CN107893034B - 一种金针菇病原细菌的鉴定及抗病白色金针菇菌株的筛选方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种金针菇病原细菌的鉴定及抗病白色金针菇菌株的筛选方法，该抗病白色金针菇菌株，其分类名称为金针菇(Flammulina velutipes)，并已于2017年10月27日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC NO：14789。本发明还公开了一种抗病白色金针菇菌株的筛选方法以及抗病白色金针菇子实体的栽培料配方。

Description

一种金针菇病原细菌的鉴定及抗病白色金针菇菌株的筛选 方法

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及一种金针菇病原细菌的鉴定及抗 病白色金针菇菌株的筛选方法。

背景技术

金针菇(Flammulina velutipes)又名构菌、冬菇、毛柄金钱菌，富含蛋白 质、多糖、氨基酸和膳食纤维等多种营养物质，且脂肪含量较低，具有抗氧化、 抗肿瘤、抗病毒、护肝等多种功能，经常食用可明显提高人体免疫力。

金针菇品种按照子实体颜色分为黄色金针菇和白色金针菇。白色金针菇因 菇体质地鲜嫩柔软、外观色泽佳、产量高等特点成为金针菇工厂化栽培主栽品 种，但该品种抗病性较差，对设备、管理要求高，容易出现腐烂病等。若搔菌 时感染，则使料面变褐；后期感染则在幼蕾表面出现褐色水渍状病斑，菌柄感 染后呈水渍状，松软，褐色，停止生长，成团腐烂，最后菌盖亦变褐色水渍状。 目前，河北省金针菇工厂化栽培配套设施及管理水平相对较差，尤其在周年栽 培过程中，容易导致病原菌逐年累积，若在制种、搔菌、喷水等栽培过程中操 作不当，都可能引起病害大面积发生，严重时发病率可达到80％以上，造成白 色金针菇产量和品质的严重下降，但引起白色金针菇感染的病原细菌还未见报 道。

发明内容

针对抗病性较差、容易出现腐烂病的技术问题，本发明提供一种抗病白色 金针菇菌株。

以及，本发明还提供一种抗病白色金针菇菌株的筛选方法。

为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：

一种抗病白色金针菇菌株，其分类名称为金针菇(Flammulina velutipes)， 并已于2017年10月27日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心，其保藏编号为CGMCC NO：14789；保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1 号院3号。

本发明所提供的抗病白色金针菇菌种可以作为栽培白色金针菇的基础生产 资料，对白色金针菇生产起着关键性作用，直接影响其产量和质量。

以及，一种抗病白色金针菇菌株的筛选方法，包括以下步骤：

步骤a、分离并富集白色金针菇病原细菌；

步骤b、将白色金针菇菌株SH9作为亲本收集孢子，采用双层平板法结合 多孢杂交，筛选对步骤a所得白色金针菇病原细菌具有抗病性的白色金针菇抗 病菌株，采用含毒介质法对所述白色金针菇抗病菌株进行抗病性复筛。

本发明通过分离、富集白色金针菇病原细菌，可以有针对性地培养抗病菌 株；通过筛选得到抗病菌株，通过复筛得到抗病性更强的抗病菌株。

以及，一种抗病白色金针菇孢子，所述抗病白色金针菇孢子为通过培养上 述抗病白色金针菇菌株得到的孢子。

以及，一种抗病白色金针菇菌丝体，所述抗病白色金针菇菌丝体为通过培 养上述抗病白色金针菇菌株得到的菌丝体。

以及，一种抗病白色金针菇子实体，所述抗病白色金针菇子实体为通过培 养上述抗病白色金针菇菌株得到的子实体。

以及，上述抗病白色金针菇菌株子实体的栽培料配方，所述栽培料包括下 列百分比的以下成分：棉籽皮35wt％，麸皮18wt％，木屑20wt％，玉米芯20wt％， 豆饼粉5wt％，石膏2wt％。该栽培料配方适宜金针菇生长，尤其适用于白色金 针菇的工厂化栽培。

附图说明

图1为金针菇病原细菌的分离

图2为金针菇致病性测定

图3为金针菇病原细菌JXN-3在不同培养基上的菌落形态

图4为金针菇病原细菌JXN-3的电镜观察

图5为基于16S rRNA序列构建菌株JXN-3的系统发育树

图6为基于gyrB基因序列构建菌株JXN-3的系统发育树

图7为基于ppk基因序列构建菌株JXN-3的系统发育树

图8为基于recA基因序列构建菌株JXN-3的系统发育树

图9为基于ropB基因序列构建菌株JXN-3的系统发育树

图10为不同pH对菌株JXN-3生长的影响

图11为菌株JXN-3的耐盐测定

图12为筛选出的金针菇菌株JK502与亲本的菌落形态

图13为抗病金针菇菌株的复筛

图14为筛选出的金针菇JK502与亲本SH9出菇试验

图15为筛选出的金针菇JK502与亲本SH9的ITS电泳图

图16为基于ITS序列构建的金针菇JK502的系统发育树

附图说明

11发病金针菇

12首次分离得到的金针菇病原细菌JXN-3单菌落

21重新接种病原细菌JXN-3悬液的金针菇

22再次分离得到的金针菇病原细菌JXN-3单菌落

31金针菇病原细菌JXN-3在PDA培养基上的菌落

32金针菇病原细菌JXN-3在金氏A培养基上的菌落

33金针菇病原细菌JXN-3在金氏B培养基上的菌落

121亲本SH9菌株

122抗病JK502菌株

123亲本SH9菌株在显微镜下菌丝形态

124抗病菌株JK502在显微镜下菌丝形态

131未加菌的亲本SH9

132添加无菌滤液的亲本SH9

133未加菌的金针菇JK502

134添加无菌滤液的金针菇JK502

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施 例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅 用以解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明实施例提供一种抗病白色金针菇菌株，其分类名称为金针菇 (Flammulinavelutipes)，并已于2017年10月27日保藏在中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC NO：14789。该菌株对 于致病菌具有良好的抗病性。

以及，本发明实施例还提供一种抗病白色金针菇菌株的筛选方法，包括以 下步骤：

步骤a、分离并富集白色金针菇病原细菌；

步骤b、将白色金针菇菌株SH9作为亲本收集孢子，采用双层平板法结合 多孢杂交，筛选对步骤a所得白色金针菇病原细菌具有抗病性的白色金针菇抗 病菌株，采用含毒介质法对所述白色金针菇抗病菌株进行抗病性复筛。

本方案采用的抗病性复筛方法可以人为加大金针菇病原细菌代谢产物的浓 度，进而筛选出抗病性更强的金针菇菌株。

具体地，所述步骤a中所述富集白色金针菇病原细菌的方法为PCR扩增， 所述PCR扩增具体为：以27F和1492R为引物对所述16S rDNA的PCR扩增； 以gyrB-2F和gyrB-4R为引物对所述gyrB的PCR扩增；以rpoB-2Fa和rpoB-5R 为引物对所述rpoB基因的PCR扩增；以recA-6Fa和recA-7R为引物对所述recA 的PCR扩增；以ppk-3F和ppk-R为引物对所述ppk基因的PCR扩增；上述各 引物的序列为：

27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3′；

1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′；

gyrB-2F：ACC GTC GAG TTC GAC TAC GA；

gyrB-4R：CCT CGG TGT TGC CScA RCT T；

rpoB-2Fa：ACB GTS TTY ATG GGY GAY TT；

rpoB-5R：CGA TGA ANC CGA ASG VGT TG；

recA-6Fa：GGY CGM ATC RTH GAG ATC TAC；

recA-7R：GTG TAC CAS GMR CCS GAY TT；

ppk-3F：GAG AAC CTS MTC CAG GCS CT；

ppk-R：GGT TGC GGT GCA TCA TGT CG。

进一步优选地，所述步骤a还包括对所述白色金针菇病原细菌进行致病性 测定，所述致病性测定包括以下步骤：将纯化的菌株配置成悬浮液，喷雾接种 于白色金针菇子实体上，取成团腐烂的子实体，重新分离并鉴定病原菌。

进一步优选地，所述步骤a还包括对所述白色金针菇病原细菌进行分子鉴 定，所述分子鉴定包括以下步骤：提取所述病原细菌的基因组DNA，对16S rDNA以及gyrB基因、rpoB基因、recA基因和ppk基因进行PCR扩增，纯化 PCR扩增产物，连接T3载体，对阳性克隆菌液进行测序，确定菌株种属。

以及，通过培养所述抗病白色金针菇菌株得到的孢子、菌丝体、子实体也 属于本发明的保护范围。

以及，本发明实施例还提供上述抗病白色金针菇菌株子实体的栽培料配方， 所述栽培料包括下列百分比的以下成分：棉籽皮35wt％，麸皮18wt％，木屑 20wt％，玉米芯20wt％，豆饼粉5wt％，石膏2wt％。该栽培料中不含动物性成 分，可减少栽培料的污染率和重金属含量，且该栽培料中石膏含量较低，不会 增加栽培料pH，更适宜金针菇生长。

为了更好的说明本发明实施方式，下面通过实施例做进一步的举例说明。

实施例所用培养基：

NA固体培养基(1L)：葡萄糖10g，蛋白胨5g，牛肉浸膏3g，酵母浸膏 1g，琼脂15g，pH6.8-7.0；

NA液体培养基(1L)：葡萄糖10g，蛋白胨5g，牛肉浸膏3g，酵母浸膏 1g，pH 6.8-7.0；

PDA培养基(1L)：去皮马铃薯200g，切成小块煮沸半小时，然后纱布 过滤，加入葡萄糖20g及琼脂15g，分装于250mL三角瓶中灭菌待用；

金氏A培养基(1L)：蛋白胨20g，无水氯化镁1.4g，无水硫酸钾10g， 琼脂15g，甘油10mL，pH 7.2；

金氏B培养基(1L)：蛋白胨20g，磷酸氢二钾1.5g，硫酸镁1.5g，琼脂 15g，pH 7.2。

1、金针菇病原细菌的分离

从邢台市临西县东留善固村采集金针菇的病株，如图1的11所示，选取 1g菌柄病健交界处的组织加入9mL 0.9％生理盐水中，25℃摇床震荡摇匀 30min，即为10^-1级组织培养液，从该10^-1级组织培养液中吸取1mL加入9mL 0.9％生理盐水中即为10^-2级组织培养液，依该法稀释制备10^-3、10^-4、10^-5、10^-6级组织培养液。吸取10^-4级、10^-5级、10^-6级组织培养液各100μL至NA固体培 养基，用玻璃涂布器涂布均匀。每级培养液接种3板，于25℃培养箱中培养2d 后观察，如图1的12所示，分离得到1株细菌JXN-3，在NA培养基上的该细 菌JXN-3单菌落为乳白色、圆形菌落。挑取数量最多的细菌单菌落进行分离纯 化和保存。

2、金针菇病原细菌的致病性测定

将纯化的细菌JXN-3菌株分别在NA固体培养基上25℃培养48h后，用无 菌水配置成1×10⁸cfu/mL细菌悬浮液，均匀喷雾接种于柄长8～10cm的金针菇 子实体上，以刚滴水为准，以无菌水为对照。接种后的金针菇置于25℃恒温温 室内，空气相对湿度90％以上，黑暗保湿48h，每天观察发病情况，如图2的 21所示，重新接种病原细菌JXN-3悬液的金针菇21发病症状与采集的发病金 针菇11相同，前期幼蕾表面出现褐色水渍状病斑，随后菌柄感染呈水渍状，松 软，变褐，最后成团腐烂，金针菇停止生长。取发病明显的子实体，再次从发病金针菇的病健交界处采用逐级稀释法对病原细菌JXN-3进行分离，得到的单 菌落如图2的22所示，再次分离得到的金针菇病原细菌单菌落22与首次分离 得到的金针菇病原细菌单菌落12形态一致，说明细菌单菌落22也是病原细菌 JXN-3，并说明病原细菌JXN-3即为引起白色金针菇腐烂病的致病菌。

3、金针菇病原细菌的形态学观察

(1)不同培养基上培养形态观察

将病原细菌JXN-3接种到PDA培养基、金氏A培养基、金氏B培养基上， 25℃培养48h后，观察菌落形态。如图3所示，JXN-3在金氏B培养基上菌落 为淡黄色，在其它培养基上初期为乳白色，后期为淡黄色。

(2)革兰氏染色

吸取20μL病原细菌JXN-3菌液涂于载玻片，火焰固定1-2次，结晶紫染 色1min，水洗；加碘液染色1min，水洗；加95％酒精，摇动载玻片，脱色20-60s， 水洗，吸去水分；加蕃红染色1min，水洗；空气中晾干，油镜观察，结果显示 病原细菌JXN-3的革兰氏染色为阳性。

(3)荧光色素观察

将病原细菌JXN-3菌液在金氏B培养基上划线接种，25℃条件下培养5d， 在波长300nm的紫外荧光灯下照射，观察荧光色素的产生情况，结果发现病原 细菌JXN-3并无色素产生。

(4)金针菇病原细菌的电镜观察

吸取800μL病原细菌JXN-3菌液离心，8000rpm离心3min，弃上清液，加 入500μL的0.1M PBS洗涤2次；在沉淀中加入2.5％戊二醛固定液1mL，充分 混匀，4℃静置4h；8000rpm离心3min，弃上清液，加入500μL PBS缓冲液洗 涤3次；乙醇梯度脱水：用30％、50％、70％、85％、95％质量浓度的乙醇各处 理一次，每次15min，用100％质量浓度的乙醇处理两次，每次20min，8000rpm 离心3min；叔丁醇置换两次：第一次加入400μL叔丁醇，静置20min；第二次 加入叔丁醇200μL，混匀后4℃放置20min，-80℃放置1h后，置于冷冻干燥机 内干燥12～24小时。将样品喷金处理60s后，使用扫描电子显微镜(Hitachi S-4800)对样品进行观察，结果如图4所示，该病原细菌JXN-3无鞭毛、无芽 胞产生，大小为(6μm-14μm)×(4.6μm-6μm)。

4、病原细菌JXN-3的分子鉴定

采用细菌基因组提取试剂盒EE161(北京全式金生物科技有限公司)对病 原细菌JXN-3进行基因组DNA的提取，以此DNA为模板，以27F(序列为 5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCA-3′)和1492R(序列为5′-GGTTACCTTGTTAC GACTT-3′)为引物，进行菌株16S rDNA的扩增。PCR扩增条件为：95℃5min； 94℃1min，50℃1min，72℃2min，35个循环；72℃10min。测得该菌株的 16S rRNA核苷酸序列长度为1361bp，通过与NCBI中的16S rRNA序列比对发 现，JXN-3与Mycetocola saprophilus的亲缘关系最近，相似性为100％。以 Roseicyclusmahoneyensis ML6为外围，结合NCBI中GenBank上 Microbacteriaceae中不同属的模式菌株16S rRNA序列，采用临近法构建系统发 育树，由图5可以看出，菌株JXN-3属于Mycetocola属，其中与M.saprophilus 和M.lacteus聚成一簇。

采用表1中的引物序列，对金针菇病原细菌中编码DNA解旋酶B亚基 (gyrB)、RNA聚合酶B亚基(rpoB)、重组酶A(recA)和磷酸激酶(ppk) 的管家基因进行PCR扩增，分别得到531bp、666bp、1084bp、1072bp的gyrB、 recA、ppk、ropB等管家基因的碱基序列：

以gyrB-2F和gyrB-4R为引物对gyrB进行PCR扩增，PCR扩增条件为： 94℃5min；94℃30s，63℃1min，72℃1min，35个循环；72℃10min；

以rpoB-2Fa和rpoB-5R为引物对rpoB基因进行PCR扩增，PCR扩增条件 为：94℃5min；94℃30s，58℃1min，72℃1.5min，35个循环；72℃10min；

以recA-6Fa和recA-7R为引物对recA进行PCR扩增，PCR扩增条件为： 94℃5min；94℃30s，64℃1min，72℃1min，35个循环；72℃10min；

以ppk-3F和ppk-R为引物对ppk基因进行PCR扩增，PCR扩增条件为： 94℃5min；94℃30s，62.5℃1min，72℃1.5min，35个循环；72℃10min。

采用PCR纯化试剂盒EP101(北京全式金生物科技有限公司)对扩增产物进行纯化，采用试剂盒CT301(北京全式金生物科技有限公司)将纯化后的PCR产物连接T3载体，挑取阳性克隆，接种于液体LB培养基中过夜培养，验证阳性克隆，对阳性克隆菌液进行测序，所得序列与NCBI(National Center for Biotechnology Information)数据库中已知序列进行比对，采用DAMBE软件进行碱基替代饱和度检验，结合NCBI中GenBank上Microbacteriaceae中不同属模式菌株的管家基因序列，采用临近法，通过MEGA6软件构建系统发育树。图5为基于16S rRNA序列构建菌株JXN-3的系统发育树，图6为基于gyrB基 因序列构建菌株JXN-3的系统发育树，图7为基于ppk基因序列构建菌株JXN-3的系统发育树，图8为基于recA基因序列构建菌株JXN-3的系统发育树，图9为基于ropB基因序列构建菌株JXN-3的系统发育树。由图6～图9可见，菌株JXN-3属于Mycetocola属，其中与M.saprophilus和M.lacteus亲缘关系最近，但是并未聚成一簇。

表1管家基因的引物序列

^aTm-DNA熔解温度。

^bgyrB引物的位置信息是以Microbacterium imperiale taxon 33884(AB074922)菌 株中gyrB的核酸序列为参考，rpoB，recA和ppk的位置信息是以菌株Leifsonia xylisubsp.xyli CTCB07为参考。

^c简并引物缩写:S，G/C；R，A/G；B，G/C/T；Y，C/T；N，A/T/C/G；V， A/G/C；H，A/T/C；M，A/C。

5、金针菇病原细菌JXN-3生物学特性测定

(1)生长最适pH测定

挑取金针菇病原细菌JXN-3单菌落接种于NA液体培养基中，25℃培养 48h后，取1％接种量分别接种于pH 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、 12.0、13.0的NA液体培养基中，在25℃、150r/min摇床中震荡培养48h，测 定上述各pH培养基在波长600nm的吸光值。结果如图10所示，金针菇病原细 菌JXN-3的生长最适pH为7-12，pH为4和13时几乎不生长。

(2)耐盐测定

吸取培养48h的金针菇病原细菌JXN-3菌液，取1％接种量接种于含有1％、 2％、3％、4％、5％NaCl的NA液体培养基中，在25℃、150r/min摇床中震荡 培养48h，测定上述各NaCl含量培养基在波长600nm的吸光值。结果如图11 所示，病原细菌JXN-3最适的NaCl添加量是0-3％，最高的NaCl承受浓度是 4％，NaCl添加量为5％时病原细菌JXN-3生长明显变慢。

6、金针菇抗性菌株的筛选

(1)金针菇孢子悬液的制备

将白色金针菇菌株SH9作为亲本，选择金针菇子实体接近成熟时菇形完 整、长势茂盛的菌盖，将表面用无菌水冲洗、阴干，在超净台上把菌盖放入灭 菌平皿中，收集孢子，将孢子放置于25℃恒温培养24h-48h。吸取1mL无菌水 配制孢子悬液，逐级稀释法将金针菇孢子稀释成1×10³个/mL。

(2)金针菇抗性菌株的筛选

挑取金针菇病原细菌JXN-3的单菌落于NA液体培养基中，在25℃、180 rpm/min摇床中培养2d，用无菌水将菌液稀释至1×10⁸个/mL。采用双层平板法 进行金针菇抗性品种的筛选，每皿吸取病原细菌JXN-3菌液1mL，倒入15mL PDA培养基，待培养基凝固后，再倒入15mL PDA培养基，待培养基凝固后， 吸取稀释后的金针菇孢子悬液100μL涂布于培养基表面，进行多孢杂交，得到 可在含有金针菇病原细菌JXN-3的PDA培养基上正常生长的金针菇菌株10株； 25℃恒温培养10d后挑取不同部位的单菌落，显微镜观察，挑选具有锁状联合的双核菌丝；待菌丝长满，30d后平板出菇；选择最先成功出菇的2株金针菇 菌株，在菌柄和菌盖的交接处进行组织分离，即为筛选后的金针菇抗病金针菇 JK502菌株。如图12所示，亲本SH9菌株121的菌丝疏松，有分生孢子，抗 病金针菇JK502菌株122的菌丝更浓密，生长旺盛。亲本SH9菌株在显微镜下 菌丝形态123较纤细，抗病金针菇JK502菌株在显微镜下菌丝形态124更粗壮， 且具有锁状联合。

(3)抗病金针菇菌株的复筛

挑取金针菇病原细菌JXN-3的单菌落于NA液体培养基中，在25℃、 180rpm/min摇床中培养2d，用无菌水将菌液稀释至1×10⁸个/mL，用0.22μm的 微孔滤膜进行过滤，获得金针菇病原细菌JXN-3的无菌滤液。采用含毒介质法 对筛选出的抗病金针菇JK502进行抗病性复筛，并与亲本SH9进行对比：使用 直径90mm的培养皿，每皿加入1mL金针菇病原细菌JXN-3的无菌滤液，用 定量蠕动泵定量加入30mL PDA培养基，以不加入无菌滤液的平板为对照；待 培养基凝固后，用5mm打孔器沿抗病金针菇JK502和亲本SH9菌落边缘打孔， 将抗病金针菇JK502菌块和亲本SH9菌块分别接种到PDA培养基平板中心， 25℃恒温培养箱培养7d，观察抗病金针菇JK502和亲本SH9菌丝生长情况， 测量抗病金针菇JK502和亲本SH9菌丝生长直径，计算金针菇病原细菌JXN-3 对抗病金针菇JK502和亲本SH9菌株的抑制率：抑制率＝(不加无菌滤液的菌 丝直径-加入无菌滤液的菌丝直径)/不加无菌滤液的菌丝直径×100％。

结果如图13所示，131为未加菌的亲本SH9，132为培养基中添加1mL无 菌滤液的亲本SH9，菌丝生长缓慢，133为未加菌的抗病金针菇JK502，134为 培养基中添加1mL无菌滤液的抗病金针菇JK502。测量生长7d菌丝直径，计 算病原细菌对亲本SH9的抑制率为79.14％，对抗病金针菇JK502的抑制率为 47.66％。结果表明，筛选到的抗病金针菇JK502菌株对金针菇病原细菌JXN-3 的抗病性明显增强，抗病性提高了31.48％。

7、抗病金针菇JK502子实体的栽培料配方及生长指标测定

(1)液体种制备

将抗病金针菇JK502、亲本SH9分别接种于PDA培养基中进行活化，长 满平板后，用直径5mm的打孔器在菌丝边缘进行打孔。挑取抗病金针菇JK502 和亲本SH9菌块接种于装有玻璃珠的PDA液体培养基中，在25℃、150r/min 摇床中培养7d。

(2)栽培料配方

以棉籽壳、麸皮、木屑、玉米芯、豆粉等为原料，设置栽培料的碳氮比为 25：1，配置不同比例的栽培料对金针菇进行出菇试验，配方如下：

配方一：棉籽皮88％，麸皮10％，石膏2％；

配方二：棉籽皮60％，麸皮18％，玉米芯20％，石膏2％；

配方三：棉籽皮20％，麸皮18％，玉米芯55％，豆饼粉5％，石膏2％；

配方四：棉籽皮35％，麸皮18％，木屑20％，玉米芯20％，豆饼粉5％， 石膏2％；

配方五：棉籽皮42％，麸皮18％，木屑33％，豆饼粉5％，石膏2％。

(3)金针菇出菇试验

用高18.0cm，直径10cm的出菇瓶装料，每瓶装栽培料300g，121℃高压 灭菌2h，待料温降至25℃以下，接入10mL液体种，各接30瓶。25℃培养室 内发菌，待菌丝长满瓶后，进行搔菌、然后放置于10℃-13℃、空气相对湿度 为90％的出菇室内进行出菇。抗病金针菇JK502出菇时间较亲本SH9可早3d。 采收后，测定不同处理的金针菇的原基数、菌柄直径、菌柄长度、菌盖直径、 菌盖厚度，鲜重、干重等指标。结果如表2、图14所示。

表2筛选出的抗病金针菇JK502与亲本SH9的生长指标测定

由图14所示，不同栽培料配方的抗病金针菇JK502长势均优于亲本SH9， 具体生长指标的测定如表2，结果表明，栽培料配方四中抗病金针菇JK502的 原基数、鲜重、干重、子实体高度等综合指标较其它配方优良，且菌盖直径和 菌柄直径适中，所以确定以棉籽皮35％、麸皮18％、木屑20％、玉米芯20％、 豆饼粉5％、石膏2％作为栽培料对抗病金针菇JK502子实体进行栽培。

8、金针菇菌株的ITS鉴定

PCR扩增ITS区段：采用真菌ITS序列通用引物ITS1(5’-TCCGTAGGTGAA CCTGCGG-3’)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)对样品进行扩增。 PCR反应体系：用25μL PCR反应体系：2.5μL 10×PCR Buffer、2μL dNTP、0.5μL 引物ITS1、0.5μL引物ITS4、0.5μL TaqDNA聚合酶、0.5μL DNA模板，用水 补至25μL。PCR扩增条件：94℃预变性2min，94℃变性40s，52℃复性1min， 72℃延伸1min，共35个循环，72℃保温5min，4℃保存，将PCR产物用1％ 的琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果如图15所示。采用PCR纯化试剂盒EP101 (北京全式金生物科技有限公司)对扩增产物进行纯化，采用试剂盒CT301(北 京全式金生物科技有限公司)将纯化后的PCR产物连接T3载体，挑取阳性克 隆，接种于液体LB培养基中过夜培养，验证阳性克隆，对阳性克隆菌液进行 测序，测序后获得大小为788bp的片段，所得序列与NCBI数据库中已知金针 菇ITS序列进行比对，选择Lentinula edodes L9作为外围，采用MEGA 6软件， 通过临近法构建系统发育树，结果如图16所示，筛选出的抗病金针菇JK502 与亲本SH9并未聚集在一类，为不同于亲本的新菌株。

保存菌种，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号 为CGMCC NO：14789。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发 明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明 的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 河北省科学院生物研究所

<120> 一种金针菇病原细菌的鉴定及抗病白色金针菇菌株的筛选方法

<130> 2017.12.11

<160> 7

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1361

<212> DNA

<213> JXN-3 16S rRNA

<400> 1

gcagtcgaac gatgaagctg gagcttgctc tggtggatta gtggcgaacg ggtgagtaac 60

acgtgagtaa cctgccctcc actctgggat aagcgctgga aacggcgtct aataccggat 120

atgaatctcc accgcatggt gggggttgga aagaatttcg gtgggggatg gactcgcggc 180

ctatcagctt gttggtgagg taatggctca ccaaggcgac gacgggtagc cggcctgaga 240

gggtgaccgg ccacactggg actgagacac ggcccagact cctacgggag gcagcagtgg 300

ggaatattgc acaatgggcg caagcctgat gcagcaacgc cgcgtgaggg atgacggcct 360

tcgggttgta aacctctttt agtagggaag aagcgaaagt gacggtacct gcagaaaaag 420

caccggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag ggtgcaagcg ttgtccggaa 480

ttattgggcg taaagagctc gtaggcggtt tgtcgcgtct gctgtgaaat cccgaggctc 540

aacctcgggc ctgcagtggg tacgggcaga ctagagtgcg gtaggggaga ttggaattcc 600

tggtgtagcg gtggaatgcg cagatatcag gaggaacacc gatggcgaag gcagatctct 660

gggccgtaac tgacgctgag gagcgaaagg gtggggagca aacaggctta gataccctgg 720

tagtccaccc cgtaaacgtt gggaactaga tgtagggtcc attccacgga ttctgtgtcg 780

cagctaacgc attaagttcc ccgcctgggg agtacggccg caaggctaaa actcaaagga 840

attgacgggg gcccgcacaa gcggcggagc atgcggatta attcgatgca acgcgaagaa 900

ccttaccaag gcttgacata taccggaaac gtccagagat ggtcgccccg taaggtcggt 960

atacaggtgg tgcatggttg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca 1020

acgagcgcaa ccctcgttct atgttgccag cacgtaatgg tgggaactca tgggatactg 1080

ccggggtcaa ctcggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc atcatgcccc ttatgtcttg 1140

ggcttcacgc atgctacaat ggccagtaca atgggctgcg ataccgcaag gtggagcgaa 1200

tcccaaaaag ctggtcccag ttcggattga ggtctgcaac tcgacctcat gaagtcggag 1260

tcgctagtaa tcgcagatca gcaacgctgc ggtgaatacg ttcccgggcc ttgtacacac 1320

cgcccgtcaa gtcatgaaag tcggtaacac ccgacgccgg t 1361

<210> 2

<211> 531

<212> DNA

<213> JXN-3 gyrB

<400> 2

tcgtcacgct tcagcagatg gcgttcctga caagggactg cgcatcgagc tgatcgacga 60

gcgtgtggac gagatcgagg agcccgccga gggcgaagag gcagccgttc ccaccaagaa 120

gcacaacgtg ttccactacg aacgcggcct ggtggactac gtggagcacc tcaaccgtgc 180

caagcgctcc gaactggtca acgacgagat catctcgttc gagcaggagg acaccgagcg 240

caagatcgcg ctggaaatcg cgatgcagtg gaccacctcg tactccgaga gcgtccacac 300

ctacgccaac accatcaaca cccatgaggg tggaacccac gaggagggct tccgcgccgc 360

gctgaccacc ctggtcaacc gctacgcccg cgagaagaac atcctcaagg acaaggacga 420

taacctctcc ggtgatgacg tgcgtgaggg cttgaccgcc gtcatctcga tcaagctggg 480

tgagccgcag ttcgagggcc agaccaaaac caagctggga aacaccgagg a 531

<210> 3

<211> 1084

<212> DNA

<213> JXN-3 PPK

<400> 3

gcgatctctg cgtcgcgctt tggtcgccga tccggctcga ggtcagcgcc gacatggacc 60

aggtcaccct gggtctgctg gtgcgcgagc tggatatcac cgatcaggag atctaccgcc 120

tgccggcgcc gctggacctc ggcggactgt ttagcctggc cggggccgac cgtccggacc 180

tgcactaccc caagcgcctg cccaccacgg ccgccgccct ggcaccctcg gattccaaca 240

gcaaggtcga cttcttcgag gtcatcgccc gcggcgacgt gctgctgcac cacccctatg 300

agtccttcgc gaccagcgtc caggccttcc tggagcaggc ggcctcggac ccacacgtac 360

tggccatcaa gcagaccctg tatcgcacct cgggcgactc ccccatcgtg gaggccctga 420

ttcgcgcggc cgaggccggc aagcaggtgc tcgcgctggt cgaggttaag gcgcgctttg 480

acgagcaggc caacatcacc tgggcacgca agctggaaaa ggccggcgtg cacgtggtct 540

acggcctggt ggggctgaaa acccactgca agcttgccca cgtgatccgt gaggaaaacg 600

gttcgctggt gtcctacagc cacatcggta ccggaaacta caaccccaag acctcgcgca 660

tctacgagga cttcgggctg ctgacagccg acccgcaggt cgggcgcgac ctcacccgtc 720

tgttcaacga gctctccggc tacgcgatcg agaagaagtt caagcgcctg ctggtggcac 780

cgctgcacct gcgtaagggg ctgctgaagc acatcgacac cgagcgtcgc aacgcgcttg 840

agggcaagcc cagcggcatc cggatcaagg tcaactcgat cgtggatgag gccatcatcg 900

atgcgctgta tcgggcgagc caggccggcg ttccggtcga ggtctgggtg cgcggcatct 960

gcgggctgat gcccggggtt cccggactca gcgagaacat ccgggtacgc tcgatcctcg 1020

gccgctatct ggagcactcg cggatcttct cgtttggaac gacggcgatc agcactctac 1080

atga 1084

<210> 4

<211> 666

<212> DNA

<213> JXN-3 recA

<400> 4

cataaacttc acacgctgac ctgcacgcat cgccacgccc agcgccaggg cggcatcgcc 60

gccttcatcg atgccgagca cgccctcgac cccgagtacg ccaagaagct gggtgtcgac 120

atcgacgcgc tgctggtttc tcagcccgac accggtgagc aggcgctgga aatcgccgac 180

atgctgatcc gctcgggctc gatcgacctg gtagtcatcg actccgtggc cgccctggtg 240

cctcgcgccg agatcgaggg tgagatggga gactcgcacg tgggtctgca ggcccgactg 300

atgtcgcagg cgctgcgcaa gatcaccggt ggcctcaacc agaccaagac caccgcgatt 360

ttcatcaacc agctgcgtga gaagatcggt gtgttcttcg gtagcccgga gaccacctcc 420

ggtggtaagg cgctgaagtt ctacgcctcg gttcgcctcg acatccgtcg catcgagacc 480

ctcaaggacg gttcggacgc cgtgggtaac cgtacccgcg tcaaggtggt caagaacaag 540

atggctccgc ccttcaagca ggccgagttc gacatcctct acggtgtggg tatttcccgc 600

gagggcagcc tgatcgactt cggtgtcgag cacggtctgg tcaagaaatc cggctcctgg 660

tacaca 666

<210> 5

<211> 1072

<212> DNA

<213> JXN-3 ropB

<400> 5

tttgctgggt cttcatcatc acggtaccga gcgtgtggtt gtgtcccagc tggttcgtag 60

ccccggtgtc tacttcgagc gcacccccga gaagaactcc gacaaggacc tctactcggc 120

acgcgtcatc ccgagccgtg gtgcatggct cgagttcgag attgacaagc gcgaccaggt 180

tggtgtgcgt atcgaccgta agcgtaagca gtcggtcacc gtcttcctca aggccctggg 240

tctgaccagc gaagacatcg ccagcgagtt cgccggctac gagtcgatcg ccctgaccct 300

ggagaaggac tcgatcgtct ccaaggacga cgccctgcgc gacatctacc gcaagctgcg 360

tccgggcgag caggtggccg ccgaggctgc ccgcgccctg ctggacaact tctacttcaa 420

ctccaagcgc tacgacctcg ccaaggtggg tcgctacaag atcaacaaga agcttggtct 480

tgaggcaccg ctgaccgact cggtgctgac cgtcgaagac atcgtctcga ccattaagta 540

cctggtgcgt ctgcacgccg gcgagaccca cttcaccggt gtccgtaagg gcgctccggc 600

ggagatccgc atcgacaccg acgacatcga caacttcggt aaccgtcgta tccgtgccgt 660

gggtgagctc atccagaacc aggtccgtac cggcctaagc cgtatggagc gcgtggttcg 720

cgagcgcatg accactcagg acatcgaggc gatcaccccg cagaccctga tcaacgtgcg 780

ccccgtcgtc gccgcgatca aggagttctt cggaacctcg cagctgtcgc agtttcatgg 840

accagaacca acccgctcgc gggtctgacc cacaagcgtc gtctgtcggc cctgggcccc 900

ggtggcctca gccgtgagcg cgcctgtgtc gaaggtgcga gacgttcacc ccgtcccact 960

acgccgtatg tgccccgatt gagacccctg aaggccccaa cattggtctg aatcgggttc 1020

gctggcatcg ttcgccacgc atcaacccca tcggcttcat cggagtatta tc 1072

<210> 6

<211> 760

<212> DNA

<213> SH9 ITS

<400> 6

aggatcatta atgaactttg aactgcttgt ggctcttggg ctgttgctga cggaggaccc 60

tcacgggttc ttcgtacgtg cacgtctggg gttgcagctt tcttcgtcca cctgtgcaca 120

ctctgtaggt ctggataccc cattggaagg gtgcgctttt tgcgctccct ttgccttcca 180

ggcctatgtc ttacaaacac tatagtatgt aacgaatgtc attgattatt ggacttcact 240

gtcctttaaa ctaaatacaa ctttcaacaa cggatctctt ggctctcgca tcgatgaaga 300

acgcagcgaa atgcgataac taatgtgaat tgcagaattc agtgaatcat cgagtctttg 360

aacgcacctt gcgccctttg gtactccgaa gggcatgcct gtttgagtgt cagtaacttc 420

tcaacctccc tcactttgtt gtgagctggc ggattggacg tgggggcttg ctggacctta 480

tctttgggtt cagctcccct gaaatgcatt agcagaaacc gttacctttt ggcgcgctgc 540

agctgtgata attatctacg gctatggctg ggctgactgt gttgtagcgc tcgtctcgtc 600

tctgaagtgg tttcgcctta gttggtgctt ccctttgcct tctctctcac gagagatacc 660

tgtggcgcga gtgcgcgggc tattccgctt ctaaccgtcc cccttgtggg acaactattg 720

accatttgac ctcaaatcag gtaggactac ccgctgaact 760

<210> 7

<211> 788

<212> DNA

<213> JK502 ITS

<400> 7

ggcatttgac tttgactgct tgtggctctt gggctgttgc tgacggagga ccctcacggg 60

ttcttcgtac gtgcacgtct ggggttgcag ctttcttcgt ccacctgtgc acactctgta 120

ggtctggata ccccattgga agggtgcgct ttttgcgctc cctttgcctt ccaggcctat 180

gtcttacaaa cactatagta tgtaacgaat gtcattgatt attggacttc actgtccttt 240

aaactaaata caactttcaa caacggatct cttggctctc gcatcgatga agaacgcagc 300

gaaatgcgat aactaatgtg aattgcagaa ttcagtgaat catcgagtct ttgaacgcac 360

cttgcgccct ttggtactcc gaagggcatg cctgtttgag tgtcagtaac ttctcaacct 420

ccctcacttt gttgtgagct ggcggattgg acgtgggggc ttgctggacc ttatctttgg 480

gttcagctcc cctgaaatgc attagcagaa accgttacct tttggcgcgc tgcagctgtg 540

ataattatct acggctatgg ctgggctgac tgtgttgtag cgctcgtctc gtctctgaag 600

tggtttcgcc ttagttggtg cttccctttg ccttctctct cacgagagat acctgtggcg 660

cgagtgcgcg ggctattccg cttttaaccg tcccccttgt gggacaacta ttgaccattt 720

gacctcaaat caggtaggac tacccgctga acttaagcat atcaataagc ggaggaaagg 780

gcgatccc 788

Claims (4)

1.一种抗病白色金针菇菌株，其分类名称为金针菇(Flammulina velutipes)，并已于2017年10月27日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC NO：14789。

2.一种抗病白色金针菇孢子，其特征在于，所述抗病白色金针菇孢子为通过培养权利要求1所述菌株得到的孢子。

3.一种抗病白色金针菇菌丝体，其特征在于，所述抗病白色金针菇菌丝体为通过培养权利要求1所述菌株得到的菌丝体。

4.一种抗病白色金针菇子实体，其特征在于，所述抗病白色金针菇子实体为通过培养权利要求1所述菌株得到的子实体。