CN104232748B - 一种杨梅苗木是否携带凋萎病菌的快速分子检测方法 - Google Patents

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    • C12Q1/6851—Quantitative amplification

Abstract

本发明涉及一种杨梅苗木是否携带凋萎病菌的快速分子检测方法，其特征在于，该方法包括：使用荧光定量PCR对杨梅组织的DNA进行扩增，如果在扩增18-22个循环时出现荧光，则表示杨梅组织中含有异色拟盘多毛孢或小孢拟盘多毛孢真菌，如果在扩增循环18-22个循环时不出现荧光，则表示杨梅组织中不含有异色拟盘多毛孢或小孢拟盘多毛孢真菌。利用该技术可以很好的区分携带凋萎病菌和健康的杨梅树，并快速准确。

Description

一种杨梅苗木是否携带凋萎病菌的快速分子检测方法
技术领域
本发明属于植物病原菌的分子诊断领域，特别的，属于如何采用RT-PCR并结合特异的引物检测杨梅树中是否携带凋萎病菌的方法。
背景技术
杨梅(MyricarubraSieb.EtZucc.)是我国南方特有的珍稀水果，果实甜酸适口，风味独特，在国内外享有盛誉，因其显著的经济与生态效益，已成为浙江省主要水果种类，其产值已稳居各类水果首位。杨梅凋萎病是近年来新发现的一种病害，发病初期，杨梅部分嫩梢干枯，随病情加重，嫩梢干枯数量逐渐增多并蔓延至全树，发病后3-5年整株死亡。杨梅凋萎病在浙江省杨梅主产区呈迅速蔓延趋势，严重影响杨梅产业的可持续发展。引起杨梅凋萎病的病原菌为异色拟盘多毛孢(Pestalotiopsisversicolor)和小孢拟盘多毛孢(P.microspora)。
在植物病害检测中，采用分子手段进行病原菌DNA的大量扩增来检测植物病害目前被大量使用，这种检测方法不仅快速，而且特异性比较高。比传统的分离方法检测要快速，而且准确。杨梅凋萎病病原菌为异色拟盘多毛孢和小孢拟盘多毛孢，凋萎病给杨梅树可以带来毁灭性的灾害。这就需要提供快速、准确的检测杨梅树是否携带凋萎病菌的方法。
发明内容
本发明实验小组惊讶的发现，采用常规的普通PCR技术不能对健康或携带凋萎病病菌(异色拟盘多毛孢或小孢拟盘多毛孢)的杨梅树进行准确的区分。我们进行了特异引物的设计，采用实时定量RT-PCR(RealtimeQuantitativePCR)技术对携带凋萎病菌的杨梅苗木进行检测，发现可以很好的区分感病和健康的杨梅苗木，即可以从那些表面看似健康的杨梅苗木中鉴别出携带病菌的杨梅苗木。
为了有效利用荧光定量PCR扩增技术，筛选特异性引物及最适的荧光定量PCR扩增条件是检测杨梅树是否患有凋萎病的重要先决条件。
本发明提供方法，该方法采用荧光定量RT-PCR扩增方法对杨梅树是否带有异色拟盘多毛孢或小孢拟盘多毛孢真菌进行分子鉴定的方法。该方法包括：使用荧光定量PCR对杨梅组织的DNA进行扩增，如果在扩增循环18-22个循环时出现荧光，则表示杨梅组织中含有异色拟盘多毛孢或小孢拟盘多毛孢真菌，如果在扩增循环18-22个循环时不出现荧光，则表示杨梅组织中不含有异色拟盘多毛孢或小孢拟盘多毛孢真菌。
在一个优选的方式中，采用荧光定量RT-PCR所使用的引物对下列引物对中的一对或多对：AATCCGCCGTTGTATTTCAG/CTGTTCGAGCGTCATTTCAA；AATCCGCCGTTGTATTTCAG/TGTTCGAGCGTCATTTCAAC；TTGAAATGACGCTCGAACAG/TCGAATCTTTGAACGCACAT。用该引物对可以检测杨梅组织是否携带有异色拟盘多毛孢真菌。
在一个优选的方式中，采用荧光定量RT-PCR所使用的引物对下列引物对中的一对或多对：AAAGCAGTAGGCTCCCAACA/CTGTTCGAGCGTCATTTCAA；AAAGCAGTAGGCTCCCAACA/CTGTTCGAGCGTCATTTCAA；AAAGCAGTAGGCTCCCAACA/CTGTTCGAGCGTCATTTCAA。用该引物对可以检测杨梅组织是否携带有小孢拟盘多毛孢真菌。
在一个优选的方式中，该方法的杨梅组织包括根、茎或叶片。
在一个优选的方式中，使用的最终DNA浓度为100pg/μl。
在一个优选的方式中，采用的荧光定量RT-PCR的扩增的体系为：PremixEx(2×)10μl，2条RT-PCRPrimer(10μM)各0.6μl，ROXReferenceDyeII(50×)4μl，Template(50～100ng)2μl，dH2O6.4μl。
在一个优选的方式中，采用的荧光定量RT-PCR的扩增的程序为：95℃30秒；95℃5秒,55℃30秒,72℃34秒，40个循环。
对于保藏真菌的生物学特性说明
菌株PMYS1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号码为CGMCCNo.8713，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，拉丁学名：Pestalotiopsismicrospora，中文名称为：小孢拟盘多毛孢，保藏日期为：2014年01月10日。
菌株PVXJ1保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号码为CGMCCNo.8714，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，拉丁学名：Pestalotiopsisversicolor，中文名称为：异色拟盘多毛孢，保藏日期为：2014年01月10日。
有益效果
本发明采用特殊的引物以及RT-PCR技术可以有效的从健康杨梅树中鉴定出感病的杨梅树，可以快速有效的获得鉴定结果，为杨梅树凋萎病提供了新的分子鉴定技术。
附图说明
图1采用引物CPV1L/CPV1R鉴定异色拟盘多毛孢菌株，引物CPM1L/CPM1R鉴定小孢拟盘多毛孢菌株的普通PCR扩增的电泳图。
图2对采用图1中的引物扩增对照菌普通PCR扩增的电泳图。
图3PCR检测健康和接种凋萎病菌杨梅根的样品(对于相同的叶片和茎的样品获得同样的结果，图省略)。
图4使用引物Pv1L/Pv1R的荧光定量PCR溶解曲线(异色拟盘多毛孢菌株)。
图5使用引物Pv2L/Pv2R荧光定量PCR溶解曲线(异色拟盘多毛孢菌株)。
图6使用引物Pv3L/Pv3R荧光定量PCR溶解曲线(异色拟盘多毛孢菌株)。
图7使用引物Pm1L/Pm1R荧光定量PCR溶解曲线(小孢拟盘多毛孢菌株)
图8使用引物Pm2L/Pm2R荧光定量PCR溶解曲线(小孢拟盘多毛孢菌株)
图9使用引物Pm3L/Pm3R荧光定量PCR溶解曲线(小孢拟盘多毛孢菌株和异色拟盘多毛孢菌株)
具体实施方式
一、采用普通PCR技术对带菌植株和对照植物以及病菌的培养基培养进行比较试验
实施例子1：PCR引物和探针设计
根据本发明小组分离的杨梅凋萎病菌的致病力菌株XJ27(经过鉴定属于异色拟盘多毛孢)和YS26(经过鉴定属于小孢拟盘多毛孢)的共有区域ITS(转录间隔区)的序列(JN861773；JN861776)(RenHY,LiGang,QiXJ,FangLi,WangHR,WeiJG,ZhongS.IdentificationandcharacterizationofPestalotiopsisspp.causingtwigblightdiseaseofbayberry(MyricarubraSieb.&Zucc)inChina.EuropeanJournalofPlantPathology,2013,173(3):451-461.)。使用Primer3software设计荧光定量PCR和传统PCR的引物。引物用途及序列见表1。
表1引物序列特性
实施例子2:菌株的准备和培养
本实验室通过分生孢子形态鉴定的30个异色拟盘多毛孢菌株和30个小孢拟盘多毛孢菌株，杨梅树上分离的褐斑病菌、枝腐病菌和叶枯病菌、其他蔬菜及水稻上分离的镰刀菌、灰葡萄孢、胶孢炭疽菌等11个菌株作为对照菌株，拟盘多毛孢和对照菌用来鉴定引物特异性。所有的菌株使用PDA培养基(马铃薯淀粉5.0g，葡萄糖20.0g，琼脂20.0g，加水定容至1L，灭菌)25℃平板培养1周后，用来进行菌株的DNA的提取。试管斜面保存至4℃冰箱。收集到的菌株见在表2和表3内，均保存于本实验室。
表2本实验用到的拟盘多毛孢菌株
表3本实验用到的对照菌株
编号 菌株名称 编号 菌株名称
D1 褐斑病菌 D9 镰刀菌686
D4 枝腐病菌 D10 镰刀菌766
D5 FaJYS13 D14 叶枯病菌
D6 PH-1Fg D17 灰葡萄孢
D7 镰刀菌789 D19 胶孢炭疽菌
D8 镰刀菌390
实施例子3：从大田杨梅植株上分离到的XJ27和YS26强致病力菌株用来做温室容器苗接种 实验。
杨梅凋萎病菌接种的方法按照以下方法进行：选择XJ27和YS26菌株，接种1年生健康杨梅幼苗的茎干基部，土壤以上5cm处用解剖刀片切开一个1.5～2.0cm的小口。用培养了7天的XJ27或YS26菌株的PDA菌块(1～2mm2)接种到伤口处，脱脂棉吸灭菌水保湿，保鲜膜缠绕保湿3天，23-25℃下培养。每个实验取3棵苗子作为重复，不接种的苗子作为对照。分别在接种后0、7、14、21、28天取样，取样位置距离接种点位置：10、20、30cm直至顶部位置。每部分样品平均分成2份，一份用来组织分离真菌菌株，分离的真菌菌株的鉴定采用常规方法鉴定具体为何种真菌，另一份用来分子检测，获得的实验样品见表3。
表4杨梅不接种和接种拟盘多毛孢后的样品
实施例子4：从实施例子3中杨梅树上分离凋萎病菌的方法
本实验的目的是分析杨梅苗木接种病菌后回分离病菌，确定引起杨梅苗木发病的原因确实是接种病原菌引起的。病菌的分离可以通过组织分离方法来实现。将实施例子3中杨梅树的根、茎或叶冲洗干净，吸去表面残留水渍，并将茎表皮去除，75％酒精灭菌30s，用剪刀将根、茎剪成小段，厚约2mm，将叶片剪成小片，约0.5cm×1.0cm。将处理好的材料放到PDA培养基表面，每个平皿放置三个组织小块25℃黑暗培养3天，观察真菌分离情况，通常情况下真菌和一些杂菌掺杂生长，为此下面进行第一次纯化；用接种针挑选长势较好的真菌菌丝，将其接种到新的PDA培养基上，并做好标记，继续25℃黑暗3天，一般情况可以观察到较为纯净无杂菌的白色真菌菌落，再进行一次边缘菌丝纯化，产孢后通过常规方法鉴定结果为确定为拟盘多毛孢菌株，分别是异色拟盘多毛孢和小孢拟盘多毛孢，而且在接种的杨梅的根、茎或叶片中都分离出接种菌。而不接种的对照杨梅树的根、茎或叶片却没有分离出异色拟盘多毛孢和小孢拟盘多毛孢，而是其他一些镰刀菌或者未知菌株。
实施例子5：CTAB法提取真菌和植物基因组中DNA
实施例子2中表2和表3中的真菌都采用常规的PDA培养，并从赛璐玢膜的PDA培养基上用刀片轻轻刮下菌丝，或者取适量实施例子3中杨梅树的根、茎、叶片(1.5～2.5g)，将样品置于研钵中，倒入液氮，充分研磨至粉末状，然后按照下述方法进行DNA的提取。
按照0.1g样品加入600μl2％CTAB的比例加入65℃预热的2％CTAB；充分混匀，置65℃水浴1h，每隔5-10min混匀一次，取出后，放至室温。加入等体积的酚/氯仿/异戊醇25:24:1，充分颠倒混合，室温下12000rpm离心10min。将上清转移到2.0ml离心管中，加入等体积氯仿/异戊醇24:1，充分颠倒混合；室温下12000rpm离心10min；重复该步骤。将上清转移到1.5ml离心管中，向上清中加入两倍体积无水乙醇，充分颠倒混匀，使DNA从溶液中析出，形成絮状沉淀；4℃12000rpm离心20min，弃上清，加入500μl70％乙醇，颠倒混匀，至沉淀悬起；4℃12000rpm离心5min，再用500μl70％乙醇洗涤一次；4℃12000rpm离心5min，弃酒精，将剩余的液体尽量吸净并干燥；37℃温育10min后用ddH2O溶解DNA。取1μl进行Nanodrop2000检测浓度和纯度，另取3-5μl于1％的琼脂糖凝胶电泳检测分离的DNA的纯度是否符合要求。
实施例子6：普通PCR检测
从实施例子5获得的DNA样品3μl(50-100ng)，10×PCRbuffer5μl，1.5mMMgCl2，10mMdNTPs，15μM引物(表1中的每个引物分别为7.5μM)，0.75UTaqDNA聚合酶(TaKaRa,Dalian,China)，ddH2O定容至50μl。95℃预变性5min，95℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，30个循环；72℃10min。1％琼脂糖凝胶检测扩增条带。
普通PCR检测结果
用PDA培养基直接培养的异色拟盘多毛孢菌的DNA做模板，CPV1L/CPV1R引物能扩增出250-500bp之间的一条理想条带(图1)。用培养基直接培养的小孢拟盘多毛孢菌的DNA做模板，CPM1L/CPM1R也能扩增出250-500bp之间的一条理想条带(图1)。
但是对照菌的DNA(非异色拟盘多毛孢菌或小孢拟盘多毛孢菌-表3中的真菌)或者温室内杨梅植株组织(叶片、根或茎)提取的DNA则都不能扩增出理想大小的条带，相反扩增的条带在100-250bp之间(图2和图3)，与预期的目的片段大小不同。这说明异色拟盘多毛孢和小孢拟盘多毛孢的特异引物CPV1L/CPV1R和CPM1L/CPM1R不能通过普通PCR技术来检测带菌的杨梅植株。虽然可以检测经过PDA培养的病菌的DNA，但是对于接种的病菌的植物组织却不能进行很好的区分，不能直接用来从杨梅树上区分接种了目的病菌和非目的病菌的植株。因为接种病菌的杨梅组织通过常规方法进行菌株分离，能分离出较多数量的病菌，但是通过常规PCR是不能进行健康(对照)和非健康(温室接种)杨梅植物的区分(图2和图3)。
实施例子7：荧光定量PCR扩增
将上述实施例子5提取的基因组DNA模板【(采用培养基直接培养的菌)或植物组织(接种或对照没有接种目的真菌的杨梅树的组织)】浓度稀释到最终DNA浓度为100pg/μl，按照TaKaRaSYBRPremixDimerEraser(PerfectRealTime)的荧光定量试剂盒(TaKaRa，RR091Q)选择20μl的体系说明进行操作，具体为：PremixEx酶(2×)10μl，2条RT-PCRPrimer(10μM)(表1)各0.6μl，ROXReferenceDyeII(染料)(50×)4μl，Template(50～100ng)2μl，dH2O(灭菌蒸馏水)6.4μl。RealtimePCR程序95℃30秒；95℃5秒,55℃30秒,72℃34秒，40个循环。实时荧光定量PCR的每个样品重复三次。
荧光定量PCR结果
7.1异色拟盘多毛孢特异引物筛选结果
使用引物Pv1L/Pv1R对XJ27菌株的PDA的培养物通过实施例子5得到的DNA进行荧光定量PCR，得到荧光定量PCR溶解曲线见图4，显示使用引物Pv1L/Pv1R现单峰，基本没有杂峰的存在，说明此对引物特异性较好。同时，采用引物Pv1L/Pv1R对其他的30个异色拟盘多毛孢菌株同样进行了荧光定量PCR，荧光定量PCR溶解曲线与图4相同，也没有杂峰的出现(具体实验数据略)。
同样，采用引物Pv2L/Pv2R和Pv3L/Pv3R对XJ27菌株的DNA进行荧光定量PCR，溶解曲线分别见图5和图6，均出现较多杂峰，说明此两对引物特异性不高。同时，采用引物Pv2L/Pv2R和Pv3L/Pv3R对其他的异色拟盘多毛孢菌株同样进行了荧光定量PCR，荧光定量PCR溶解曲线见图5或6相同，均出现较多杂峰，说明此引物特异性也不是很高。
7.2小孢拟盘多毛孢的引物筛选结果
引物Pm1L/Pm1R、Pm2L/Pm2R和Pm3L/Pm3R扩增得到荧光定量PCR溶解曲线分别见图7、8和9，都有杂峰出现。但是都有锐利的峰出现，这就说明可以用来检测特异真菌的有无。同时，采用引物Pm1L/Pm1R、Pm2L/Pm2R和Pm3L/Pm3R对其他的小孢拟盘多毛孢菌株同样进行了荧光定量PCR，都有类似杂峰出现(数据略)。虽然说明此两对引物特异性不高，但是都有锐利的峰出现，这就说明这些引物也是可以用来检测特异真菌的有无。
7.3荧光定量的敏感性检测结果
杨梅接种小孢拟盘多毛孢和异色拟盘多毛孢病菌后的植物组织的DNA样品(实施例子5中获得的DNA)在DNA浓度是200pg/μl时，使用Pv1L/Pv1R和Pm1L和Pm1R进行荧光定量PCR只需要21个左右的循环就可以检测出有效荧光。而不接种的杨梅树的DNA对照和没有DNA模板的对照在21-22个左右的循环没有荧光出现。相反，对照样品需要至少35-40个循环后才能检测到荧光。采用同样的方法，对其他本发明涉及的引物进行检测，具体结果见表。
表4不同引物对于接种目的真菌的杨梅组织的DNA和对照样品的RT-PCR检测结果比较。
这说明Pv1L/Pv1R和Pm1L和Pm1R两对引物可以用来检测携带有异色拟盘多毛孢和小孢拟盘多毛孢的杨梅苗木，可以对于携带有一定量的异色拟盘多毛孢和小孢拟盘多毛孢的杨梅苗木进行检测，能够区分携带有异色拟盘多毛孢和小孢拟盘多毛孢杨梅树与不携带这两种任何病菌的杨梅树。
SEQUENCELISTING
<110>浙江省农业科学院
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Claims (3)

1.一种杨梅苗木是否携带凋萎病菌的快速分子检测方法，其特征在于，该方法包括：使用荧光定量PCR对杨梅组织的DNA进行扩增，如果在扩增18-22个循环时出现荧光，则表示杨梅组织中含有异色拟盘多毛孢真菌，如果在扩增循环18-22个循环时不出现荧光，则表示杨梅组织中不含有异色拟盘多毛孢真菌；其中，采用荧光定量PCR对杨梅组织的DNA进行扩增所使用的引物为：AATCCGCCGTTGTATTTCAG和CTGTTCGAGCGTCATTTCAA。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的杨梅组织包括根、茎或叶片。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，采用的荧光定量PCR的扩增的程序为：95℃30秒；95℃5秒,55℃30秒,72℃34秒，40个循环。
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