CN112772294B

CN112772294B - 冬虫夏草菌菌种的分离方法及其应用

Info

Publication number: CN112772294B
Application number: CN202110005981.9A
Authority: CN
Inventors: 周桂灵; 秦启联; 张继红; 张寰; 孟茜; 李苗苗; 吴佩佩; 王红托; 李瑄; 苗麟; 郭力
Original assignee: Institute of Zoology of CAS
Current assignee: Institute of Zoology of CAS
Priority date: 2021-01-05
Filing date: 2021-01-05
Publication date: 2022-04-01
Anticipated expiration: 2041-01-05
Also published as: CN112772294A

Abstract

本发明提供了冬虫夏草菌菌种的分离方法，包括：1)在无菌条件下培养冬虫夏草鲜草并收集弹射的冬虫夏草子囊孢子；2)将步骤1)收集的冬虫夏草子囊孢子在无菌条件下用无菌水洗涤后稀释得到子囊孢子稀释液；3)将适量步骤2)所述子囊孢子稀释液在水琼脂平板上涂布展开、培养并萌发形成菌丝团；4)挑取单个子囊孢子萌发形成的菌丝团转移至液体培养基继续培养，所述菌丝团在所述液体培养基中产生一定数量芽生孢子后，接种至新的液体培养基或者固体培养基扩大培养，得到冬虫夏草菌。本发明还提供了冬虫夏草的人工培植方法和液体培养基在分离培养冬虫夏草菌中的用途。本发明的冬虫夏草菌菌种分离的方法具有分离周期短、效率高等显著优点。

Description

冬虫夏草菌菌种的分离方法及其应用

技术领域

本发明属于子囊菌菌种分离和培养领域，具体涉及一种冬虫夏草菌菌种的分离方法及其应用。

背景技术

冬虫夏草菌[Ophiocordyceps sinensis(Berk.)G.H.Sung,J.M.Sung,Hywel-Jones&Spatafora(≡Cordyceps sinensis(Berk.)Sacc.)]隶属子囊菌门，是一种特产于我国青藏高原的虫生真菌，同时也是名贵的药用菌与食用菌，因而具有独特药用价值和广泛应用前景。通常意义上的冬虫夏草是指冬虫夏草菌侵染宿主昆虫蝠蛾幼虫后，二者经一段较长时间的共存后宿主昆虫死亡变成僵虫，冬虫夏草菌以虫体为培养基进行有性生殖进而长出子座而形成的虫菌复合体。科学研究表明冬虫夏草具有广泛的药理作用，包括抗氧化、抗肿瘤、抗衰老、降血糖、降血脂、免疫调节等等。近年来由于其有限的产量，野生资源越来越难以满足日益增加的市场需求，生态环境也面临前所未有的压力，冬虫夏草已被相关部门列为二级保护物种。面对野生冬虫夏草资源的日益枯竭、高山草甸生态遭受到的严重破坏，以及人民生活水平提高引起的日益高涨的需求，实现大规模人工培植冬虫夏草会是一个很好的解决途径。实现冬虫夏草的人工培植，有几个关键问题需要解决，例如宿主昆虫的人工饲养与高效繁殖、侵染途径和侵染效率的突破、批量接菌和重复出草的实现等，而高效的菌种分离纯化方法是实现这一目标的前提条件之一。

冬虫夏草菌的菌种分离，传统方法一般采用固体平板分离法，即无菌操作条件下，经表面消毒后剖开野外采集的冬虫夏草鲜草，取出合适大小的组织块，接种于含加富马铃薯(PDA)的固体平板，待接种的组织块萌发形成新的菌丝体，在固体平板上形成菌落(常常需要经历数月之久)，再进一步分离纯化并验证。采用传统的分离方法分离冬虫夏草菌，鉴于该菌低温生长的特性，其分离周期可长达数月之久，再加上验证，整个周期可长达1年甚至更久。漫长的分离培养过程使其很容易被其它微生物污染，导致前功尽弃。该方法繁琐、效率低、周期长，且整个过程不可检测，是实现冬虫夏草产业化的一个重要的制约因素。

发明内容

因此，本发明的一个目的是提供一种高效便捷的冬虫夏草菌菌种的分离方法。

本发明的另一目的是提供一种冬虫夏草的人工培植方法。

本发明的另一个目的是提供一种液体培养基在培养冬虫夏草菌中的用途。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

一方面，本发明提供一种冬虫夏草菌菌种的分离方法，包括以下步骤：

1)在无菌条件下培养冬虫夏草鲜草并收集弹射的冬虫夏草子囊孢子；

2)将步骤1)收集的冬虫夏草子囊孢子在无菌条件下用无菌水洗涤后稀释得到子囊孢子稀释液；

3)将适量步骤2)所述子囊孢子稀释液在水琼脂平板上涂布展开、培养并萌发形成菌丝团；

4)挑取单个子囊孢子萌发形成的菌丝团转移至液体培养基继续培养，所述菌丝团在所述液体培养基中产生一定数量芽生孢子后，接种至新的液体培养基或者固体培养基扩大培养，得到冬虫夏草菌。

在本发明的某些实施方案中，所述液体培养基包含85～95％的昆虫细胞培养液和5～15％的胎牛血清，更优选地，所述昆虫细胞培养液选自Insect-XPRESS、IPL-41、Sf9和TNM-FH等。

在本发明的某些实施方案中，所述步骤1)中的所述冬虫夏草鲜草为野外采集的。

在本发明的某些实施方案中，在所述步骤1)中：

所述培养在黑暗/光照时间为14：10～22：2的光周期下进行，

所述培养在含水量为60～80％的基质中进行，和/或

所述培养在12～18℃的温度下进行，优选地，所述培养在恒温培养箱中进行。

在本发明的某些实施方案中，所述步骤1)的培养是按以下方法进行的：

将2～10根冬虫夏草鲜草垂直种植于含有含水量为60～80％的基质的容器中，子座暴露于基质上方，子座下方的基质表面放置灭菌的锡箔纸，将所述容器放置于12～18℃的恒温培养箱中，每天给予2～10小时的光照。

在本发明的某些实施方案中，在所述步骤2)中：

所述洗涤和稀释是使用含青霉素和链霉素的无菌水进行的；

所述洗涤为离心洗涤；

所述稀释为梯度稀释；优选为2～5个梯度稀释，每个梯度稀释10倍；

所述子囊孢子稀释液中子囊孢子的密度是通过倒置显微镜镜检确定的；和/或

所述子囊孢子稀释液中子囊孢子的密度为在显微镜下放大100倍后的一个视野里1～10个子囊孢子。

在本发明的某些实施方案中，在所述步骤2)中：

所述洗涤在1.5mL离心管中进行；

所述稀释在直径为6cm的培养皿中进行；和/或

所述洗涤在3000～8000RPM的离心条件下进行2～5min。

在本发明的某些实施方案中，在所述步骤3)中：

所述水琼脂平板为琼脂含量为0.6～1.5％的固体琼脂平板，平板厚度为0.15～1.0cm；

所述涂布展开是使用酒精灯灼烧后冷却的三角玻璃涂棒进行的；和/或

在本发明的某些实施方案中，在所述步骤4)中：

所述挑取单个子囊孢子萌发形成的菌丝团是通过以下方法完成的：用倒置显微镜观察子囊孢子萌发，标记出单个的萌发的子囊孢子的位置，并将仅含有所述标记的单个子囊孢子萌发形成的菌丝团的水琼脂块取出；和/或所述继续培养和扩大培养在12～18℃的温度下进行，优选地，所述继续培养和扩大培养在恒温培养箱中进行。

另一方面，本发明提供一种冬虫夏草的人工培植方法，包括用本发明所述的冬虫夏草菌菌种的分离和培养方法得到冬虫夏草菌，然后将其接种于宿主昆虫的步骤。

又一方面，本发明还提供一种液体培养基在培养冬虫夏草菌中的用途，其中所述液体培养基用于培养单个冬虫夏草子囊孢子萌发形成的菌丝团从而得到冬虫夏草菌的芽生孢子，再将所述冬虫夏草菌的芽生孢子扩大培养得到冬虫夏草菌；优选地，所述液体培养基包含85～95％的昆虫细胞培养液和5～15％的胎牛血清，更优选地，所述昆虫细胞培养液选自Insect-XPRESS、IPL-41、Sf9和TNM-FH等。

传统的冬虫夏草菌种分离是通过菌丝体分离菌株，即在固体平板接种冬虫夏草菌、培养得到菌丝体，将菌丝体分离并进一步培养长出更多菌丝体。而本发明人意外地发现，通过液体培养基诱导冬虫夏草菌产生芽生孢子，通过芽生孢子分离菌株，再扩大培养得到较多菌丝体，可以极大提高菌种分离效率。芽生孢子是冬虫夏草在宿主血淋巴内增殖的主要方式，亦可通过人工培养基诱导产生。芽生孢子是一种无性孢子，本质上是短菌丝，具有薄壁、单细胞、亲水性的特点。相对于固体平板培养菌丝体而言，在液体培养基里的芽生孢子具有更高密度的萌发生长点。因此通过使用液体培养基诱导产生芽生孢子能够提高菌种分离的效率，在菌丝体发酵、菌种分离过程中具有明显优势和广阔应用前景。

另外，本发明人吃惊地发现，使用模仿昆虫血淋巴成分的商品化的昆虫细胞培养液添加一定比例的可促进菌丝萌发的胎牛血清(FBS)培养冬虫夏草菌菌种，其生长非常迅速，即使被别的微生物污染也能很快被发现。该液体培养基有利于冬虫夏草菌丝体快速生长并产生芽生孢子，与常规的固体平板分离方法相比，大大加快了菌丝生长速度，且能快速诱导芽生孢子产生，从而缩短了培养时间，保证了本发明的菌种分离培养方法的高效性。

本发明经科赫法则验证所述新分离菌种是冬虫夏草菌，即将得到的冬虫夏草菌接种到一定数量的宿主昆虫，经过一段时间的培养后形成僵虫，一段时间后于僵虫蜕裂线处长出子实体，继续在合适的条件下培养，进而产生子囊孢子。本发明还采用分子生物学方法，用CTAB法提取获得的冬虫夏草菌菌种基因组DNA，PCR扩增特定序列(引物为ITS4和ITS5)并测序、NCBI数据库进行核酸序列的比对，确定所述分离的菌株的种属。另外，在光学显微镜下观察所获得的菌种产生的分生孢子、芽生孢子、子囊孢子等各种繁殖体形态、大小、数量、产生方式等各种特征，均验证确定该菌种为冬虫夏草菌。

本发明的冬虫夏草菌菌种分离的方法从子囊孢子的收集、稀释、涂布水琼脂平板，到萌发形成菌丝、芽生孢子，乃至后期发酵形成的菌丝球、分生孢子等，其所有的生长过程与各种繁殖体形态均可随时在倒置显微镜下清晰地观察到，可以随时监测、统计并拍照。

本发明的冬虫夏草菌菌种分离的方法从子囊孢子的弹射到新菌种菌丝体的获得，其总时间可以缩短至一个月之内，相对于传统固体培养基分离菌种的方法，效率大大提高。正是由于本发明的方法高效和便捷的特点，在较短暂的分离时间内更不容易被其它微生物污染，从而也进一步体现了本发明所述冬虫夏草菌菌种分离方法的高效性。

本发明的冬虫夏草菌菌种分离的方法在分离过程中使用了营养丰富的液体培养基。考虑到冬虫夏草菌可长期在宿主昆虫血淋巴内定殖，本发明使用了模仿昆虫血淋巴成分的商品化的昆虫细胞培养液添加一定比例的可促进菌丝萌发的FBS(胎牛血清)配制而成的液体培养基。所述分离菌种在本发明的液体培养基中生长非常迅速，即使被别的微生物污染也能很快被发现，且在菌种分离初期使用量较少，因而所述液体培养基的使用具有很高的性价比和较强的可操作性，是本发明的特色之一。

可见，本发明的冬虫夏草菌菌种分离的方法中，水琼脂平板、加富液体培养基诱导产生芽生孢子和倒置显微镜的充分使用极大的提高了冬虫夏草菌菌种分离、纯化、培养的效率，为后续的大规模发酵菌丝体和大规模接种宿主昆虫提供了坚实的基础，其最大优势是高效。相对于传统分离方法，本发明的冬虫夏草菌菌种分离的方法具有分离周期短、效率高、分离过程与菌的生长全程可监控、分离过程不易被其它微生物污染等显著优点。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1为倒置显微镜下单个的冬虫夏草子囊孢子(400×)。

图2为倒置显微镜下单个子囊孢子萌发后经液体培养基继续培养长出的冬虫夏草芽生孢子(200×)。

具体实施方式

下述实施例中所用的仪器、试剂、材料等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

下述实施例中用于冬虫夏草菌菌种分离的细胞培养瓶规格均为100mL，透明塑料培养皿规格均为直径6cm。

下述实施例中所用的基质、保鲜盒、锡箔纸、保鲜膜，如无特殊说明，均经过严格的灭菌处理。如无特殊说明，下述实施例中的主要操作均在超净工作台下进行。

为了更好地理解本发明，下面以购自青海省果洛州的鲜草冬虫夏草菌株IOZ-01为例阐释本发明，该实施例用于解释而不是限制本发明。

实施例1

1.1子囊孢子的收集与稀释

将5根冬虫夏草鲜草种置于放有80％含水量基质的保鲜盒中，子座暴露于基质上方，周围小心铺放锡箔纸，保鲜盒用保鲜膜封口，每日接触日光灯光线6小时，其余时间黑暗处理，培养箱温度为14℃。培养10～15天，子囊孢子开始弹射。分别收集弹射的子囊孢子于1.5mL离心管中，加入1mL无菌水(含青霉素和链霉素)，用1mL枪头打散、混匀成团的子囊孢子并离心(5000RPM，3min)。重复洗涤三次后在一次性塑料培养皿中做5个梯度稀释(10^-1，10^-2，10^-3，10^-4，10^-5)，倒置显微镜下观察各个梯度稀释液中子囊孢子的密度，选取视野(放大倍数为100×)中含有1～3个子囊孢子的培养皿待下一步转移至水琼脂平板的操作。

1.2水琼脂平板上子囊孢子的培养与萌发后的标记

水琼脂平板使用0.7％(琼脂粉和蒸馏水的重量比体积)的固体平板，厚度约为2mm。水琼脂平板的配制如下：称取0.7g琼脂粉，放入装有100mL蒸馏水的200mL三角瓶，封口膜封口后，高压蒸汽灭菌(121℃，20min)，灭菌完成后立刻取出，于超净台下用移液器取出至培养皿，每个培养皿中放5mL液体状态的水琼脂，充分冷却凝固后备用。

取上述1.1项下选取的合适浓度的子囊孢子/灭菌水1mL，小心涂布于凝固的水琼脂平板，待平板表面的水分充分渗透挥发，用封口膜把培养皿封口后倒置于培养箱，16℃静置培养。每隔3天取出于倒置显微镜下观察，培养一周左右可观察到子囊孢子萌发。用标号笔的细头于培养皿底部仔细标记出已萌发的子囊孢子的位置，确保萌发的子囊孢子位于标记的圆圈范围以内，继续16℃静置培养。

1.3单个萌发的子囊孢子挑取后的液体培养

超净工作台下用移液器取4.5mL昆虫细胞培养液Insect-XPRESS于细胞培养瓶，加入0.5mL FBS(胎牛血清)，用镊子和枪头小心将上述1.2项中标记萌发的子囊孢子的圆圈内的水琼脂取出，小心放到上述装有昆虫细胞培养液和10％FBS的细胞培养瓶中，每个细胞培养瓶中放一个含标记萌发子囊孢子的水琼脂块，倒置显微镜下观察，确保水琼脂块中含有菌丝团，然后16℃静置培养。每隔3天观察一次，待菌丝团长出较多的芽生孢子(达到10³个/mL级别)，开始下一步的分离纯化。用移液器取0.5mL上述已产生较多芽生孢子的培养液，放入新的细胞培养瓶(含上述体系的4.5mL细胞培养液和10％FBS)，继续16℃静置培养。扩大培养所述分离菌株2～3次后，经下述1.4项的验证后对所述新分离菌株进行编号，培养液可用作发酵生产的种子液，亦可涂布固体平板，用于科研或生产。观察整个培养过程中所述新分离冬虫夏草菌株的各种形态，尤其是微循环产孢、芽生孢子、分生孢子等的形态，辅助验证所述新分离菌株是否是冬虫夏草菌。

1.4新分离菌株接种宿主昆虫的验证

采用常规方法，将新分离菌株接种宿主昆虫4龄幼虫100头后，15℃正常饲养。一个月后取所述染菌幼虫血淋巴于显微镜下观察，统计接种率为80％，幼虫存活率为95％。继续饲养所述染菌幼虫，接种后200天开始陆续出现僵虫，收集僵虫头朝上埋于装有80％含水量基质的保鲜盒，每天给予6小时的光照促进子座的萌发和生长，并适量喷水保湿。约46天后可观察到子囊孢子弹射。统计出草率为60％。

1.5核酸测序方法进一步确认新分离菌株的种属

采用CTAB试剂盒提取上述1.4项染菌幼虫血淋巴分离出的冬虫夏草菌株IOZ-01菌丝体的基因组DNA，ITS片段扩增采用了通用引物即ITS5(5’-ggaagtaaaagtcgtaacaagg-3’)/ITS4(5’-tcctccgcttattgatatgc-3’)(White et al.，1990)。各片段PCR扩增均采用25μl体系，每个反应体系成分及含量如下：Mix，12.5μl；正反引物各0.25μl；灭菌去离子水，11μl；DNA模板，1μl。PCR反应程序如下：

将PCR产物送华大基因测序，测序结果用DNAstar软件读出后经NCBI数据库比对，确定所述新分离菌株为冬虫夏草菌。

实施例2～6

采用实施例1中1.1～1.4项的方法分离和培养冬虫夏草菌，不同之处在于其中1.1～1.4项下各参数如下表中所示。

实施例7

采用实施例1中1.1～1.4项的方法分离和培养冬虫夏草菌，不同之处在于其中1.3项中分离培养用的液体培养基各参数如下表中所示。

Claims

1.一种冬虫夏草菌菌种的分离方法，包括以下步骤：

4)挑取单个子囊孢子萌发形成的菌丝团转移至液体培养基继续培养，所述菌丝团在所述液体培养基中产生一定数量芽生孢子后，接种至新的液体培养基或者固体培养基扩大培养，得到冬虫夏草菌，其中所述液体培养基包含85～95％的昆虫细胞培养液和5～15％的胎牛血清。

2.根据权利要求1所述的方法，所述昆虫细胞培养液选自Insect-XPRESS、IPL-41、Sf9和TNM-FH。

3.根据权利要求1所述的方法，其中所述步骤1)中的冬虫夏草鲜草为野外采集的。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，在所述步骤1)中：

所述培养在黑暗/光照时间为14：10～22：2的光周期下进行，

所述培养在含水量为60～80％的基质中进行，和/或

所述培养在12～18℃的温度下进行。

5.根据权利要求1所述的方法，其中在所述步骤1)中，所述培养在恒温培养箱中进行。

6.根据权利要求1所述的方法，其中所述步骤1)的培养是按以下方法进行的：

7.根据权利要求1所述的方法，其中在所述步骤2)中：

所述洗涤和稀释是使用含青霉素和链霉素的无菌水进行的；

所述洗涤为离心洗涤；

所述稀释为梯度稀释；

8.根据权利要求1所述的方法，其中在所述步骤2)中，所述稀释为2～5个梯度稀释，每个梯度稀释10倍。

9.根据权利要求1所述的方法，其中在所述步骤2)中：

所述洗涤在1.5mL离心管中进行；

所述稀释在直径为6cm的培养皿中进行；和/或

所述洗涤在3000～8000RPM的离心条件下进行2～5min。

10.根据权利要求1所述的方法，其中在所述步骤3)中：

所述涂布展开是使用酒精灯灼烧后冷却的三角玻璃涂棒；和/或

所述培养在12～18℃的温度下进行。

11.根据权利要求1所述的方法，其中在所述步骤3)中，所述培养在恒温培养箱中进行。

12.根据权利要求1所述的方法，其中在所述步骤4)中：

所述挑取单个子囊孢子萌发形成的菌丝团是通过以下方法完成的：用倒置显微镜观察子囊孢子萌发，标记出单个的萌发的子囊孢子的位置，并将仅含有所述标记的单个子囊孢子萌发形成的菌丝团的水琼脂块取出；和/或

所述继续培养和扩大培养在12～18℃的温度下进行。

13.根据权利要求1所述的方法，其中在所述步骤4)中，所述继续培养和扩大培养在恒温培养箱中进行。

14.一种冬虫夏草的人工培植方法，包括用权利要求1～13中任一项所述的冬虫夏草菌菌种的分离和培养方法得到冬虫夏草菌，然后将其接种于宿主昆虫的步骤。

15.一种液体培养基在培养冬虫夏草菌中的用途，其中所述液体培养基用于培养单个冬虫夏草子囊孢子萌发形成的菌丝团从而得到冬虫夏草菌的芽生孢子，再将所述冬虫夏草菌的芽生孢子扩大培养得到冬虫夏草菌，所述液体培养基包含85～95％的昆虫细胞培养液和5～15％的胎牛血清。

16.根据权利要求15所述的用途，其中，所述昆虫细胞培养液选自Insect-XPRESS、IPL-41、Sf9和TNM-FH。