CN104195050B - 一株渐狭蜡蚧菌及其在防治作物线虫和粉虱中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种渐狭蜡蚧菌及其在防治大豆胞囊线虫上的应用。该渐狭蜡蚧菌菌株为渐狭蜡蚧菌(Lecanicillium attenuatum)HNLA1306,其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),保藏号为CGMCC No.9220。该渐狭蜡蚧菌菌株发酵液对大豆孢囊卵孵化抑制明显,对J2幼虫具有强致死作用,其分生孢子对烟粉虱二龄幼虫寄生效果好,可用于农作物线虫和烟粉虱的生物防治。
Description
技术领域
本发明属微生物农药技术领域,具体涉及一株用于防治作物线虫和粉虱的渐狭蜡蚧菌。
背景技术
大豆孢囊线虫病(Heterodera glycines Ichinohe)是制约大豆生产的重要病害之一,被称为大豆的“癌症”,其所造成的损失比任何一种单一病害所造成的损失都大(Wrather J A,Anderson T R,Arsyad D M,Tan Y,Ploper L D,Porta-Puglia A,Ram H H,Yorinori J T.Soybean disease loss estimates for the top ten soybean-producing countries in1998.Canadian Journal of Plant Pathology,2001,23(2):115-121.)由于迄今为止没有发现对其具有明显抗病性的种质资源,大豆孢囊线虫病仍然是农业生产中的世界性难题。大豆孢囊线虫的防治主要依靠化学农药,如二溴氯丙烷、二溴乙烷、呋喃丹等,这些防治线虫的化学农药多是高毒农药,长期大量使用造成了严重的农产品农药残留超标和整个生态环境的污染。随着生活水平的不断提高,人们对食品安全和环境污染问题越来越关注,大豆胞囊线虫生物防治的理念渐渐被接受。大豆胞囊线虫病的生物天敌包括捕食线虫的真菌、寄生性真菌和细菌等。其中,淡紫拟青霉的研究最多,且已形成专利。烟粉虱(Bemisia tabaci)广泛分布于除南极洲外各大洲90多个国家和地区,已成为全球性的严重问题。烟粉虱的治理主要依赖化学药剂,然而抗药性发展迅速,其对常用的大多数化学农药已产生高水平的抗性和交互抗性(Palumbo J C,Horowitz A R,Prabhaker N.Insecticidal control and resistance management for Bemisia tabaci.Crop Protection,2001,20:739-765.)。鉴于此,寻求有效的防治烟粉虱的生物防治方法是未来研究与发展的主要方向。蜡蚧菌是重要的虫生真菌,对害虫、病原真菌和线虫都具有好的寄生效果(Goettel M S,Koike M,Kim J J,Aiuchi D,Shinya R,Brodeur J.Potential of Lecanicillium spp.for management of insects,nematodes and plant diseases.Journal of Invertebrate Pathology,2008,98:256-261.),该菌在西欧、苏、美、中等许多国家和地区已有广泛研究和应用。蜡蚧菌最早由Nivter于1861年在斯里兰卡首次发现;Zimmermann于1898年最先将其定名为蜡蚧头孢菌(Cephalosporium lecanii);Viegas于1939年将其并入轮枝菌属,并命名为蜡蚧轮枝菌(Verticillium lecanii);Gams和Zare于2001年将蜡蚧菌从轮枝菌属中析出,建立蜡蚧菌属(Lecanillium),现有约15个种(Zare R,Gams W.A revision of Verticillium section Prostrata.IV.The genera Lecanicillium andSimplicillium gen.nov.Nova Hedwigia,2001,73:1-50.)。渐狭蜡蚧茵(L.attenuatum)是Lecanillium属中可寄生线虫和粉虱的一种蜡蚧菌,其可有效寄生植物线虫的卵和雌虫,以及粉虱的卵和若虫。本发明针对这一农业生产的重要需求而研发,发现一种毒杀大豆孢囊线虫并可寄生粉虱的生防真菌,研究了该菌株的生物学特性和应用技术。
发明内容
本发明的目的在于提供一种渐狭蜡蚧菌,该菌株对大豆孢囊线虫具有优良生防效果。
为了实现以上目的,本发明采用如下技术方案:一种渐狭蜡蚧菌菌株,分类命名Lecanicillium attenuatum,于2014年5月8日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC,单位地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究,所保藏编号:CGMCC No.9220。
本发明的基本技术方案为:将分离自中国海南文昌椰林土壤的蜡蚧菌,置培养皿上培养,待长出菌丝后,经菌落形状形态学观察及分子生物学鉴定、ITS序列比对、系统发育分析,确定该菌为渐狭蜡蚧菌。大量的生物学实验表明,本发明的渐狭蜡蚧菌菌株对大豆孢囊线虫控制效果超过85%,对烟粉虱若虫的寄生率超过95%。具体包括下列步骤:
1、渐峡蜡蚧菌的分离:将采自海南文昌椰子林土壤的蜡蚧菌置于备好的培养基上,然后将培养皿置于27℃的恒温培养箱内培养,定期观察,将长出的菌丝挑至PDA培养基上,菌丝长满后4℃保存以待鉴定;
2、渐狭蜡蚧菌的菌落性状和形态学鉴定:将菌株接种于PDA培养基平板上,27℃培养,连续观测菌株培养性状和产孢结构,直至菌落长满2/3平板,参照《昆虫真菌学》的检索表进行菌株的形态鉴定(蒲蛰龙,李增智.昆虫真菌学.合肥:安徽科学技术出版社,1996.);
3、渐狭蜡蚧菌的分子生物学鉴定、ITS序列比对及系统发育分析:采用CTAB法提取菌株总DNA,选用通用引物ITS1-F/ITS4-R,对ITS序列进行PCR扩增和测序,将测得的ITS-rDNA序列在NCBI数据库中进行BLAST比对,下载相关的ITS序列,生成系统发育进化树;
4、渐狭蜡蚧菌对碳氮源和温度的需求特性:
碳/氮源试验:用接种针蘸取适量菌株的孢子悬浮液,接种到碳/氮源培养基上(分别以蔗糖或硝酸钠作对照),将平板置于25℃的恒温条件下培养,采用十字交叉法测量菌落生长直径;将整个菌落移入含玻璃珠的吐温水中,涡旋震荡获得分生孢子悬浮液,血球计数板测定菌株在不同碳/氮源培养基上的分生孢子产量。温度试验:用接种针蘸取适量孢子悬浮液,接种到PDA平板上,分别置19℃、23℃、27℃和29℃恒温培养,菌丝生长和产孢测定方法如上。
5、渐狭蜡蚧菌对大豆孢囊线虫卵孵化的抑制和幼虫的毒杀作用:将渐狭蜡蚧茵的发酵滤液原液和大豆孢囊线虫卵或J2幼虫悬浮液加入到24孔板中,以无菌水为对照,重复3次,27℃培养,统计发酵滤液对卵孵化的抑制率和对幼虫的毒杀率。
6、渐狭蜡蚧菌对烟粉虱幼虫的寄生效果:用小型喷雾器将孢子悬液喷在带有烟粉虱的黄瓜叶片上,对照为无菌水,每处理为3片叶,3次重复,光照培养箱保湿培养,镜检并记录被 真菌感染死亡的虫数,计算侵染率。
本发明的有益效果和优点是:本发明的渐狭蜡蚧菌菌株在多种碳氮源上均可正常生长和产孢;菌株发酵滤液可有效抑制大豆孢囊线虫卵的孵化,对幼虫也具有很高的毒杀效果;菌株分生孢子对烟粉虱二龄幼虫寄生效果好;本发明的渐狭蜡蚧菌菌株在作物线虫和粉虱的生物防治上具有很大的应用潜力。
附图说明
图1:是本发明的渐狭蜡蚧菌菌株的孢子梗及孢子的形态;
图2:是基于rDNA-ITS序的菌株类群系统发育树及相关类群系统发育树;
图3:是渐狭蜡蚧菌HNLA1306菌株发酵滤液对大豆孢囊线虫卵孵化的影响;
图4:是渐狭蜡蚧菌HNLA1306菌株发酵滤液对大豆孢囊线虫二龄幼虫的影响;
图5:是渐狭蜡蚧菌HNLA1306菌株对烟粉虱二龄幼虫的寄生效果。
具体实施方式
实施例1:本发明的渐狭蜡蚧菌菌株的分离
将采自古巴的感染蜡蚧菌的蚜虫,经3%NaClO表面消毒后,将僵虫置于备好的培养基上,培养基配方为PDA培养基,即马铃薯200g(去皮,切块煮沸30min,纱布过滤),葡萄糖20g,琼脂20g,加蒸馏水定容1000mL,121℃高温灭菌30min。每个培养皿放置僵虫3头,然后将培养皿置于27℃的恒温培养箱内培养,定期观察,将长出的菌丝挑至PDA培养基上,菌丝长满后4℃保存以待鉴定。
实施例2:本发明的渐狭蜡蚧菌菌株的菌落性状培养和形态学鉴定
将菌株接种于PDA培养基平板上,27℃培养,连续观测菌株菌落形态、颜色和菌落生长情况,直至菌落长满2/3平板。该菌株在PDA培养基上10d后菌落白色,薄絮状,背面无色。采用玻片培养法,PDA培养基制成2cm×2cm的小薄片,将已活化的该菌菌丝挑于培养基上,置于27℃恒温培养箱保湿培养,在Olympus CX21BIM-SET6显微镜系统连续观察该菌的分生孢子、瓶梗等的形成情况,测量并照相。该菌株分生孢子梗不发达,似营养菌丝,其上有单生、对生或3-4个轮生的瓶梗(见图1,A),瓶梗纤细大小在8.5-40×0.8-2.2μan之间。分生孢子为圆柱形,两端圆,单生,在瓶梗顶部聚成头状,大小2.3-10×1.0-2.6μm(见图1,B)。
实施例3:本发明的渐狭蜡蚧菌菌株的分子生物学鉴定、ITS序列比对及系统发育分析采用CTAB法提取菌株总DNA(Kim D H,Martyn R D,Magill C W.Restriction fragment length polymorphism groups and physical map of mitochondrial DNA from Fusarium oxysporum f.sp.niveum.Molecular Plant Pathology,1992,82:346-353.)。选用通用引物ITSl-F和ITS4-R(White T J,Bruns T,Lee S.Taylor JW.Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA
genes for phylogenetics.In:Innis M.eds.A PCR protocols:a guide to methods and applications.New York,USA:Academic Press,1990,315-322.),对ITS序列进行PCR扩增和测序。PCR反应体系(20μL):模板DNA1μL、PCR Master Mix(Thermo Fisher Scientific)、引物各1μL,补充去离子水至20μL。反应条件:94℃4min;94℃1min,55℃30s,72℃90s,35个循环;72℃10min。PCR产物经1%凝胶电泳检测后送交上海生工生物工程技术服务有限公司测序。从菌株基因组中扩增出1条长551bp的ITS序列,将此序列与GenBank中已有核酸序列Blast比对,结果显示,该菌株的rDNA-ITS序列和L.attenuatum的相应序列同源度为100%。选择GenBank中Lecanicillium属已公布的具代表性的6个菌株的DNA序列,用ClustalX匹配排列,以确定该菌株与同属其它种的亲缘关系。系统发育树显示,该菌株与L.attenuatum属同一种(见图2)。Bootstrap值大于70%就相当于统计学概率的95%,一般75%以上认为是可信的(曹君正,武侠,林森.刀孢蜡蚧菌的鉴定及其对南方根结线虫不同生活阶段的定殖.中国农业科学,2012,45:2404-2411.)。
实施例4:渐狭蜡蚧菌菌株对碳氮源和温度的需求特性
将蜡蚧菌的PDA平板置25℃恒温培养7d,配制1×106的孢子悬浮液。碳/氮源试验:用接种针蘸取适量孢子悬浮液,接种到碳/氮源培养基上(分别以蔗糖或硝酸钠作对照),每种碳/氮源重复5个平板,置于25℃的恒温条件下培养,连续观察菌落的生长情况,培养至第5d开始采用十字交叉法测量菌落生长直径,每隔2d一直观测到第13d。用刀片将培养13d的菌落移入灭菌的含有玻璃珠的50mL吐温水中,涡旋震荡1min,获得分生孢子悬浮液,每个平板为1次重复,用血球计数板测定菌株在不同碳/氮源培养基上的分生孢子产量。温度试验:用接种针蘸取适量孢子悬浮液,接种到PDA平板上,分别置19℃、23℃、27℃和29℃恒温培养,每个温度重复5个平板,蜡蚧菌菌丝生长和产孢测定方法同上述的碳/氮源试验。
1、碳源
在基础培养基(氯化钾0.50g,七水硫酸亚铁0.01g,磷酸氢二钾1.0g,七水硫酸镁0.50g,硝酸钠2g,蔗糖30g,琼脂15g,水1000ml,pH自然)的基础上,用等当量的不同的碳源取代基础培养基中的碳源。渐狭蜡蚧菌(L.attenuatum)HNLA1306菌株在麦芽糖上的菌丝生长最好,其次是可溶性淀粉和蔗糖,葡萄糖、乳糖和甘油上的菌丝生长最差(见表1)。方差分析结果显示,HNLA1306菌株在麦芽糖上的菌丝生长显著优于其他供试碳源。菌落形态观测发现,HNLA1306菌株在以乳糖为碳源的培养基中菌落质地极其稀疏,边缘不整齐,而以麦芽糖为碳源培养基中菌落质地较厚,菌丝较多。HNLA1306菌株在麦芽糖上的产孢量最多,其次是蔗糖和葡萄糖,可溶性淀粉、甘油和乳糖上的产孢量最少(见表2)。方差分析结 果显示,渐狭蜡蚧菌HNLA1306菌株在麦芽糖上的产孢量显著高于其他供试碳源。
表1 不同碳源上渐狭蜡蚧菌(L.attenuatum)HNLA1306菌株的菌落生长特征
注:表中数据为5次重复的平均值±标准误(S.E)
表2 不同碳源上渐狭蜡蚧菌(L.attenuatum)HNLA1306菌株的产孢特征
注:表中数据为5次重复的平均值±标准误(S.E)
2、氮源
用麦芽糖替代基础培养基中的蔗糖,以等当量的5种氮源[蛋白胨、硝酸钾、硫酸铵、脲(尿素)和酵母浸粉]分别替代基础培养基中的硝酸钠(以硝酸钠作对照)。渐狭蜡蚧菌(L.attenuatum)HNLA1306菌株在有机氮源蛋白胨和酵母浸粉上的菌落生长相当,显著优于无机氮源硝酸钾、硝酸钠和硫酸铵(见表3)。t-HNLA1306菌株在有机氮源蛋白胨和酵母浸粉上的产孢量最高,其次是硫酸铵、硝酸钠和硝酸钾,脲的产孢量最低(见表4)。方差分析结果显示,HNLA1306菌株在有机氮源上的产孢量显著高于无机氮源。
表3 不同氮源上渐狭蜡蚧菌(L.attenuatum)HNLA1306菌株的菌落生长特征
注:表中数据为5次重复的平均值±标准误(S.E)
表4 不同氮源上渐狭蜡蚧菌(L.attenuatum)HNLA1306菌株的产孢特征
注:表中数据为5次重复的平均值±标准误(S.E)
3、温度
在PDA培养基(马铃薯200g/L,葡萄糖20g/L,琼脂20g/L,加蒸馏水定容1000ml)上,渐狭蜡蚧菌(L.attenuatum)HNLA1306菌株在19~29℃下均可生长,但是在23~27℃下的菌丝生长显著优于低温19℃和高温29℃(见表5)。HNLA1306菌株在27℃下的产孢量最多,其次是23℃和29℃,19℃最少(见表6)。方差分析结果显示,HNLA1306菌株在27℃下的产孢量显著高于19℃,而23℃和29℃间无显著差异。
表5 不同温度下渐狭蜡蚧菌(L.attenuatum)HNLA1306菌株的菌落生长特征
注:表中数据为5次重复的平均值±标准误(S.E)
表6不同温度下渐狭蜡蚧菌(L.attenuatum)HNLA1306菌株的产孢特征
注:表中数据为5次重复的平均值±标准误(S.E)
实施例5:渐狭蜡蚧菌菌株对大豆孢囊线虫卵孵化的抑制和幼虫的毒杀作用
菌株对线虫卵孵化的抑制:无菌24孔细胞培养板中分别加入渐狭蜡蚧菌的发酵滤液原液、50倍稀释液和100倍稀释液,每孔1.5mL,另设无菌水和4mmo1·L-1Zncl2溶液做为对照。每孔加入卵200粒,置于25℃的恒温培养箱中,14d后记录卵的孵化率,设置3次重复。渐狭蜡蚧菌(L.attenuatum)HNLAl306菌株发酵滤液原液和50倍稀释液处理后的大豆胞囊线虫卵的孵化率分别为4.8%和6.5%,显著低于Zncl2溶液和无菌水处理;而100倍稀释液处理后的大豆胞囊线虫卵的孵化率为10.5%,与无菌水处理无显著差异(见图3)。
菌株对线虫幼虫的毒杀效果:在无菌24孔细胞培养板中分别加入渐狭蜡蚧菌的发酵滤液原液、50倍稀释液和100倍稀释液,每孔1.5mL,另设无菌水做为对照。每孔加入新孵化的大豆胞囊线虫J250条,置于25℃的恒温培养箱中。分别在24、48、60、72h统计渐狭蜡蚧菌发酵液对J2的抑制率。用NaOH刺激法判断J2死亡与否,设置3次重复。渐狭蜡蚧菌(L.attenuatum)HNLAl306菌株发酵滤液处理对大豆胞囊线虫J2的致死率均显著高于无菌水对照,其中发酵原液和50倍稀释液对J2在24h就表现出明显的抑制作用,致死率分别达86.0%和45.0%,远高于无菌水对照致死率6.0%,至48h时后发酵原液和50倍稀释液对J2致死率分别超过95.0%和50.0%(见图4)。
实施例6:渐狭蜡蚧菌菌株对烟粉虱幼虫的寄生效果
将分生孢子配制成浓度分别为约1.0×107、1.0×106和1.0×105个·mL-1的孢子悬液。将孢子悬浮液用小型喷雾器喷在带有2龄烟粉虱若虫的黄瓜叶片上,对照为无菌水,自然晾干。每处理为3片叶,每叶50~100头若虫,3次重复。将植物置于透明的保鲜袋中,再放入25±1℃的光照培养箱中(L∶D=14∶10)。每隔2天镜检并记录被真菌感染死亡的虫数,计算侵染率,连续观察10d。渐狭蜡蚧菌(L.attenuatum)HNLAl306菌株对烟粉虱2龄若虫的累计致死率在接种6d内快速增加,第8d和10d时1.0×107个·mL-1的孢子悬液对烟粉虱2龄若虫的累计致死率分别达85.0%和95.0%;1.0×106个·mL-1的孢子悬液对烟粉虱2龄若虫的累计致死率分别达75.0%和85.0%;1.0×105个·mL-1的孢子悬液对烟粉虱2龄若虫的累计致死率分别达60.0%和70.0%(见图5)。
Claims (2)
1.一种渐狭蜡蚧菌,其特征为渐狭蜡蚧菌(Lecanicillium attenuatum)HALA1306,其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),保藏号为CGMCC No.9220。
2.权利要求1所述的一种渐狭蜡蚧菌菌株在防治大豆胞囊线虫和烟粉虱中的应用。
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