CN101974651B - 辣椒疫霉荧光定量pcr检测法及检测试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及辣椒疫霉荧光定量PCR检测法及检测试剂盒。本发明根据辣椒疫霉rDNA的ITS区设计引物对ljym1/ljym2，反应液中含有该对特异性引物及荧光染料，加入辣椒疫霉DNA模板，随着PCR反应的进行，实时检测反应体系的荧光强度，并根据分析软件计算Ct值，从而计算出样品中辣椒疫霉的含量。根据该方法设计的试剂盒操作简便、快速；特异性好，灵敏度高；基于对核苷酸的检测，不受培养条件限制；定量检测，能真实反映辣椒疫霉侵染植株的情况；可同时进行高通量的样本检测，该试剂盒可对辣椒疫霉进行快速定量检测，可以替代一直沿用的选择性培养基分离培养的传统鉴定方法，并适于在植物病害诊断检测领域广泛推广应用。
Description
技术领域
本发明为一种荧光定量PCR检测辣椒疫霉的方法，专用于检测辣椒疫霉，属于农作物病害诊断与防治技术领域，同时还包括检测用试剂盒。
背景技术
辣椒疫霉寄主范围很广，可以侵染植物地上和地下部分，引起茄科、瓜类疫病。疫霉菌以厚垣孢子或卵孢子形式在土壤中存活。在保护地农作物种植栽培过程中，辣椒疫霉引致的辣椒上的土传病害发生越来越严重，发病严重的辣椒幼苗，先在茎基部形成暗绿色水渍状病斑，迅速褐腐缢缩而猝倒。有的茎基部呈黑褐色，幼苗枯萎死亡。叶片感病，病斑圆形或近圆形，直径2-3cm，边缘黄绿色，中央暗褐色。因其发生具有隐蔽性，大多在结果期才达到发病的高峰期，因此损失巨大，严重影响了保护地的发展与人民的经济收入。
辣椒疫霉菌的传统鉴定方法是采用选择性培养基进行分离培养，菌落形态观察，显微镜下观察病菌的菌丝体，孢子等特征，结合田间发病植株症状的观察，确定病原菌的种类。传统的鉴定方法在很多方面存在一定误差和困难，尤其是对疫霉菌的准确鉴定具有很大局限性，所以仅依靠传统的分离培养方法及显微镜观察是不够的，为了便于准确鉴定，还需要其他补充技术，尤其是分子生物学技术的应用。随着分子生物学技术的日益成熟和广泛应用，人们有可能避开传统的分离培养过程，通过DNA水平上的研究，对植物组织及土壤中的病原菌进行鉴定。
定量PCR是在PCR定性技术基础上发展起来的核酸定量技术。实时荧光定量PCR技术(rea1-time fluorescent quantitative PCR，FQ-PCR)是一种在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监测整个PCR进程，通过扩增产物熔解曲线分析可以特异的检测和鉴定某种病原真菌，通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技术不仅实现了对DNA模板的定量，而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点，目前已广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领域，但在农业研究领域，尤其是在辣椒疫霉的定性定量检测研究中应用的较少。
发明内容
本发明的目的在于克服辣椒疫霉传统检测鉴定方法的不足，提供一种辣椒疫霉的荧光定量PCR快速检测方法。该方法采用根据辣椒疫霉ITS区所设计的特异性引物，优化荧光定量PCR反应体系，实现对发病植物组织中及土壤中的辣椒疫霉的快速检测定量。利用实时荧光定量PCR检测技术体系，可以特异的检测和鉴定辣椒疫霉，并且可以作为辣椒疫霉侵染辣椒植株过程中的监测手段。不仅提高了检测的准确性，还节约了检测时间。
根据上述方法设计的试剂盒，在植物病害诊断与防治领域可以大规模推广。
辣椒疫霉的PCR检测方法，以辣椒疫霉的DNA为模板进行PCR扩增检测，其特征在于：在PCR扩增反应体系中加入有如下一对特异性引物：
特异性引物ljym1：5’-TTGTTTTAAACCCATTTCACAATT-3’，
特异性引物ljym2：5’-CCACAGCAGGAAAAGCATT-3’。
所述PCR反应体系为：10×PCR buffer 2μL，15mM MgCl20.5μL，2.5mM dNTPs 1.6μL，5μM引物ljym1/ljym2各0.5μL，Taq酶(5U/μL)0.2μL，DNA模板1μL，灭菌双蒸水13.7μL，终体积为20μL，扩增检测的程序为：94℃预变性3min；94℃变性1min，65℃退火1min，72℃延伸1min，共30个循环；最后72℃延伸10min。
所述PCR检测为实时荧光PCR检测。
所述PCR扩增反应体系中加入有荧光标记为SYBR Green Supermix。
所述PCR反应总体积为20μL，其中包括SYBR Green Supermix用量10μL，浓度为10μM/L特异性引物ljym1用量1μL，浓度为10μM/L特异性引物ljym2用量1μL，DNA模板用量1μL，其扩增程序为：
第一步：95.00℃3分钟，1个循环；
第二步：：95.0℃45秒，65.0℃45秒，55.0℃1分钟，45个循环；
第三步：55.0℃10分钟，95.0℃1分钟，1个循环；
第四步：55.0℃1分钟，
第五步：55.0℃10秒，80个循环。
所述DNA模板来自于植物组织或土壤。
辣椒疫霉的检测试剂盒，其特征在于包括一PCR反应体系，该反应体系中含有上述特异性引物对ljym1/ljym2。
所述反应体系中还包括荧光标记SYBR Green Supermix。
所述反应体系的总体积为20μL，其中包括SYBR Green Supermix用量10μL，浓度为10μM/L特异性引物ljym1用量1μL，浓度为10μM/L特异性引物ljym2用量1μL，余量为无菌双蒸水7μL。
所述PCR反应体系还包括标准阳性模板。
本发明根据辣椒疫霉ITS区设计了的一对特异性引物ljym1和ljym2，在辣椒疫霉检测中扩增出500bp的产物。采用引物对ljym1/ljym2对辣椒疫霉及其近缘种，属真菌，均没有扩增出上述产物，证明该引物对ljym1/ljym2对辣椒疫霉的检测具有特异性。通过灵敏度实验检测，该引物对ljym1/ljym2对辣椒疫霉的检测具有很高的灵敏性，其DNA浓度可低至0.2ng/ml。
本发明在反应体系中加入荧光物质SYBR Green Supermix，利用荧光信号的积累，可以对辣椒疫霉进行定量分析。
本发明对PCR反应体系进一步优化，实现对发病植物组织中及土壤中的辣椒疫霉的快速检测定量。
按照上述方法可以设计成试剂盒，该试剂盒中还可以提供阳性模板DNA，其浓度按定量标准曲线制备的要求系列稀释。
本发明的有益效果：
本发明提供一种辣椒疫霉的实时荧光定时PCR检测方法，可对植物组织及土壤中的辣椒疫霉进行快速检测定量。与现有技术相比，本发明的有益效果是：
检测准确性高，特异性好，可从植物组织中及土壤中复杂的病原菌环境准确地检测到辣椒疫霉。
检测灵敏度高，对辣椒疫霉的精确检测可达到3个孢子。
操作简便快捷，基于对核苷酸的检测，不受培养条件限制。定量检测，能真实反映辣椒疫霉侵染植株的情况；可同时进行高通量的样本检测。
本发明提供的试剂盒可对辣椒疫霉进行快速定量检测，可以替代一直沿用的分离培养的传统鉴定方法，并适于在植物病害诊断及防治领域广泛推广应用。
因此本发明提供一种荧光定量PCR法检测辣椒疫霉的试剂盒，实用性强，可满足植物病害诊断及监测的需要。
附图说明
图1为特异性检测引物对ljym1/ljym2对辣椒疫霉及其近缘种、属真菌的PCR扩增结果。
其中1-7号为引物对ljym1/ljym2扩增6种病原菌结果：1.辣椒疫霉(Phytophthora capsici)2.番茄晚疫(Phytophthora infestans)3.棉疫霉(Phytophthora boehmeriae)4.寄生疫霉(Phytophthora parasitica)5.隐地疫霉(Phytophthora cryptogea)6.瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum)7.无DNA对照M：DNAMarker I
图2为辣椒疫霉特异引物对ljym1/ljym2的灵敏度检测结果。
其中1-6号为引物对ljym1/ljym2扩增辣椒疫霉DNA模板浓度从高至低系列稀释(200ng/mL-2pg/mL)7.无DNA模板对照M.DL 2000Marker。
图3为标准样品和未知样品的辣椒疫霉荧光定量PCR扩增曲线图(y轴：荧光吸收率；x轴：循环数)。
图4为标准样品和未知样品的辣椒疫霉荧光定量PCR熔解曲线图，图示熔解温度为88℃。
图5为标准样品和未知样品的辣椒疫霉荧光定量PCR标准曲线图。
未知样品：1.病根(有症状，7.5×102个孢子)，2.病茎(有症状，52个孢子)，3.叶(无症状，40个孢子)4.土样(5g土壤，3个孢子)，标准样品：辣椒疫霉质粒DNA系列稀释(3×104-3个孢子)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1辣椒疫霉ITS区的克隆、测序
1)辣椒疫霉DNA制备：
采用平板培养辣椒疫霉(Phytophthora capsici)，置于30℃的培养箱内，生长一周左右，用灭菌的解剖针刮取菌丝体，收集于EP管内，-20℃保存备用。采用液氮研磨菌丝体，常规CTAB法提取各菌株DNA。
2)辣椒疫霉ITS区的扩增
采用真菌rDNA ITS扩增的通用引物ITS1/ITS4(White，T.J.，Bruns，T.，Lee，S.，et al.，Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenies.Innis MA，Glefand D H，Sninsky JJ，et al.a Guide to Methods and Applications.San Diego：AcademicPress，New York，1990，315～322.)扩增辣椒疫霉的ITS区。
PCR反应体系见表1。
表1PCR反应体系
| 总体积 | 20μL |
| 10×PCR Buffer | 2μL |
| dNTP(2.5mmol/L) | 2μL |
| ITS1(10μM/L) | 1μL |
| ITS4(10μM/L) | 1μL |
| 基因组DNA(50ng/μL) | 1μL |
| Taq DNA聚合酶(5U/μL) | 0.2μL |
| ddH2O | 12.8μL |
PCR反应条件：94℃预变性3min；94℃变性1min，50℃退火1min，72℃延伸1min，共30个循环；最后72℃延伸10min。
3)辣椒疫霉ITS区的克隆、测序
在254nm紫外灯下观察橙红色荧光带，切下辣椒疫霉的电泳条带，按DNA纯化试剂盒说明书回收纯化后，-20℃保存备用。
目的片段与pGEM-T Easy载体的连接体系，见表2。将内容物混匀后置4℃连接过夜或16℃温育4h以上。
表2目的片段与pGEM-T Easy载体的连接体系
| 总体积 | 10μL |
| 10X Ligation buffer | 2μL |
| T4DNA连接酶 | 1μL |
| pGEM-T Easy载体 | 1μL |
| 目的片段 | 6μL |
重组质粒的转化及提取方法参照《分子克隆》(黄培堂译Sambrook，Russell编著.分子克隆实验指南[M].第3版1北京：科学出版社，2002)。
采用限制性内切酶NotI对提取的质粒进行酶切，酶切体系为20μL，见表3。
表3限制性内切酶酶切体系
| 总体积 | 20μL |
| 10×H Buffer | 2μL |
| 0.1％BSA | 2μL |
| 0.1％Triton X-100 | 2μL |
| Not I | 1μL |
| 重组质粒 | 5μL |
| ddH2O | 8μL |
将酶切混合物离心混匀后，置37℃酶切3h以上。酶切结束后，加入2μL 10X LoadingBuffer并采用2.0％琼脂糖凝胶电泳观察酶切结果。
经过酶切鉴定的含目标DNA片段的重组质粒委托北京华大基因研究中心进行序列测定，测序结果显示辣椒疫霉ITS区全长793bp，见Seq ID No.1。
实施例2辣椒疫霉的特异性引物检测
材料：1.辣椒疫霉(Phytophthora capsici)2.番茄晚疫(Phytophthora infestans)3.棉疫霉(Phytophthora boehmeriae)4.寄生疫霉(Phytophthoraparasitica)5.隐地疫霉(Phytophthoracryptogea)6.瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)
本发明所采用的微生物均在现有文献中记载过，本实验室也有保存，可向公众发放用于验证试验。
1)各菌株DNA制备：
用黑麦培养基培养所有的疫霉菌，用PDA培养基培养除疫霉以外的所有菌株。
采用平板培养菌株，置于适合温度的培养箱内，生长一周左右，用灭菌的解剖针刮取菌丝体，收集于EP管内，-20℃保存备用。采用液氮研磨菌丝体，常规CTAB法提取各菌株DNA。
2)用于检测辣椒疫霉的特异性引物：
特异性引物ljym1：5’-TTGTTTTAAACCCATTTCACAATT-3’，
特异性引物ljym2：5’-CCACAGCAGGAAAAGCATT-3’。
由上海生工公司合成。
3)用于检测辣椒疫霉的PCR反应体系：
PCR反应体系，其中10×PCR buffer 2μL，15mM MgCl20.5μL，2.5mM dNTPs 1.6μL，5μM引物各0.5μL，Taq酶(5U/μL)0.2μL，DNA模板1μL，灭菌双蒸水13.7μL，终体积为20μL。
4)用于检测辣椒疫霉的PCR扩增程序：
94℃预变性3min；94℃变性1min，65℃退火1min，72℃延伸1min，共30个循环；最后72℃延伸10min。
5)PCR产物的鉴定：
取10μL PCR产物用1％(重量/体积)琼脂糖凝胶电泳分离，经溴化乙锭染色后于紫外灯下根据扩增产物的大小判定结果。
实施结果
特异性检测引物对ljym1/ljym2对辣椒疫霉及其近缘种、属真菌的PCR扩增结果(见附图1)显示该对引物具有很好的特异性。在65℃退火条件下，只对辣椒疫霉有500bp扩增产物，对其他对照菌株均无扩增产物。
实施例3辣椒疫霉特异引物的灵敏度检测
1)辣椒疫霉DNA模板浓度从高至低系列稀释：
将辣椒疫霉DNA模板浓度从高至低10×系列稀释，由高浓度2μg/mL系列稀释至0.2ng/mL。
2)用于检测辣椒疫霉的特异性引物：
特异性引物ljym1：5’-TTGTTTTAAACCCATTTCACAATT-3’，
特异性引物ljym2：5’-CCACAGCAGGAAAAGCATT-3’。
由上海生工公司合成。
3)用于检测辣椒疫霉的PCR反应体系：
PCR反应体系，其中10×PCR buffer 2μL，15mM MgCl20.5μL，2.5mM dNTPs 1.6μL，5μM引物各0.5μL，Taq酶(5U/μL)0.2μL，DNA模板1μL，灭菌双蒸水13.7μL，终体积为20μL。
4)用于检测辣椒疫霉的PCR扩增程序：
94℃预变性3min；94℃变性1min，65℃退火1min，72℃延伸1min，共30个循环；最后72℃延伸10min。
5)PCR产物的鉴定：
取10μL PCR产物用1％(重量/体积)琼脂糖凝胶电泳分离，经溴化乙锭染色后于紫外灯下根据扩增产物的大小判定结果。
实施结果
辣椒疫霉特异引物的灵敏度检测结果(见附图2)显示该对引物具有很高的灵敏性，可检测辣椒疫霉DNA浓度低至0.2ng/mL。
实施实例4荧光定量PCR法检测辣椒发病植株及病土中辣椒疫霉的数量
1)样品DNA制备：
辣椒植株病根、病茎与土样分别收集于EP管内，-20℃保存备用。采用液氮研磨各样品，常规CTAB法提取样品DNA。
2)用于检测辣椒疫霉的特异性引物：
特异性引物ljym1：5’-TTGTTTTAAACCCATTTCACAATT-3’，
特异性引物ljym2：5’-CCACAGCAGGAAAAGCATT-3’。
由上海生工公司合成。
3)用于检测辣椒疫霉的荧光定量PCR反应体系：
反应总体积为20μL，SYBR Green Supermix(Bio-rad，170-8882)10μL，特异性引物ljym1(10μM/L)1μL，特异性引物ljym2(10μM/L)1μL，DNA模板1μL，余量为无菌双蒸水7μL。
标准阳性模板，其浓度按定量标准曲线制备的要求系列稀释。
4)用于检测辣椒疫霉的荧光定量PCR反应程序：
第一步：95.00℃3分钟，1个循环；
第二步：：95.0℃45秒，65.0℃45秒，55.0℃1分钟，45个循环；
第三步：55.0℃10分钟，95.0℃1分钟，1个循环；
第四步：55.0℃1分钟，
第五步：55.0℃10秒，80个循环。
实施结果
应用荧光定量PCR法及该发明试剂盒对辣椒发病植株及病土中的辣椒疫霉的检测结果(见附图3，4，5)，未知样品：1.病根(有症状，7.5×102个孢子)，2.病茎(有症状，52个孢子)，3.叶(无症状，40个孢子)4.土样(5g土壤，3个孢子)。结果显示该发明试剂盒及检测法可灵敏精确地检测辣椒组织及土壤中的辣椒疫霉，检测灵敏度可达到辣椒疫霉3个孢子。
Claims (10)
1.辣椒疫霉的PCR检测方法，以辣椒疫霉的DNA为模板进行PCR扩增检测，其特征在于：在PCR反应体系中加入有如下一对特异性引物：
特异性引物ljym1：5’-TTGTTTTAAACCCATTTCACAATT-3’，
特异性引物ljym2：5’-CCACAGCAGGAAAAGCATT-3’。
2.根据权利要求1所述的检测方法，所述PCR反应体系为：10×PCR buffer 2μL，15mMMgCl2 0.5μL，2.5mM dNTPs 1.6μL，5μM引物ljym1/ljym2各0.5μL，5U/μL Taq酶0.2μL，DNA模板1μL，灭菌双蒸水13.7μL，终体积为20μL，扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性1min，65℃退火1min，72℃延伸1min，共30个循环；最后72℃延伸10min。
3.根据权利要求1所述的检测方法，所述PCR检测方法为实时荧光PCR检测方法。
4.根据权利要求3所述的检测方法，所述PCR反应体系中加入有荧光基团SYBR GreenSupermix。
5.根据权利要求4所述的检测方法，所述PCR反应总体积为20μL，其中包括SYBR GreenSupermix用量10μL，浓度为10μM/L特异性引物ljym1用量1μL，浓度为10μM/L特异性引物ljym2用量1μL，DNA模板用量1μL，余量为无菌双蒸水7μL，其扩增程序为：
第一步：95.00℃3分钟，1个循环；
第二步：：95.0℃45秒，65.0℃45秒，55.0℃1分钟，45个循环；
第三步：55.0℃10分钟，95.0℃1分钟，1个循环；
第四步：55.0℃1分钟；
第五步：55.0℃10秒，80个循环。
6.根据权利要求1所述的检测方法，所述DNA的模板来自于植物组织或土壤。
7.辣椒疫霉的检测试剂盒，其特征在于包括一PCR反应体系，该反应体系中含有特异性引物对ljym1/ljym2，
特异性引物ljym1：5’-TTGTTTTAAACCCATTTCACAATT-3’，
特异性引物ljym2：5’-CCACAGCAGGAAAAGCATT-3’。
8.根据权利要求7所述的检测试剂盒，所述反应体系中还包括荧光标记SYBR GreenSupermix。
9.根据权利要求8所述的检测试剂盒，所述反应体系的总体积为20μL，其中包括SYBRGreen Supermix用量10μL，浓度为10μM/L特异性引物ljym1用量μL，浓度为10μM/L特异性引物ljym2用量1μL，模板为植物组织或土壤中的DNA 1μL，以无菌水补足，终体积为20μL。
10.根据权利要求9所述的检测试剂盒，所述PCR反应体系还包括标准阳性模板。
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| 孙文秀 等.致病性和非致病性辣椒疫霉菌群体的遗传多样性.《华中农业大学学报》.2008,第27卷(第6期),第723-727页. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN101974651A (zh) | 2011-02-16 |
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