CN114214214B - 一株灵芝菌株及其杂交育种方法 - Google Patents

一株灵芝菌株及其杂交育种方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一株灵芝菌株及其杂交育种方法，灵芝菌株为灵芝Ganoderma lingzhi TL‑3，于2021年2月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.21458，本发明通过原生质体单核化杂交育种技术选育，集合了双亲的优势于一体，具有单产量高、生物学效率高，子实体多糖和三萜含量高、综合农艺性状优良等特点，与国家认定品种TL‑1相比，平均单产提高12.23％，生物学效率提高12.37％，子实体多糖含量提高1.87％，子实体三萜含量提高37.5％，具有较高的应用推广价值。

Description

一株灵芝菌株及其杂交育种方法
技术领域
本发明涉及一株灵芝菌株及其杂交育种方法，属于食用菌育种方法技术领域。
背景技术：
灵芝（Ganoderma lingzhiSheng H. Wu, Y. Cao&Y.C. Dai），又称“仙草”、“万年茸”，是一种具有悠久历史的药用真菌。《本草纲目》中记载灵芝具有益心气，活血，安神，益肺气等功效，《中华人民共和国药典》收载灵芝为法定中药。灵芝中含有多糖、三萜等多种活性成分，具有抗肿瘤、调节免疫力、舒缓心脑血管等功效，已被广泛应用于医药行业。
近年来，随着灵芝新药用功效的不断发现及其保健作用的突出，人们对灵芝的需求量大幅增加，灵芝产业化、规模化发展迅速。
灵芝孢子很难萌发，国外有用酵母菌与灵芝孢子共培养，培养时间4—6周，可诱导少量灵芝孢子萌发，萌发率低于1/108。国外的这种方法存在以下缺点：①试验时间长；②萌发率很低，需要大量的试验才能获得可用于杂交的单孢菌株；③需要除去酵母菌后才能用于杂交。由于酵母菌的生长速度远远快于灵芝菌丝，如果没有除去酵母菌，经常会由于酵母菌大量生长而使灵芝菌丝不生长。国内也有少量杂交育种灵芝的方法，但是得到的灵芝菌株子实体多糖及三萜含量少。
鉴于灵芝具有很高的药用价值，灵芝产业又是一个很大的产业，亟需研发一株功能性指标高的灵芝新菌株及高效的杂交育种方法。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供一株具有优良生长性状的灵芝菌株，本发明还提供上述灵芝菌株杂交育种的方法，通过单核杂交育种方法，可得到生长性能优异，遗传稳定性好的杂交子菌株，该菌株子实体多糖及三萜含量均高于国家认定品种泰山赤灵芝1号（TL-1）。
本发明是通过如下技术方案实现的：
一株灵芝菌株，所述灵芝菌株为灵芝Ganoderma lingzhiTL-3，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.21458，保藏日期为2021年2月3日。
上述灵芝菌株的杂交育种方法，包括灵芝亲本菌株选择、亲本原生质体制备、亲本原生质体再生、单核菌株筛选、单核菌株杂交，杂交菌株培养并筛选，包括步骤如下：
（1）亲本选择：选取泰山赤灵芝1号和野生灵芝菌株4895作为亲本，转接到PDA斜面培养基中进行活化；
（2）亲本原生质体制备：将活化好的亲本菌种接种至液体PDA加富培养基中摇床培养5-7天，培养好的菌液除去细胞壁、清洗，得到亲本原生质体悬浮液；
（3）亲本原生质体纯化再生：将步骤（2）亲本原生质体悬浮液纯化后，用液体再生培养基稀释，并涂布于固体再生培养基上，恒温倒置培养至长出再生菌落；
（4）单核菌株筛选：从再生菌落中挑取单菌落转接到PDA加富培养基平板上进行培养，待菌落长到3-5cm时，挑取边缘菌丝镜检，筛选单核菌株；
（5）单核菌株杂交：将相互配对的两个单核菌株接种到同一个PDA加富培养基平板上，恒温对峙培养，当两个菌株的菌丝相互接触后，挑取交接处纯杂交菌株；
（6）优良杂交菌株筛选：常规方法培养所获得的杂交菌株，并从中筛选出杂种优势强、相对性状优良的杂交菌株。
根据本发明优选的，步骤（1）中，PDA斜面培养基按现有技术进行，市场购得。
根据本发明优选的，步骤（2）中，亲本原生质体悬浮液的具体步骤如下：
1) 将活化好的亲本菌种接种至液体PDA加富培养基放置摇床中培养7天，培养温度为25℃，转速为100 r/min，得菌液；
2）于超净工作台上将步骤1）制得的菌液分别置入灭菌离心管中，10000 r/min转速离心15 min，去上清液，沉淀菌丝体用无菌水洗涤，滤纸吸干菌丝水分；
3）称取0.5 g步骤2）获得的菌丝放入离心管中，加入2 mL浓度为2%的溶壁酶，30℃恒温水浴酶解2.5 h，期间每隔15 min震荡一次，得到酶解液；
4）在酶解液中加入2 mL浓度为0.6 mol/L甘露醇终止酶解反应，过滤除去残留菌丝，2000 r/min离心15 min，去掉上清液，剩余溶液即为含有原生质体的悬浮液。
根据本发明优选的，步骤（3）中，亲本原生质体纯化再生的具体步骤如下：
a、含有原生质体的悬浮液用0.6 mol/L甘露醇清洗2次，2000 r/min离心15 min，得到纯化原生质体；
b、将纯化的原生质体用液体再生培养基稀释，涂布于固体再生培养基平板上，25℃恒温箱中倒置培养72 h至长出再生菌落。
根据本发明优选的，步骤（5）中，两个配对菌株相距2cm接种到PDA加富培养基平板上，于25℃恒温箱对峙培养7 d。
根据本发明优选的，步骤（5）中，菌丝相互接触后，挑取交接处的菌丝镜检，如果有锁状联合，则说明杂交成功，如果没有锁状联合，则说明这两个单核菌株不亲和；将杂交成功组合交接处的菌丝转接到新的PDA加富培养基平板上，25℃恒温箱培养7 d，在显微镜下挑取单根菌丝的尖端部分进行分离纯化，即得纯杂交菌株。
根据本发明优选的，步骤（5）中，获得纯杂交菌株后进行杂交菌株鉴定，鉴定方法如下：将两个亲本菌株及杂交菌株接种到同一PDA加富培养基平板上，品字形排列，各菌株相距3 cm，置于25℃恒温箱中培养，观察拮抗情况，与两个亲本均有拮抗线的为真正的杂交菌株。
根据本发明优选的，PDA加富培养基组分为：土豆200 g/L、麸皮20 g/L、磷酸二氢钾1 g/L、硫酸镁0.5 g/L、蛋白胨3 g/L、葡萄糖20 g/L、琼脂20 g/L， pH自然。
根据本发明优选的，液体PDA加富培养基为不加琼脂的PDA加富培养基。
根据本发明优选的，固体再生培养基组分为：麦芽糖5 g/L、酵母膏5 g/L、葡萄糖10 g/L、甘露醇0.6 mol/L、琼脂20 g/L， pH自然。
根据本发明优选的，液体再生培养基为不加琼脂的固体再生培养基。
本发明的灵芝Ganoderma lingzhiTL-3具有以下特征：
灵芝Ganoderma lingzhiTL-3菌株的平板菌丝生长特征：菌丝浓密、洁白，长势强，菌落边缘较整齐，平均长速为0.74 cm/d，快于亲本菌株4895（0.67 cm/d）。
灵芝Ganoderma lingzhiTL-3菌株的袋栽培养特征：发菌速度为0.62 cm/d，长势强壮，与两个亲本菌株相比均无显著性差异；原基出现较整齐，从开口到原基出现的时间间隔为7d～10 d，从开口到子实体采收的时间间隔为45 d左右。
灵芝Ganoderma lingzhiTL-3的子实体形态特征：子实体肾圆形；菌盖长8.0 cm～14.8 cm，宽4.1 cm～8.9cm，厚2.1 cm～3.7 cm，正面黄褐色到红褐色，有光泽，表面有明显的放射性纵脊和同心环纹，腹面黄色，布满菌管，管口圆形，平均每毫米3～5个，菌盖边缘较圆钝；菌肉淡褐色；菌柄1.5cm～4.8 cm，扁圆柱状，光滑且亮，红褐色至紫褐色。
灵芝Ganoderma lingzhiTL-3的生物学效率：生物学效率高，其干芝生物学效率比亲本菌株TL-1提高12.37%，比亲本菌株4895提高1.11%。
灵芝Ganoderma lingzhiTL-3的子实体有效成分含量：多糖含量高，比亲本菌株TL-1提高1.87%，比亲本菌株4895提高29.76%。三萜含量比亲本菌株TL-1提高37.5%，具有较高的推广应用价值。
本发明的优点：
本发明的灵芝Ganoderma lingzhiTL-3菌株菌盖中等偏大且厚，形态较饱满，优于两亲本，菌柄长度与两亲本类似，平均单产为41.3 g/袋，生物学效率为6.36%、子实体多糖含量为1.09%，子实体三萜含量为0.22%，与国家认定品种泰山赤灵芝1号（TL-1）相比，其在产量、生物学效率、子实体有效成分含量方面具有更大的优势。
附图说明
图 1 为亲本菌株TL-1和4895的原生质体照片；
图 2 为基于ISSR分子标记的聚类树状图；
图 3为引物P4、P9对亲本及杂交菌株的ISSR扩增图谱；a图为引物P4对供试菌株的ISSR扩增图谱，b图为引物P9对供试菌株的ISSR扩增图谱；M为Marker；上箭头表示杂交菌株来自亲本TL-1的条带；下箭头表示杂交菌株来自亲本4895的条带；
图 4 为亲本菌株TL-1、4895与杂交菌株TL-3的平板菌落照片；
图 5 为亲本菌株TL-1、4895与杂交菌株TL-3的拮抗照片；
图 6为亲本菌株TL-1、4895和杂交菌株TL-3开片期的子实体照片；a为正面，b为腹面；
图 7为亲本菌株TL-1、4895和杂交菌株TL-3生长期的子实体照片；a为正面，b为腹面；
图 8为亲本菌株TL-1、4895和杂交菌株TL-3成熟期的子实体照片；a为正面，b为腹面。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做进一步具体描述，但本发明的保护范围并不仅仅局限于以下实施例，所述技术领域的普通技术人员依据以上本发明公开的内容，均可实现本发明的目的。
实施例中，泰山赤灵芝1号（TL-1）为国家食用菌认定品种，认定编号：国品认菌2007047，菌株4895，为野生菌株，采自泰山罗汉崖。
实施例1
灵芝菌株的杂交育种方法，具体步骤如下：
（1）原生质体的制备
1) 以采自泰山的野生灵芝菌株4895和国家认定品种泰山赤灵芝1号（TL-1）作为亲本， TL-1子实体多糖含量较高，综合农艺性状较好；4895菌株子实体三萜含量较高；
2）分别取亲本菌株TL-1和4895的母种菌块（大小约为0.5 cm×0.5 cm）5块，接入含有100 mL液体PDA加富培养基的250 mL三角瓶中，摇床中培养7天，培养温度为25℃，转速为100 r/min，得菌液；
3）于超净工作台上将步骤2）制得的菌液分别置入50 mL灭菌离心管中，10000 r/min离心15 min，去上清，菌丝体用无菌水洗涤一次，用滤纸吸干菌丝水分；
4）分别称取0.5 g步骤3）获得的菌丝放入5 mL离心管中，加入2 mL 2%的溶壁酶，30℃恒温水浴2.5 h，期间每隔15 min震荡一次，得到酶解液。
5）在酶解液中加入2 mL 0.6 mol/L甘露醇终止酶解反应，用含有脱脂棉的注射器过滤除去残留菌丝，2000 r/min离心15 min，去掉大部分上清液，剩余1 mL左右的溶液即为含有原生质体的悬浮液；
（2）原生质体的再生
6）将步骤5）得到的原生质体悬浮液用0.6 mol/L甘露醇清洗2次，2000r/min离心15 min，得到纯化的原生质体，制备的原生质体如图1所示。
7）将纯化的原生质体用液体再生培养基适当稀释后分别涂布于固体再生培养基平板上，25℃恒温箱中倒置培养72 h至长出再生菌落。
（3）单核菌株的筛选
从再生菌落中挑取菌落小，生长比较缓慢的单菌落分别转接到PDA加富培养基平板上，当菌落长至直径为3-5 cm时，挑取边缘菌丝，显微镜下观察是否有锁状联合，无锁状联合的即为单核菌株；
（4）单核菌株的杂交
用直径0.5 cm的金属打孔器分别将相互配对的两个单核菌株接种到同一个PDA加富培养基平板上，两者相距2 cm，于25℃恒温箱对峙培养7 d，待菌丝相互接触后，挑取交接处的菌丝镜检，如果有锁状联合，则说明杂交成功，如果没有锁状联合，则说明这两个单核菌株不亲和。将杂交成功组合交接处的菌丝转接到新的PDA加富培养基平板上，25℃恒温箱培养7 d，在显微镜下挑取单根菌丝的尖端部分进行分离纯化，即得到纯的杂交菌株。
（5）杂交菌株的鉴定
分别将两个亲本菌株及杂交菌株接种到同一PDA加富培养基平板上，“品”字形排列，各菌块相距3 cm，3次重复，置于25℃恒温箱中培养，观察拮抗情况，与两个亲本均有拮抗线的证明为真正的杂交菌株。
上述PDA加富培养基为：土豆200 g/L、麸皮20 g/L、磷酸二氢钾1 g/L、硫酸镁0.5g/L、蛋白胨3 g/L、葡萄糖20 g/L、琼脂20 g/L，pH自然。
液体PDA加富培养基为：为上述不加琼脂的PDA加富培养基。
固体再生培养基为：麦芽糖5 g/L、酵母膏5 g/L、葡萄糖10 g/L、甘露醇0.6 mol/L、琼脂20 g/L，pH自然。
液体再生培养基为：为上述不加琼脂的固体再生培养基。
实施例2
优良杂交菌株的筛选，步骤如下：
（1）液体菌种的制备
1000 mL三角瓶中加入600 mL液体培养基，先将实施例1获得的杂交菌株以及亲本菌株TL-1和4895在PDA平板培养基上活化，活化条件为25℃避光培养7 d，活化后分别用直径0.5 cm的打孔器取8个同等质量的菌块接种到液体培养基中，封好封口膜，25℃～28℃，140 r/min～160 r/min，培养7 d，制得液体菌种。
液体培养基为葡萄糖20 g/L、蛋白胨3 g/L、牛肉膏3 g/L、磷酸二氢钾1 g/L、硫酸镁0.5 g/L、维生素B1 5 mg/L， pH自然。
（2）栽培方法
熟料栽培，培养料混匀后用自动装袋窝口机装入聚丙烯塑料袋（18 cm×39 cm×0.004 cm）中，每袋装湿料1.2kg（棉籽壳48%，木屑40%，麦麸10%，石灰1%，石膏1%，含水量65%），121℃，0.11 MPa下，灭菌 3 h。待培养基料包冷却至室温后，每袋接种15 mL～20 mL步骤（1）制备的液体菌种,封口后置于25℃培养室避光培养，空气相对湿度为50%～70%，待菌丝长满菌袋后移入芝棚进行出芝期管理，去掉封口物，每天通风换气，原基期棚内温度控制在25℃～30℃，空气相对湿度85%～90%，光照强度400 lx～1500 lx，子实体生长期棚内温度控制在25℃～35℃，空气相对湿度85%～95%，光照强度400 lx～1500 lx左右，二氧化碳浓度不超过700 ppm，经过40 d左右，当芝盖边缘生长点消失，菌盖背面开始弹射出雾状红褐色孢子时，即采收。
得到生产性状优良的杂交菌株，将其命名为灵芝Ganoderma lingzhiTL-3，上述灵芝Ganoderma lingzhiTL-3，于2021年2月3日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.21458。
实验例1
优良杂交菌株农艺性状：
测量和计算各杂交菌株的农艺性状，包括菌丝长速、长势、菌盖长、宽、厚度、菌柄长度、生物学效率、子实体多糖和三萜含量。
子实体中多糖含量的测定参照NY/T 1676-2008《食用菌中粗多糖含量的测定》；
生物学效率为子实体干重（g）除以培养料干重（g）乘以100%。用DPS软件对测量结果进行统计学分析，综合评价筛选出优良杂交菌株Z5，命名为TL-3，统计学分析结果见表1。
表1
注：大写字母表示在0.01水平上的显著性差异，小写字母表示在0.05水平上的显著性差异。+++表示菌丝长势强壮。
袋栽菌丝生长特征：杂交菌株TL-3发菌速度为0.62 cm/d，介于两个亲本之间，菌丝长势强壮、浓密，与两个亲本菌株相比均无显著性差异。
菌盖长度：杂交菌株TL-3菌盖中等偏大，平均长度为10.33 cm，比两个亲本菌株短，与亲本菌株TL-1之间有显著性差异（P<0.05），与亲本菌株4895之间无显著性差异。
菌盖宽度：杂交菌株TL-3菌盖平均宽度为6.64 cm，与两个亲本之间均无显著性差异。
菌盖厚度：杂交菌株TL-3菌盖平均厚度为2.79 cm，比两个亲本菌株厚，与亲本菌株TL-1之间有极显著性差异（P<0.01），与亲本菌株4985之间无显著性差异。
菌柄长度：杂交菌株TL-3菌柄较短，平均长度为2.06 cm，与两个亲本之间均无显著性差异。
平均单产：杂交菌株TL-3平均单产比两个亲本菌株高，比亲本菌株TL-1提高12.23%，比亲本菌株4895提高0.98%，与亲本菌株TL-1之间有显著性差异（P<0.05），与亲本菌株4895之间无显著性差异。
生物学效率：杂交菌株TL-3生物学效率比两个亲本菌株高，比亲本菌株TL-1提高12.37%，比亲本菌株4895提高1.11%，与亲本菌株TL-1之间有显著性差异（P<0.05），与亲本菌株4895之间无显著性差异。
子实体多糖含量：杂交菌株TL-3子实体多糖含量比两个亲本菌株高，比亲本菌株TL-1提高1.87%，比亲本菌株4895提高29.76%，与亲本菌株TL-1之间无显著性差异，与亲本菌株4895之间有极显著差异（P<0.01）。
子实体三萜含量：杂交菌株TL-3子实体三萜含量介于两个亲本之间，比亲本菌株TL-1提高37.5%，与两个亲本之间均有极显著性差异（P<0.01）。
子实体形态特征：杂交菌株TL-3出芝整齐；子实体肾圆形；菌盖长8.0 cm～14.8cm，宽4.1 cm～8.9 cm，厚2.1 cm～3.7 cm，正面黄褐色到红褐色，有光泽，表面有明显的放射性纵脊和同心环纹，腹面黄色，布满菌管，管口圆形，平均每毫米3～5个，菌盖边缘较圆钝；菌肉淡褐色；菌柄1.5 cm～4.8 cm，扁圆柱状，光滑且亮，红褐色至紫褐色。
实验例2
利用ISSR分子标记鉴定杂交菌株TL-3，方法如下：
（1）菌丝基因组DNA的提取
将活化好的亲本菌株TL-1、4895和杂交菌株Z4、TL-3分别接种于PDA平板培养基上，25℃避光培养10 d，用小刀将菌丝轻轻刮下，放入1.5 mL离心管中，称重备用。采用真菌DNA提取试剂盒分别提取菌丝基因组DNA，琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计分别检测DNA的纯度和浓度。
（2）引物的筛选
参考中华人民共和国农业行业标准NY/T 1730-2009《食用菌菌种真实性鉴定ISSR法》中推荐的28条引物分别对供试菌株进行ISSR-PCR扩增，引物编号及序列见表2。ISSR扩增反应体系为20 μL：10 μL 2× Super PCR Mix，1 μL引物（10 μmol/L），1 μL DNA模板（20 ng/μL），8 μL ddH2O。ISSR扩增反应程序为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；72 ℃后延伸10 min，4 ℃保存。PCR产物进行1.5%的琼脂糖凝胶电泳，检测扩增结果，根据扩增条带的稳定性和多态性筛选出适合用于ISSR分析的引物18条，分别为P3、P4、P8、P9、P10、P11、P12、P13、P14、P16、P19、P20、P21、P22、P23、P25、P27、P28。
表2 ISSR引物编号及序列
实验例3：遗传相似性分析
对18条引物扩增出的条带进行统计，扩增条带的有无分别记为1或0，在NTSYS软件的similarity模块中得到相似性矩阵，基于相似性矩阵采用非加权组平均法（UPGMA）进行遗传相似性聚类分析，聚类树状图见图2。从聚类图上可以看出，杂交菌株TL-3与亲本菌株TL-1和4895之间的亲缘关系均较远，遗传差异较明显。
实验例4：ISSR分子标记鉴定
从筛选出的18条引物中挑选出扩增效果较好的引物P4、P9作为ISSR分子标记验证杂交菌株的引物，扩增图谱见图3。结果表明杂交菌株TL-3扩增条带中同时包含了亲本菌株TL-1和4895的特异性条带，从而在分子水平上进一步证明了TL-3为亲本菌株TL-1和4895的杂交菌株。
实施例3
杂交菌株TL-3的栽培方法，具体步骤如下：
（1）液体菌种的制备
1000 mL三角瓶中加入600 mL液体培养基，将在PDA培养基上活化（活化条件为25℃避光培养7 d）的杂交菌株以及亲本菌株TL-1和4895，分别用直径0.5 cm的打孔器取8个同等质量的菌块接种到液体培养基中，封好封口膜，避光静置24 h后置于恒温摇床或磁力搅拌器上，25℃～28℃，140 r/min～160 r/min，培养5 d，制得液体菌种。
上述PDA培养基为：土豆200 g/L、葡萄糖20 g/L、琼脂20 g/L，其余为水，pH自然。
液体培养基为：葡萄糖20 g/L、蛋白胨3 g/L、牛肉膏3 g/L、磷酸二氢钾1 g/L、硫酸镁0.5 g/L、维生素B1 5 mg/L，其余为水，pH自然。
（2）栽培方法
熟料栽培，培养料混匀后用自动装袋窝口机装入聚乙烯折角袋（16 cm×35 cm×0.004 cm）中，每袋装湿料1.2 kg（棉籽壳38%，木屑30%，玉米芯20%，麦麸10%，石灰1%，石膏1%，含水量65%左右），121℃，0.11 MPa下，灭菌3 h。待培养基料包冷却至室温后，每袋接种15 mL～20 mL上述步骤（1）制备的液体菌种,封口后置于25℃培养室避光培养，空气相对湿度为50%～70%。待菌丝长满菌袋后移入芝棚，去掉封口物，进入出芝期管理，原基期棚内温度控制在25℃～30℃，空气相对湿度85%～90%，光照强度400 lx～1500 lx，每天通风换气，大约7 d～10 d原基即可出现，用消毒刀片将多余的原基削去，每袋口只留一个健壮的原基。子实体生长期棚内温度控制在25℃～35℃，空气相对湿度85%～95%，光照强度400 lx～1500 lx左右，二氧化碳浓度不超过700 ppm，当芝盖边缘白色生长点消失，芝片不再增厚，背面雾状红褐色孢子弹射完毕时，即可采收。
实验例5：对杂交菌株TL-3进行遗传稳定性测定:
将原代TL-3杂交菌株接种在PDA培养基上进行培养，至长满培养皿后，取尖端菌丝进行传代培养，连续传代至第5代，对每代杂交菌株进行栽培，各代农艺性状数据见表3。传1代至5代的杂交菌株TL-3菌丝生长情况及子实体形态特征基本一致，发菌速度为0.60 cm/d～0.68 cm/d，平均单产为39.8 g/袋～43.7g/袋，生物学效率较高，均在6%以上，子实体多糖和三萜含量均较高，分别为1.07%～1.15%和0.21%～0.27%。杂交菌株TL-3在连续传5代后，每代之间及与原代之间在平均发菌速度、平均单产、生物学效率、子实体多糖及三萜含量等农艺性状方面均无明显差异，说明杂交菌株TL-3遗传稳定性较好。
表3
实验例6：
1、将亲本菌株TL-1、4895与杂交菌株TL-3分别接种到平板上，平板菌落对比如图4所示。
、将亲本菌株TL-1、4895与杂交菌株TL-3接种到同一PDA加富培养基平板上，“品”字形排列，各菌块相距3 cm，3次重复，置于25℃恒温箱中培养，观察拮抗情况，拮抗测试结果如图5所示，实验结果表明，杂交菌株对亲本菌株TL-1、4895抗性较佳。
3、亲本菌株TL-1、4895和杂交菌株TL-3不同生长时期的子实体正面和腹面照片，如图6-8所示。

Claims (1)

1.一株灵芝菌株，所述灵芝菌株为灵芝Ganoderma lingzhi TL-3，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.21458，保藏日期为2021年2月3日。
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