CN108330073A

CN108330073A - 一种抗木霉菌白色金针菇菌株及其筛选方法和栽培料配方

Info

Publication number: CN108330073A
Application number: CN201810266898.5A
Authority: CN
Inventors: 李书生; 刘昆昂; 张根伟; 马宏; 尹淑丽; 刘振国; 刘萌; 付艳菊
Original assignee: Institute of Biology of Hebei Academy of Sciences
Current assignee: Institute of Biology of Hebei Academy of Sciences
Priority date: 2018-03-28
Filing date: 2018-03-28
Publication date: 2018-07-27

Abstract

本发明涉及一种抗木霉菌白色金针菇菌株，其分类名称为金针菇(Flammulina velutipes)，并已于2017年9月20日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC NO：14560。本发明还公开了一种抗木霉菌白色金针菇菌株的筛选方法以及抗木霉菌白色金针菇子实体的栽培料配方。

Description

一种抗木霉菌白色金针菇菌株及其筛选方法和栽培料配方

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及一种抗木霉菌白色金针菇菌株及其筛选方法和栽培料配方。

背景技术

金针菇(Flammulina velutipes)又名构菌、冬菇、毛柄金钱菌，富含蛋白质、多糖、氨基酸和膳食纤维等多种营养物质，且脂肪含量较低，具有抗氧化、抗肿瘤、抗病毒、护肝、排除重金属离子、降低胆固醇、预防高血压等多种功能，经常食用可明显提高人体免疫力。

金针菇品种按照子实体颜色分为黄色金针菇和白色金针菇。白色金针菇因菇体质地鲜嫩柔软、外观色泽佳、产量高等特点成为金针菇工厂化栽培主栽品种，但该品种抗病性较差，其中木霉菌是最主要的真菌病害之一，是夏季生产中常见且危害严重的杂菌。木霉菌广泛分布在自然界中，如土壤、肥料、植物残体上，且木霉菌生长快、活力强，凡适合于金针菇生长的环境条件都适合木霉发生发展。金针菇栽培料被木霉侵染后，2-3天可萌发成白色、纤细、绒毛状的菌丝在栽培料中迅速定植、蔓延和扩散，几天之后培养料变为淡绿色至深绿色，使菌丝发育受到严重影响，严重时菌丝不能生长，子实体被木霉菌丝包裹而变软，导致死亡，即使长出少量的子实体也会腐败而失去食用价值。

发明内容

针对金针菇受木霉菌污染后严重影响菌丝生长甚至造成子实体死亡的技术问题，本发明提供一种抗木霉菌白色金针菇菌株。

以及，本发明还提供一种抗木霉白色金针菇菌株的筛选方法。

以及，本发明还提供通过培养所述抗木霉白色金针菇菌株得到的孢子、菌丝体、子实体。

以及，本发明还提供一种上述抗木霉菌白色金针菇子实体的栽培料配方。

为达到上述发明目的，本发明实施例采用了如下的技术方案：

一种抗木霉白色金针菇菌株，其分类名称为金针菇(Flammulina velutipes)，并已于2017年9月20日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC NO：14560；保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

本发明所提供的抗木霉白色金针菇菌种能够抵抗木霉菌的污染，在木霉菌存在的情况下依然生长良好，避免了木霉菌使金针菇菌丝生长甚至子实体死亡的情况。

以及，上述抗木霉菌白色金针菇菌株的筛选方法，包括以下步骤：

步骤a、将白色金针菇菌株SH9作为亲本收集孢子，进行多孢杂交，挑选具有锁状联合的双核菌丝；进行平板出菇，得到出菇的金针菇；

步骤b、用对峙培养法对所述双核菌丝进行抗木霉活性测定，筛选出抗木霉白色金针菇菌株。

本发明通过对峙培养法能够获得对木霉菌具有抗病性的金针菇菌株。

以及，一种抗木霉菌白色金针菇孢子，该孢子为通过培养上述抗木霉菌白色金针菇菌株得到的孢子。

以及，一种抗木霉菌白色金针菇菌丝体，该菌丝体为通过培养上述抗木霉菌白色金针菇菌株得到的菌丝体。

以及，一种抗木霉菌白色金针菇子实体，该子实体为通过培养上述抗木霉将白色金针菇菌株得到的子实体。

以及，上述抗木霉菌白色金针菇菌株子实体的栽培料配方，所述栽培料包括下列重量百分比的以下成分：棉籽皮40～45％，麸皮15～20％，核桃木屑30～35％，豆饼粉3～7％，石膏1～3％。该栽培料中不含动物性成分，可减少栽培料的污染率和重金属含量，且该栽培料中石膏含量较低，不会增加栽培料pH，更适宜金针菇生长。该栽培料中不含糖份，麸皮中的碳水化合物是金针菇生命活动的能源和构成细胞的主要成分，与糖类材料相比，不易变质，可降低栽培时的污染率，并含有纤维素、维生素，能够为金针菇提供更丰富的营养；豆饼粉蛋白含量高，有机氮不需要转化，更容易吸收，豆饼粉和麸皮共同为金针菇生长提供了氮元素。核桃枝多被核桃种植方随意丢弃，既存在巨大的安全隐患，又是一种严重的资源浪费，本发明以核桃枝屑作为栽培料的成分之一，将核桃枝得以高效利用，并利用核桃枝中的营养成分来促进金针菇的生长，适用于抗木霉菌白色金针菇的工厂化栽培。本方案经过合理的配方比例，使配方中的碳、氮比例更适宜金针菇生长。

进一步地，所述栽培料包括下列重量百分比的以下成分：棉籽皮42％，麸皮18％，核桃木屑33％，豆饼粉5％，石膏2％。

进一步地，所述核桃木屑为含水量＜15％的干核桃枝粉碎成3～5mm所得。

附图说明

图1为金针菇JK501菌株与亲本SH9菌株的菌落形态及显微镜观察图；

图2为金针菇JK501菌株与亲本SH9菌株的平板对峙试验；

图3为金针菇JK501菌株与亲本SH9菌株的漆酶活性测定；

图4为金针菇JK501菌株与亲本SH9菌株的羧甲基纤维素酶活性测定；

图5为金针菇JK501菌株与亲本SH9菌株的半纤维素酶活性测定；

图6为金针菇JK501菌株与亲本SH9菌株的淀粉酶活性测定；

图7为金针菇JK501菌株与亲本SH9菌株的出菇试验；

图8为基于ITS序列构建的金针菇JK501菌株的系统发育树；

图9为金针菇JK501菌株与其他菌株的引物18和22扩增结果；

图10为金针菇JK501菌株与其他菌株的引物24和26扩增结果；

图11为金针菇JK501菌株与其他菌株的引物12和25扩增结果；

图12为金针菇JK501菌株与其他菌株的引物1和17扩增结果；

图13为金针菇JK501菌株与其他菌株的引物19和23扩增结果；

附图说明

11亲本SH9菌株的菌落形态

12金针菇JK501菌株的菌落形态

13亲本SH9菌株的显微镜观察图

14金针菇JK501菌株的显微镜观察图

21亲本SH9菌株的平板对峙试验菌落形态

22金针菇JK501菌株的平板对峙试验菌落形态

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例所用培养基：

PDA培养基(1L)：去皮马铃薯200g，切成小块煮沸半小时，然后纱布过滤，加入葡萄糖20g及琼脂15g，分装于500mL三角瓶中灭菌待用。

液体PDA培养基(1L)：去皮马铃薯200g，切成小块煮沸半小时，然后纱布过滤，加入葡萄糖20g，分装于500mL三角瓶中灭菌待用。

1、金针菇抗性菌株的筛选

(1)金针菇孢子悬液的制备

以收集白色金针菇SH9孢子，采用无菌水进行梯度稀释成1×10³个/mL，吸取孢子悬液100μL涂布在PDA培养基上，进行多孢杂交。25℃恒温培养10d后挑取不同部位的单菌落，显微镜观察，挑选具有锁状联合的双核菌丝，命名为JK501菌株。如图1所示，亲本SH9菌丝疏松，有分生孢子，筛选出的菌株JK501菌丝浓密，生长旺盛。测量菌落直径，计算菌株生长速度，其中JK501 菌株的生长速度为9.66mm/d，生长速度最快，亲本SH9的生长速度为8.385mm/d。显微镜观察菌丝形态，可以看出筛选出的菌株JK501菌丝更粗壮，整齐。

待菌丝长满，30d后平板出菇；选择成功出菇的金针菇，在菌柄和菌盖的交接处进行组织分离。

(2)金针菇抗性菌株的筛选

采用平板对峙法对组织分离后获得的金针菇进行抗木霉活性的测定。PDA培养基活化木霉菌株，25℃培养满皿后，用直径为0.5cm的打孔器打孔制备木霉菌菌饼。使用直径90mm的培养皿，每皿用定量蠕动泵定量加入30mL PDA培养基。将JK501菌株和亲本SH9菌株接种到距离中心2cm处，25℃培养3d后，对称地接入木霉菌饼，在25℃条件下培养3d，观察记录菌丝生长及拮抗情况，菌丝生长半径。结果如图2所示，亲本SH9菌株的半径为2.55mm，JK501菌株的半径为11.64mm。

以不加入木霉菌菌饼的平板为对照。待培养基凝固后，用5mm打孔器沿金针菇菌落边缘打孔，接种到PDA培养基平板中心，25℃恒温培养箱培养7d，观察菌丝生长情况，测量菌丝生长直径，计算木霉菌对金针菇菌株的抑制率，抑制率＝(不加无菌滤液的菌丝直径-加入无菌滤液的菌丝直径)/不加无菌滤液的菌丝直径×100％)。计算JK501的抗菌效果，结果显示金针菇JK501的抗性较亲本提高了3.56倍。

2、抗木霉菌金针菇JK501的酶活测定

漆酶活性：在2mL含有0.5mmol/L 2，2‐连氮‐双(3‐乙基苯并噻唑‐6‐磺酸)(ABTS)的0.1mol/L醋酸钠缓冲液(pH5.0)中，添加1mL稀释10倍的粗酶液启动反应，在25℃恒温培养箱中静置30min。采用Thermo Multiskan GO全波长酶标仪酶标仪测定波长420nm时反应体系的吸光值，以煮沸灭活15min的酶液作对照。酶的单位定义为每分钟吸光值增加0.1为1活力单位(U)。结果如图3所示，JK501菌株的漆酶活性显著高于亲本SH9。

羧甲基纤维素酶(CMC)活性：在试管中加入0.5％的羧甲基纤维素钠溶液(用pH4.6的0.1mol/L醋酸‐醋酸钠缓冲液配制)1.5mL，加稀释10倍的粗酶液0.5mL，50℃水浴保温30min，取出后立即加入DNS试剂1.5mL，煮沸5min。冷却后加入蒸馏水定容至25mL，混匀，用Thermo Multiskan GO全波长酶标仪酶标仪测定波长520nm处的吸光值，以煮沸灭活15min的酶液作对照。酶活力单位定义：每克干培养物30min内改变0.1个光密度值为1活力单位(U)。结果如图4所示，JK501菌株的羧甲基纤维素酶活性显著高于亲本SH9。

半纤维素酶(HC)活性：取1.0g/100mL燕麦木聚糖溶液(用pH4.6的0.1mol/L的乙酸盐缓冲液配制)1.5mL加入试管中，加稀释10倍的粗酶液0.5mL，50℃水浴30min，其后操作与纤维素酶活性测定相同。酶活力单位定义为每毫升粗酶液30min内改变0.1个光密度值为1活力单位(U)。结果如图5所示，JK501菌株的半纤维素酶活性显著高于亲本SH9。

淀粉酶活性：取0.5％的可溶性淀粉溶液(用pH5.8、0.1mol/L的乙酸盐缓冲液配制)1.5mL于试管中，加入稀释10倍的粗酶液0.5mL，混匀，于38℃水浴30min，取出后立即加入1.5mL DNS试剂，于100℃水浴中加热5min，冷却后加入2.5mL蒸馏水，混匀，测定波长520nm处测吸光值。对照管在加入DNS试剂后，再加入0.5mL酶液，其他操作与样品管相同。酶活力单位定义：每毫升粗酶液30min内改变0.1个光密度值为1活力单位(U)。结果如图6所示，JK501菌株的淀粉酶活性显著高于亲本SH9。

3、抗木霉菌金针菇JK501出菇试验及生长指标测定

(1)液体种制备

将金针菇接种于PDA培养基中进行活化，长满平板后，用直径5mm的打孔器在菌丝边缘进行打孔。挑取菌块接种于装有玻璃珠的液体PDA培养基中，25℃、150r/min摇床培养7d。

(2)栽培料配方

以杂木屑(不含核桃木屑)、核桃木屑、麸皮、棉籽皮、玉米芯、豆饼粉、石膏为原料，设置栽培料的碳氮比为25：1，配置不同比例的栽培料对金针菇进行出菇试验。其中核桃木屑为含水量＜15％的干核桃枝粉碎成3～5mm所得。配方如下：

配方一：棉籽皮88％，麸皮10％，石膏2％；

配方二：棉籽皮60％，麸皮18％，玉米芯20％，石膏2％；

配方三：棉籽皮20％，麸皮18％，玉米芯55％，豆饼粉5％，石膏2％；

配方四：棉籽皮35％，麸皮18％，木屑20％，玉米芯20％，豆饼粉5％，石膏2％；

配方五：棉籽皮42％，麸皮18％，木屑33％，豆饼粉5％，石膏2％；

配方六：棉籽皮42％，麸皮18％，核桃木屑33％，豆饼粉5％，石膏2％。

用高18.0cm，直径10cm的出菇瓶装料，每瓶装上述各配方栽培料300g，并按栽培料∶水＝1∶1.35的重量比加入纯化水，使其含水量达到60～65％。121℃高压灭菌2h，待料温降至25℃以下，接入10mL液体种，各接30瓶。25℃培养室内发菌，待菌丝长满瓶后，进行搔菌、然后放置于10℃-13℃，空气相对湿度为90％的出菇室内进行出菇，结果表明JK501菌株较亲本SH9菌株可早6d出菇，其中JK501菌株在配方六栽培料中出菇时间最早，亲本SH9菌株在配方四栽培料中出菇时间最早，搔菌后26d时JK501菌株在配方六栽培料中以及亲本SH9菌株在配方四栽培料中的出菇情况如图7所示，可见JK501菌株在配方六栽培料中具有更强的生长力。

各栽培料金针菇JK501子实体在搔菌后26d时采收，测度不同处理金针菇的原基数、鲜重、子实体高度、菌盖时间、菌柄直径等指标，结果如表1所示。

表1

由结果可见，添加核桃木屑的配方六栽培料配方中JK501的原基数、鲜重、子实体高度等综合指标较其它配方栽培料优良，且菌盖直径和菌柄直径适中，所以确定JK501菌株最优栽培料为配方六栽培料。

采用全自动氨基酸分析仪对自然风干后的配方六栽培料中子实体进行氨基酸含量的测定，结果如表2所示。

表2金针菇氨基酸含量测定

结果显示，JK501菌株每克干物质各项氨基酸含量均高于亲本SH9菌株。4、抗木霉菌金针菇JK501的ITS鉴定

PCR扩增ITS区段：采用真菌ITS序列通用引物ITS1(5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’)和ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)对样品进行扩增。PCR反应体系：用25μL PCR反应体系：2.5μL 10×PCR Buffer、2μL dNTP、0.5μL引物ITS1、0.5μL引物ITS4、0.5μL Taq DNA聚合酶、0.5μL DNA模板，用水补至25μL。PCR扩增条件：94℃预变性2min，94℃变性40s，52℃复性1min，72℃延伸1min，共35个循环，72℃保温5min，4℃保存，将PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测。采用PCR纯化试剂盒EP101(北京全式金生物科技有限公司)对扩增产物进行纯化，采用试剂盒CT301(北京全式金生物科技有限公司)将纯化后的PCR产物连接T3载体，挑取阳性克隆，接种于液体LB培养基中过夜培养，验证阳性克隆，对阳性克隆菌液进行测序，测序后获得大小为825bp的片段，JK501菌株的G+C含量为49.7％，亲本SH9菌株的G+C含量为50.18％。通过ClustalW程序对序列进行比对发现，与亲本SH9菌株相比JK501菌株在序列的84位出现G缺失，91位出现C-T的转换，490位出现C-T的转换，696位出现G-A的转换，734位出现C的缺失，746位出现A的插入。结合已有金针菇ITS序列，采用MEGA6进行遗传距离分析，金针菇ITS序列的遗传距离比较结果如表3所示，结果表明同属的种内ITS趋异度较小，其中F.velutipes SH9和F.velutipes JK501的ITS趋异度为0.003。选择Lentinulaedodes L9作为外围，采用MEGA6软件，通过临近法构建系统发育树，结果如图8所示，筛选出的抗病金针菇JK501与亲本SH9并未聚集在一类，为不同于亲本的新菌株。

5、抗木霉菌金针菇JK501的ISSR鉴定

按照国标NY1730-2009中的方法，筛选出10个金针菇的ISSR特异引物，选择黄色金针菇新苏6作为不同品种的对照，对金针菇进行鉴定，ISSR引物见表4。PCR反应体系为：2.5μL 10×PCR Buffer、2μL dNTP、引物各0.5μL、0.5μL Taq DNA聚合酶、0.5μL DNA模板，用水补至25μL。PCR扩增条件：94℃预变性2min，94℃变性30s，55℃复性30s，72℃延伸2min，共35个循环，72℃保温7min，4℃保存，将PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。

表4

检测结果如图9、10、11、12、13所示，10个引物共扩增出95个条带，每个引物扩增的条带数为4～16条，其中多态性条带31条，多态比率为31.5％。依据上述10个ISSR引物的多态性数据，从分子标记的层面可以证明JK501菌株是不同于亲本SH9菌株的新菌株。

保存JK501菌株，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC NO：14560。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 河北省科学院生物研究所

<120> 一种抗木霉菌白色金针菇菌株及其筛选方法和栽培料配方

<130> 2018.3.26

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 825

<212> DNA

<213> JK501 ITS序列

<400> 1

ggatcgccct ttccgtaggt gaacctgcgg aaggatcatt aatgaacttt gaactgcttg 60

tggctcttgg gctgttgctg acgaggacct tcacgggttc ttcgtacgtg cacgtctggg 120

gttgcagctt tcttcgtcca cctgtgcaca ctctgtaggt ctggataccc cattggaagg 180

gtgcgctttt tgcgctccct ttgccttcca ggcctatgtc ttacaaacac tatagtatgt 240

aacgaatgtc attgattatt ggacttcact gtcctttaaa ctaaatacaa ctttcaacaa 300

cggatctctt ggctctcgca tcgatgaaga acgcagcgaa atgcgataac taatgtgaat 360

tgcagaattc agtgaatcat cgagtctttg aacgcacctt gcgccctttg gtactccgaa 420

gggcatgcct gtttgagtgt cagtaacttc tcaacctccc tcactttgtt gtgagctggc 480

ggattggatg tgggggcttg ctggacctta tctttgggtt cagctcccct gaaatgcatt 540

agcagaaacc gttacctttt ggcgcgctgc agctgtgata attatctacg gctatggctg 600

ggctgactgt gttgtagcgc tcgtctcgtc tctgaagtgg tttcgcctta gttggtgctt 660

ccctttgcct tctctctcac gagagatacc tgtgacgcga gtgcgcgggc tattccgctt 720

ctaaccgtcc ccttgtggga caaactattg accatttgac ctcaaatcac gtaggactac 780

ccgctgaact taagcatatc aataagcgga ggaaagggcg atccc 825

<210> 2

<211> 825

<212> DNA

<213> SH9 ITS 序列

<400> 2

ggatcgccct ttccgtaggt gaacctgcgg aaggatcatt aatgaacttt gaactgcttg 60

tggctcttgg gctgttgctg acggaggacc ctcacgggtt cttcgtacgt gcacgtctgg 120

ggttgcagct ttcttcgtcc acctgtgcac actctgtagg tctggatacc ccattggaag 180

ggtgcgcttt ttgcgctccc tttgccttcc aggcctatgt cttacaaaca ctatagtatg 240

taacgaatgt cattgattat tggacttcac tgtcctttaa actaaataca actttcaaca 300

acggatctct tggctctcgc atcgatgaag aacgcagcga aatgcgataa ctaatgtgaa 360

ttgcagaatt cagtgaatca tcgagtcttt gaacgcacct tgcgcccttt ggtactccga 420

agggcatgcc tgtttgagtg tcagtaactt ctcaacctcc ctcactttgt tgtgagctgg 480

cggattggac gtgggggctt gctggacctt atctttgggt tcagctcccc tgaaatgcat 540

tagcagaaac cgttaccttt tggcgcgctg cagctgtgat aattatctac ggctatggct 600

gggctgactg tgttgtagcg ctcgtctcgt ctctgaagtg gtttcgcctt agttggtgct 660

tccctttgcc ttctctctca cgagagatac ctgtggcgcg agtgcgcggg ctattccgct 720

tctaaccgtc ccccttgtgg gacaactatt gaccatttga cctcaaatca cgtaggacta 780

cccgctgaac ttaagcatat caataagcgg aggaaagggc gatcc 825

Claims

1.一种抗木霉菌白色金针菇菌株，其分类名称为金针菇(Flammulina velutipes)，并已于2017年9月20日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC NO：14560。

2.一种权利要求1所述抗木霉菌白色金针菇菌株的筛选方法，其特征在于：包括以下步骤：

3.一种抗木霉菌白色金针菇孢子，其特征在于，所述抗木霉白色金针菇孢子为通过培养权利要求1所述菌株得到的孢子。

4.一种抗木霉菌白色金针菇菌丝体，其特征在于，所述抗木霉白色金针菇菌丝体为通过培养权利要求1所述菌株得到的菌丝体。

5.一种抗木霉菌白色金针菇子实体，其特征在于，所述抗木霉白色金针菇子实体为通过培养权利要求1所述菌株得到的子实体。

6.一种权利要求5所述抗木霉菌白色金针菇子实体的栽培料配方，其特征在于，所述栽培料包括下列重量百分比的以下成分：棉籽皮40～45％，麸皮15～20％，核桃木屑30～35％，豆饼粉3～7％，石膏1～3％。

7.一种权利要求6所述抗木霉菌白色金针菇子实体的栽培料配方，其特征在于，所述栽培料包括下列重量百分比的以下成分：棉籽皮42％，麸皮18％，核桃木屑33％，豆饼粉5％，石膏2％。

8.一种权利要求6或7任一项所述抗木霉菌白色金针菇子实体的栽培料配方，其特征在于，所述核桃木屑为含水量＜15％的干核桃枝粉碎成3～5mm所得。