1生化鉴定试验结果
注：″+″表示只产酸或阳性，″-″表示阴性
表2 HB-SS-1株药敏试验结果
注：S表示敏感；I表示中度敏感；R表示耐药。
表3半数致死量测定试验结果
具体实施方式
为了使本发明的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
蜡样芽孢杆菌HB-SS-1株的分离纯化和鉴定。
培养基配制
TSA固体培养基配制：准确称取TSA粉末40g，溶于940mL蒸馏水，充分摇匀后121℃高压蒸汽灭菌15min，冷却至50-60℃时，加入过滤除菌的羊血清60mL，混合均匀后倒板备用；
TSB液体培养基配制：准确称取TSB粉末30g，溶于940mL蒸馏水，充分摇匀后121℃高压蒸汽灭菌15min，临用前加入过滤除菌的羊血清60mL即可；
分离纯化
选取发病麋鹿的肺、胸水、心包液、关节液接种TSA/NAD固体培养基，置37℃、5％CO2条件下培养24-48小时，挑取乳白色的圆形光滑小菌落涂片见图.1，革兰氏染色镜检，选取革兰氏阳性小杆状菌见图.2，再进行两次TSA/NAD固体培养基亚克隆培养。
同时接种鲜血琼脂固体培养基和普通琼脂固体培养基，结果TSA/NAD固体培养基上生长速度和形态更为良好。
生化鉴定
参照《常见细菌系统鉴定手册》，将分离菌株进行生化试验，观察形态特征和生化反应特性，测定生化指标。
分离菌株的生化特性符合蜡样芽孢杆菌特有特征见表1，判定为蜡样芽孢杆菌属。
16SrDNA基因序列测定与分析
将菌株接种至普通营养肉汤培养基中培养过夜(37℃)，离心收集菌体，
按照细菌基因组DNA提取试剂盒说明书提取细菌总DNA。16SrRNA基因PCR扩增引物分别为：P1：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，P2：5′-GGCTACCTTGTTACGACTT-3′，由上海生工生物工程有限公司合成。
菌体DNA模板的制备取培养物1.5mL，10000r/min离心5min，弃上清，沉淀用200μL双蒸水重悬，100℃水浴10min后，12000r/min离心5min收集上清，即为PCR模板，-20℃保存备用。
PCR扩增及测序用提取的菌体DNA作为PCR模板。PCR扩增体系为：10×PCRBuffer10μL，MgCl2(25mM)2.5μL，dNTP(2.5mM)4.0μL，引物P1(20μM)2.0μL，引物P2(20μM)2.0μL，模板DNA5.0μL，Taq酶(5U/μL)2.5μL加双蒸水至50μL。反应条件为：95℃预变性5min，94℃变性2min，53℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环，72℃终延伸7min。取10μL PCR扩增产物，用1％的琼脂糖凝胶在120V电压下电泳鉴定，同时以标准株作为阳性对照，结果出现了1000bp大小的特异性条带，经过回收鉴定为阳性的PCR扩增产物交由上海生工生物工程有限公司测序。
HB-SS-1株16SrDNA基因测序结果见图.3所示，该序列与GenBank中公布的序列进行BLAST比对，与国内外已有的蜡样芽孢杆菌相应序列的同源性达99％以上。
蜡样芽孢杆菌药敏试验
用灭菌接种环挑取纯化好的菌落到含有TSB的试管中，37℃摇床培养8h；使用灭菌棉试子蘸取培养好的菌液，在15min内均勾涂布于整个TSA平板表面；将接种好的TSA平板置室温干燥5min；然后采用药敏纸片法，用无菌镊子将19种抗生素纸片贴在含菌琼脂表面，每个TSA平板贴种抗生素纸片，纸片贴好后室温放置15min，再将平板倒置于恒温箱，于37℃培养24h；观察结果，并测量抑菌圈直径，根据CLSI2009年药敏判定标准对结果进行数据分析表见表2，检测分离菌株的药物敏感性。
蜡样芽孢杆菌半数致死量(LD50)测定试验
选用70只4周龄雌性健康昆明小白鼠，通过″平板活菌计数法”进行细菌计数。具体过程如下：将小白鼠设二个组：空白对照组1组小白鼠、正常试验组6组小白鼠，每组10只小白鼠，采用腹腔注射，进行隔离词养观察。空对照组的小鼠腹腔注射生理盐水，200μL只；正常试验组小鼠分别腹腔注射从3.8×109、1.9×109、9.5×108、4.75×108、2.38×108、1.19×108、5.94×107CFU/mL剂量的分离菌，200uL只。接种每天观察、记录小白鼠发病死亡情况见表3，对死亡后的小白鼠采集肝脏接种TSA培养基，37℃培养后进行细菌染色镜检。
试验结果显示，在感染后48h内，有3组别开始出现发病症状，其中9.5×108CFU/mL及以上高浓度组别可全部死亡；96h后所有试验组别的小鼠均发病死亡，而对照组死亡率为0(表2)。根据改良寇氏法计算HB-SS-1菌株72h的LD50为3.36×108CFU/mL。同时从发病死亡的小鼠肝脏中也分离到了该菌株。说明该菌株具有较强的毒力，可以作为防控该病的疫苗株。
蜡样芽孢杆菌灭活疫苗的制备
菌种检验
取分离菌种少许，接种于血琼脂平板上培养，取菌落涂片染色镜检，做细菌纯度检验，应该纯粹无杂菌。该菌保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M2016672。
菌液灭活
将分离的菌种勾取接种至马丁肉汤内培养，并利用比浊法使菌浓度达1010CFU/mL为止。灭活在细菌计数基础上，按照0.4％体积比加入甲醛液，并置于37℃下灭活24-72h。其间每12h震荡一次并做灭活检验。
灭活疫苗配置
将高压后的氢氧化铝胶与灭活后菌液按1∶5的比例混合混匀，既成乳白色氢氧化铝胶灭活疫苗。
灭活疫苗安全性试验
将疫苗分别腹腔接种于12只四周龄的健康昆明小鼠上，0.1ml/只。同时设立健康对照组注射生理盐水0.1ml/只。观察10d，看有无不良反应，并剖解
注射小鼠，检查注射部位有无异常。
试验结果：接种疫苗组小鼠在注射后无任何不良反应，全部存活。证明疫苗安全，剖解注射部位也无异常。
灭活疫苗内毒素测定
取0.1mL鲎试剂放置于10x75mm试管中，然后加入0.1ml灭活的菌液，轻轻摇动置37℃水浴1h。取出放置室温10min观察结果。
试验结果：将试管缓慢的旋转180°，仅有少量浑浊物，表明内毒素已经被灭活。
灭活疫苗动物保护试验
用4月龄新西兰白兔4只，每只颈部皮下注射氢氧化铝灭活疫苗1ml，14d后连同另外4只未免疫对照组每只肌肉注射培养的活菌0.2ml(含10亿CFU)，并观察10-14d。免疫组白兔得到保护存活，保护率为100％(4/4)，而对照组全部发病、死亡。
试验结果：表明对照组全部死亡死亡率为100％(4/4)，免疫组全部存活保护率100％(4/4)。说明注射疫苗后能产生抗体来保护机体。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
<110>湖北省农业科学研究院畜牧兽医研究所
<120> 一种新型致病性蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）HB-SS-1及其培养方法和应用
<160> 5
<210> 1
<211> 1673
<212> DNA
<213> 蜡样芽孢杆菌HB-SS-1（Bacillus cereus HB-SS-1）
<400> 1
accgaggccc cgagcctctc cgccgagacg accccgggcc ccgtcaccga ggtcccgagt 60
ccctcggccg aggtctggga cgacctctcc accgaggccg acgacgatga cctcaacggc 120
gacctcgacg gcgacgaccg ccgcgcgggc ttcggctcgg ccctcgcatc cctgagggag 180
gcgcccccgg cccatctggt gaacgtgtcc gagggcgcca acttcaccct cgacgcgcgc 240
ggcgacggcg ccgtgctggc cgggatctgg acgttcctgc ccgtccgcgg ctgcgacgcc 300
gtgtcggtga ccacggtgtg cttcgagacc gcgtgccacc cggacctggt gctgggccgc 360
gcctgcatcc ccgaggcccc ggagatgggc atcggcgact acctgccgcc cgaggtgccg 420
cggctccggc gcgagccgcc catcgtcacc ccggagcggt ggtcgccgca cctgagcgtc 480
ctgcgggcca cgcccaacga cacgggcctc tacacgctgc acgacgcctc ggggccgcgg 540
gccgtgttct ttgtggcggt gggcgaccgg ccgcccgcgc cggcggaccc ggtgggcccc 600
gcgcgccacg agccccgctt ccacgcgctc ggcttccact cgcagctctt ctcgcccggg 660
gacacgttcg acctgatgcc gcgcgtggtc tcggacatgg gcgactcgcr cgagaacttt 720
ascgccacgc tggastggta ctacgcgcgc gcgcccccgc ggtgcctgct rtactacgtg 780
tacgagccct gcatctacca cccgcgcgcg cycgagtgcc tgcgcccggt ggacccggcg 840
tgcagcttca cctcgycggc gcgcgcgcgg ctggtggcgc gccgcgcgta cgcctcgtgc 900
agcccgctgc tcggggaccg gtggctgacc gcctgcccct tcgacgcctt cggcgaggag 960
gtgcacacga acgccaccgc ggacgagtcg gggctgtacg tgctcgtgat gacccacaac 1020
ggccacgtcg ccacctggga ctacacgctc gtcgccaccg cggccgagta cgtcacggtc 1080
atcaaggagc tgacggcccc ggcccgggcc ccgggcaccc cgtggggccc cggcggcggc 1140
gacgacgcga tctacgtgga cggcgtcacg acgccggcgc cgcccgcgcg cccgtggaac 1200
ccgtacggcc ggacgacgcc cgggcggctg tttgtgctgg cgctgggctc cttcgtgatg 1260
acgtgcgtcg tcgggggggc catctggctc tgcgtgctgt gctcccggcg ccgggcggcc 1320
tcgcggccgt tccgggtgcc gacgcgggcg cggacgcaca tgctctctcc ggtgtacacc 1380
agcctgccca cgcacgagga ctactacgac ggcgacgacg acgacgacga ggaggcgggc 1440
gtcatccgcc ggcggcccgc ctcccccggc ggagacagcg gctacgaggg gccgtacgcg 1500
agcctggacc ccgaggacga gttcagcagc gacgaggacg acgggctata cgtgcacccc 1560
gaggaggcgc cccgctccgg cttcgacgtc tggttccgcg atccggagaa accggaagtg 1620
aagaatggac ccaactatgg cgtgaccgcc aaccgcctgt tgaatgcccg ccc 1673
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
ctccacaagc taacactttc 20
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
catagaaact tcttttgaac c 21
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
GCGGCCCTTT CTGCTGCG
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
AGCGGGGCAG GACATCAA

Claims (5)

1.一种新型致病性蜡样芽孢杆菌HB-SS-1，其特征在于，所述菌株于2016年11月24日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO：M2016672。
2.如权利要求1所述的一种新型致病性蜡样芽孢杆菌HB-SS-1，其特征在于，所述HB-SS-1的16SrDNA序列如SEQ ID NO：1所示。
3.如权利要求1所述的一种新型致病性蜡样芽孢杆菌HB-SS-1的分离纯化方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、培养基配制
TSA固体培养基配制：准确称取TSA粉末40g，溶于940mL蒸馏水，充分摇匀后121℃高压蒸汽灭菌15min，冷却至50-60℃时，加入过滤除菌的羊血清60mL，混合均匀后倒板备用；
TSB液体培养基配制：准确称取TSB粉末30g，溶于940mL蒸馏水，充分摇匀后121℃高压蒸汽灭菌15min，临用前加入过滤除菌的羊血清60mL即可；
S2、分离纯化
选取发病麋鹿的肺、胸水、心包液、关节液接种TSA/NAD固体培养基，置37℃、5％CO2条件下培养24-48小时，挑取乳白色的圆形光滑小菌落涂片，革兰氏染色镜检，选取革兰氏阳性小杆状菌，再进行两次TSA/NAD固体培养基亚克隆培养。
4.如权利要求1所述的一种新型致病性蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)HB-SS-1的应用，其特征在于，可作为防疫麋鹿细菌病的候选疫苗菌株。
5.如权利要求1所述的一种新型致病性蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)HB-SS-1的应用，其特征在于，可用于制备蜡样芽孢杆菌病疫苗。
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