CN103923841B

CN103923841B - 一株对家蚕具有高致病力的球孢白僵菌菌株及其应用

Info

Publication number: CN103923841B
Application number: CN201410148487.8A
Authority: CN
Inventors: 邢东旭; 杨琼; 李丽; 廖森泰; 罗国庆; 肖阳; 李庆荣; 叶明强
Original assignee: Sericulture and Agri Food Research Institute GAAS
Current assignee: Sericulture and Agri Food Research Institute GAAS
Priority date: 2014-04-14
Filing date: 2014-04-14
Publication date: 2015-12-09
Anticipated expiration: 2034-04-14
Also published as: CN103923841A

Abstract

本发明公开了一株对家蚕具有高致病力的球孢白僵菌菌株及其在僵蚕生产中的应用，该菌株已于2014年2月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC？NO.8861。本发明的菌株用于僵蚕生产时包括以下步骤：用含0.2%吐温-80的无菌水将球孢白僵菌配制成孢子悬浮液，均匀喷洒5龄起蚕，接种第4-5天，家蚕大批量发僵病死亡，得到僵蚕。本发明的球孢白僵菌菌株对家蚕致病力强，家蚕死亡时间整齐，僵化率高，有利于解决僵蚕的标准化生产和质量控制等问题。

Description

一株对家蚕具有高致病力的球孢白僵菌菌株及其应用

技术领域

本发明属于僵蚕生产领域，具体涉及一株对家蚕具有高致病力的球孢白僵菌菌株及其在僵蚕生产中的应用。

背景技术

僵蚕为蚕蛾科昆虫家蚕BombyxmoriL.4-5龄的幼虫感染（或人工接种）白僵菌Beauveriabassiana(Bals.)Vuillant而致死的干燥体，是一种优良的中药材，在中成药和中药方剂中应用广泛，年需求量在1000吨左右。据统计，在513种人用成药中有49种含白僵蚕，64种儿科成药中含白僵蚕的有29种，如七珍丸、太极升降丸、小儿奇应丸、小儿镇惊丸等。

但是，当前僵蚕主要依靠从蚕区农户散收，无论从药材的品质方面考虑，还是从桑蚕生产安全角度来讲，都存在重大隐患。为达到僵蚕质量优质化、应用广泛化和蚕区僵病可控制的目的，申请人于2007年提出在非蚕区大规模人工生产白僵蚕的设想，并进行了初步尝试。但是，由于在接种时缺乏优良的白僵菌菌株，造成家蚕僵化成功率低，僵蚕产量不高，严重影响到僵蚕生产的效益和人工生产僵蚕的产业化推进。因此，筛选对家蚕高致病力的球孢白僵菌菌株是一项重要的基础研究工作。

在传统分类方法中，白僵菌分生孢子和菌落形态等特征是白僵菌属分类的重要依据。但是，对于形态特征差异不明显的菌株用传统的方法很难准确鉴定，所以以形态特征为主，同时依据生理生化指标和核酸指标，对白僵菌属种进行分类鉴定更为准确和科学，其中，ITS被广泛用于真菌属内不同种间或近似属间的系统发育关系分析。

发明内容

为了克服因缺乏优良的白僵菌菌株而导致的家蚕僵化成功率低，僵蚕产量不高等问题，本发明的首要目的在于提供一株对家蚕具有高致病力的球孢白僵菌菌株。

本发明的另一目的在于提供上述的球孢白僵菌菌株在僵蚕生产中的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一株对家蚕具有高致病力的球孢白僵菌（Beauveriabassiana）菌株（JC-1），已于2014年2月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.8861。

上述的球孢白僵菌菌株是从僵蚕中分离纯化后得到，其性状如下：

菌落和分生孢子形态：本发明的球孢白僵菌菌株在26℃、相对湿度（RH）95％的培养箱中培养15天，用0.2%吐温-80的水溶液冲洗平板表面，经过滤、离心后悬浮于0.2%吐温-80的水溶液中,配成浓度为1×10⁷个/mL的孢子悬浮液，用接种针分别将孢子悬浮液植于PDA培养基平板，每皿1点，每个菌株分别用3个培养皿培养，接种后置于26℃恒温培养箱中培养，第7天观察记录菌株菌落形态特征。如图1所示。

由图1可见，本发明的球孢白僵菌菌株菌落中心略凸起，基质为桃红色，菌落为纯白色，呈同心环扩散状生长。

将本发明球孢白僵菌菌株的成熟孢子用0.2%吐温-80的水溶液配成孢子悬浮液，显微镜下观察分生孢子形态。如图2所示，分生孢子为球形。

本发明球孢白僵菌菌株的ITS鉴定：菌株DNA的提取按照TaKaRaMiniBESTUniversalGenomicDNAExtractionKitVer.5.0操作进行。利用引物ITS4（SEQIDNO.1）和ITS5（SEQIDNO.2）用于rRNAITS片段的扩增。PCR反应体系为25μL，反应条件为：94℃预变性5min；94℃30s,53℃30s,72℃30s,循环30次；72℃延伸10min。

本发明球孢白僵菌菌株的ITS序列如SEQIDNO.3所示，序列长度596bp。通过NCBI/blast比对后发现与FJAT-9624同源性最高，达99.8%以上，为球孢白僵菌。

上述的球孢白僵菌菌株应用于僵蚕生产，包括以下步骤：

用含0.2%吐温-80的无菌水将球孢白僵菌配制成孢子悬浮液，均匀喷洒5龄起蚕，接种第4-5天，家蚕大批量发僵病死亡，得到僵蚕；

所述的孢子悬浮液中，孢子浓度为(1×10⁴)-(1×10⁷)个/mL，优选1×10⁶个/mL。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

1、本发明的球孢白僵菌菌株对家蚕致病力强，家蚕死亡时间整齐，僵化率高。

2、本发明的球孢白僵菌菌株可用于白僵蚕的人工规模化生产，有利于解决僵蚕的标准化生产和质量控制等问题。

附图说明

图1是本发明的球孢白僵菌菌株培养第7天时的菌落形态图。

图2是本发明球孢白僵菌菌株的分生孢子形态图。

图3是家蚕接种不同浓度球孢白僵菌后的死亡率曲线图。

图4是接种不同浓度的球孢白僵菌后获得的僵蚕。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例

1、本发明球孢白僵菌菌株的分离鉴定

（1）分离纯化

本发明的僵蚕是从广东罗定蚕区收集，家蚕品种为“春5”。

收集的僵蚕充分僵化后，将其体表白粉状物轻轻抖落到盛有0.2%吐温-80的水溶液的三角瓶中，用磁力搅拌子剧烈震荡使白僵菌分生孢子单个分开。将孢子悬浮液梯度稀释，用灭菌的三角形玻璃涂抹棒蘸取后均匀涂布于PDA培养基平板上，置于26℃、90%湿度环境下培养。

当有纯白色单个菌落长出后，及时用接种针挑取菌落转接到另一个灭菌的PDA培养基平板上，继续培养观察确无其它杂菌后，纯化培养完成。

（2）菌落和分生孢子形态

白僵菌菌株在26℃、RH95%的培养箱中培养15天，用0.2%吐温-80的水溶液冲洗平板表面，经过滤、离心后悬浮于0.2%吐温-80的水溶液中,配成浓度为1×10⁷个/mL的孢子悬浮液，用接种针分别将孢子悬浮液植于PDA培养基平板，每皿1点，每个菌株分别用3个培养皿培养，接种后置于26℃恒温培养箱中培养，第7天观察记录菌株菌落形态特征。如图1所示。

由图1可见，该菌落中心略凸起，基质为桃红色，菌落为纯白色，呈同心环扩散状生长。

成熟孢子用0.2%吐温-80的水溶液配成孢子悬浮液，显微镜下观察分生孢子形态。如图2所示，分生孢子为球形。

（3）菌株ITS鉴定

菌株DNA的提取按照TaKaRaMiniBESTUniversalGenomicDNAExtractionKitVer.5.0操作进行。利用引物ITS4和ITS5用于rRNAITS片段的扩增。PCR反应体系为25μL，反应条件为：94℃预变性5min；94℃30s,53℃30s,72℃30s,循环30次；72℃延伸10min。

引物ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′（SEQIDNO.1）

引物ITS5：5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′（SEQIDNO.2）

2、本发明球孢白僵菌菌株的生物学特性

（1）营养生长量测定

用接种针将含有1×10⁷个/mL孢子的悬浮液植于PDA培养基平板，每天测定菌落的直径，每个菌株重复3次，共记录10天。

表1菌落生长直径测定（mm）

天数	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
												0	1.8±0.1	5.0±0.5	9.3±0.2	15.5±0.4	22.8±0.9	27.2±0.4	32.4±0.7	38.3±0.4	43.8±1.2

由表1可见，菌落生长较为快速，7天后菌落直径为27.2±0.4cm，10天时菌落直径达到43.8±1.2cm，日平均生长量为4.38cm。

（2）产孢量测定

菌株培养到第15天时，用直径为8mm的打孔器在菌落中央到边缘的中点处取菌落块，转移三角瓶中，加入含有0.2％吐温-80的无菌水，在磁力搅拌器上充分振荡使孢子均匀分散，配制成孢子悬浮液。用血球计数板测定孢子数量。每个菌株重复3次。

经测定，本发明球孢白僵菌菌株的产孢量为2.18±0.27×10⁸个/cm²。

（3）菌株对家蚕的致病力测定

取5株菌株进行致病力测定，菌株从采自广西宜州、广东增城、连南、罗定等不同蚕区自然感染的家蚕虫体经分离纯化获得，经鉴定均为球孢白僵菌。用含0.2％吐温-80的无菌水将病原配制成1×10⁶个/mL的孢子悬浮液，均匀喷洒到5龄蚕体表，每组设3个重复区，每区100头。每天调查记录家蚕死亡情况，连续调查7天。

表2不同菌株对家蚕致病力测定

	死亡率（%）	显著性
			菌株1（JC-1）	98.9	A
菌株2	95.4	A
			菌株3	79.3	B
菌株4	33.1	C
			菌株5	35.5	C

由表2可知，本发明的菌株（JC-1）对家蚕致病力最强，家蚕僵化率可达98.9%，略高于菌株2，显著高于其它供试菌株。

3、本发明的球孢白僵菌菌株在白僵蚕生产上的应用

（1）菌株接种浓度的优选

用含0.2%吐温-80的无菌水将本发明的球孢白僵菌菌株配制为1×10⁷、1×10⁶、1×10⁵、1×10⁴个/mL的孢子悬浮液，均匀喷洒5龄起蚕，以体表见湿为宜，每天调查死亡情况，比较不同接种浓度对家蚕死亡的影响。

由图3可以看到，接种病原浓度越大，死亡时间越短，并且死亡时间越集中。病原浓度为1×10⁷个/mL时家蚕在第4天基本全部死亡，病原浓度为1×10⁶个/mL时家蚕在第4天也可以达到80%以上的死亡率。另外，由图4可以看出，随着接种浓度增加，所得僵蚕越小。因此，综合以上考虑，病原接种浓度为1×106个/mL是合适的。

（2）白僵蚕生产

用含0.2％吐温-80的无菌水将本发明的球孢白僵菌菌株配制为1×10⁶的孢子悬浮液，均匀喷洒5龄起蚕。接种第4-5天，家蚕大批量发僵病死亡，总体僵化率在90%以上。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一株对家蚕具有高致病力的球孢白僵菌（Beauveriabassiana）菌株，已于2014年2月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.8861。

2.权利要求1所述的球孢白僵菌菌株在僵蚕生产中的应用。

3.根据权利要求2所述的球孢白僵菌菌株在僵蚕生产中的应用，其特征在于包括以下步骤：

用含0.2%吐温-80的无菌水将球孢白僵菌配制成孢子悬浮液，均匀喷洒5龄起蚕，接种第4-5天，家蚕大批量发僵病死亡，得到僵蚕。

4.根据权利要求3所述的球孢白僵菌菌株在僵蚕生产中的应用，其特征在于：所述的孢子悬浮液中，孢子浓度为(1×10⁴)-(1×10⁷)个/mL。

5.根据权利要求3所述的球孢白僵菌菌株在僵蚕生产中的应用，其特征在于：所述的孢子悬浮液中，孢子浓度为1×10⁶个/mL。