CN103333969B - 一种pcr快速检测大丽轮枝菌的方法及其试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种PCR快速检测大丽轮枝菌的方法及其试剂盒。本发明根据大丽轮枝菌rDNA的ITS区设计一对特异性检测引物dali1/dali2，在大丽轮枝菌特异性检测中扩增出372bp的产物。取2μL DNA模板直接加入荧光定量PCR反应液中进行扩增；反应液中含有该对特异性引物及荧光染料，随着PCR反应的进行，实时检测反应体系的荧光强度，并根据分析软件计算Ct值，从而计算出样品中大丽轮枝菌的数量。本发明的试剂盒操作简便、快速，特异性好，灵敏度高；本发明提供的试剂盒可对大丽轮枝菌进行快速定量检测，可以替代一直沿用的分离培养的传统诊断方法，并适于在植物病害诊断检测领域广泛推广应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种PCR快速检测大丽轮枝菌的方法及其试剂盒，专用于检测大丽轮枝菌，属于农作物病害诊断与防治技术领域。
背景技术
大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)，属于半知菌亚门轮枝菌属真菌。大丽轮枝菌的寄主范围极广，寄主植物至少20科80种，大田作物包括向日葵、茄子、辣子、番茄、烟草、马铃薯、甜瓜、西瓜、黄瓜、花生、菜豆、绿豆、大豆、芝麻、甜菜等，一般禾本科作物如水稻、麦类、玉米、谷子、高梁等不受侵害。
大丽轮枝菌主要引起作物黄萎病。病原菌的菌丝体、厚垣孢子和微菌核，随病残体在土中越冬。该菌适生性强，寄主广，防治难度大。
病菌主要在土壤里越冬(夏)，且在土壤里存活时间较长，一般是通过土壤、肥料、灌溉水等进行传播，以侵染危害植株地下部位的根茎为主，且能侵染植物的维管束，病原物在维管束里繁殖，阻塞其输送营养物质，在短期内致使整株植物枯萎而死亡。在保护地农作物种植栽培过程中，大丽轮枝菌引致的土传病害的发生更为严重，导致作物产量损失巨大，严重影响了保护地的发展与人民的经济收入。
传统病原菌鉴定方法通常采用选择性培养基进行病原菌的分离培养，菌落形态观察，显微镜下观察病菌的菌丝体，孢子等特征，结合田间发病植株症状的观察进行分类。传统鉴定方法在很多方面存在一定误差和困难，尤其是对土传病原菌的准确鉴定具有很大局限性。仅菌丝体和孢子等的形态特征也即表型分析来鉴别，有时是不准确的。同一病原菌的菌落往往在形态上、分布、生理性状等方面存在一定差异，难以进行准确鉴定。随着分子生物学技术的日益成熟和广泛应用，人们有可能避开传统的分离培养过程，通过DNA水平上的研究，对土壤中病原菌进行鉴定。分子生物学方法的简便、快速、高效、可靠等特点，是传统的分离培养方法所达不到的。
定量PCR是在PCR定性技术基础上发展起来的核酸定量技术。实时荧光定量PCR技术(rea1-time fluorescent quantitative PCR，FQ-PCR)是一种在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号的积累实时监测整个PCR进程，通过扩增产物熔解曲线分析可以特异的检测和鉴定某种病原真菌，通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技术不仅实现了对DNA模板的定量，而且具有灵敏度高、特异性和可靠性更强、能实现多重反应、自动化程度高、无污染性、具实时性和准确性等特点，目前已广泛应用于分子生物学研究和医学研究等领域，但在农业植物病原真菌的定性定量检测研究中应用较少，尤其是在大丽轮枝菌的定性定量研究中。
发明内容
本发明的目的在于克服大丽轮枝菌传统检测鉴定方法的不足，提供一种PCR法快速检测大丽轮枝菌的方法。在该方法的基础上，优化荧光定量PCR反应体系，实现对发病植物组织中及土壤中的大丽轮枝菌的快速检测定量，可以试剂盒的形式在植物病害诊断与防治领域大规模推广。
同时提供检测大丽轮枝菌的试剂盒。该试剂盒采用根据大丽轮枝菌ITS区所设计的特异性引物，利用优化的荧光定量PCR反应体系，提高了检测的准确性，节约了检测时间，
一种PCR快速检测大丽轮枝菌的方法，以大丽轮枝菌DNA为模板进行PCR反应，其特征在于，所述PCR反应体系中加入有一对特异性引物dali1/dali2，该特异性引物的序列分别为：
特异性引物dali1：5’-CCGCCGGTCCATCAGTCTCTCTG-3’，
特异性引物dali2：5’-GCTTGTAGGGGGTTTAGAGGCAAGC-3’。
所述PCR反应体系为：l0×PCR buffer2μL，15mM MgCl20.5μL，2.5mM dNTPs1.6μL，5μM引物dali1/dali2各0.5μL，浓度为5U/μL的Taq酶0.2μL，DNA模板2μL,，灭菌双蒸水12.7μL，终体积为20μL；PCR扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性1min，63℃退火1min，72℃延伸1min，共30个循环；最后72℃延伸10min。
所述PCT快速检测为实时荧光定量PCR检测。
所述PCR反应体系中加入有荧光基团SYBR Green Supermix。
所述PCR体系总体积为20μL，SYBR Green Supermix10μL，1μL浓度为10μM/L的特异性引物dali1，1μL浓度为10μM/L的特异性引物dali2，DNA模板2μL，余量为无菌双蒸水6μL，检测程序为：
第1步:95.0℃运行3分钟
第2步:95.0℃运行10秒钟
第3步:57.0℃运行30秒钟
第4步:运行第2步,重复39次
第5步:熔解曲线温度65.0℃至95.0℃,每5秒钟增加0.5℃
所述大丽轮枝菌DNA来自植物组织或土壤。
一种检测大丽轮枝菌的试剂盒，包括一PCR反应体系，所述PCR反应体系中含有特异性引物dali1/dali2：
特异性引物dali1：5’-CCGCCGGTCCATCAGTCTCTCTG-3’，
特异性引物dali2：5’-GCTTGTAGGGGGTTTAGAGGCAAGC-3’。
所述PCR反应体系还包括荧光基团SYBR Green Supermix。
所述PCR反应体系为：SYBR Green Supermix10μL，1μL浓度为10μM/L的特异性引物dali1，1μL浓度为10μM/L的特异性引物dali2，无菌双蒸水6μL；反应时需加入的待测大丽轮枝菌DNA模板为2μL。
所述试剂盒还包括标准阳性模板，所述标准阳性模板为大丽轮枝菌菌株DNA经特异性引物dali1/dali2扩增，扩增产物与pGEMT-T Easy载体连接后获得的标准质粒DNA。
本发明根据大丽轮枝菌rDNA的ITS区设计一对特异性检测引物dali1/dali2，在大丽轮枝菌特异性检测中扩增出372bp的产物。
取2μL DNA模板直接加入荧光定量PCR反应液中进行扩增；反应液中含有该对特异性引物及荧光染料，随着PCR反应的进行，实时检测反应体系的荧光强度，并根据分析软件计算Ct值，从而计算出样品中大丽轮枝菌的数量。
本发明提供一种荧光定量PCR法检测大丽轮枝菌的试剂盒，可对植物组织及土壤中的大丽轮枝菌进行快速检测定量。与现有技术相比，本发明的有益效果是：
1、检测准确性高，特异性好，可从植物组织中及土壤中复杂的病原菌环境准确地检测到大丽轮枝菌。
2、检测灵敏度高，对大丽轮枝菌的精确检测可达到109个孢子。
3、操作简便快捷，基于对核苷酸的检测，不受培养条件限制。定量检测，能真实反映大丽轮枝菌定殖和侵染的情况；可同时进行高通量的样本检测。本发明提供的试剂盒可对大丽轮枝菌进行快速定量检测，可以替代一直沿用的分离培养的传统鉴定方法，并适于在植物病害诊断及防治领域广泛推广应用。
因此本发明提供一种荧光定量PCR法检测大丽轮枝菌的试剂盒，实用性强，可满足植物病害诊断及监测的需要。
附图说明
图1 特异性检测引物对dali1/dali2对大丽轮枝菌及其近缘种、属真菌的PCR扩增结果。
其中：1-9号为引物对dali1/dali2扩增8种病原菌结果：1.无DNA对照，2.禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum），3.大丽轮枝菌（Verticillium dahliae），4.辣椒疫霉（Phytophthoracapsici），5.棉疫霉（Phytophthora boehmeriae），6.瓜果腐霉（Pythium aphanidermatum），7.立枯丝核菌（Rhizoctonia solani），8.茄链格孢（Alternaria solani），9.黑白轮枝菌（Verticilliumalbo-atrum），M：100bp Marker
图2 大丽轮枝菌特异引物dali1/dali2的灵敏度检测结果。
其中：1-6号为大丽轮枝菌DNA模板浓度从高至低系列稀释（1μg/mL-10pg/mL），7.无DNA模板对照，M.DL2000Marker。
图3 标准样品和未知样品的大丽轮枝菌荧光定量PCR扩增曲线图(y轴:荧光吸收率；×轴:循环数)。
图4 标准样品和未知样品的大丽轮枝菌荧光定量PCR熔解曲线图，图示熔解温度为89℃。
图5 标准样品和未知样品的大丽轮枝菌荧光定量PCR标准曲线图。
其中：未知样品：1.病根（有明显症状，4.77×106个孢子），2.病根（有明显症状，4.45×106个孢子），3.病茎（有症状，9.84×103个孢子），4.病茎（有症状，9.78×103个孢子），5.病茎（有症状，9.62×103个孢子），6.病土（127个孢子），7.病土（109个孢子）。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。
所用试剂及菌株均为常规产品，市场有售。
实施例1大丽轮枝菌的特异性引物检测
1）各菌株DNA制备：
采用平板培养菌株，置于适合温度的培养箱内，生长一周左右，用灭菌的解剖针刮取菌丝体，收集于EP管内，-20℃保存备用。采用液氮研磨菌丝体，常规CTAB法提取各菌株DNA。
2）用于检测大丽轮枝菌的特异性引物：
特异性引物（dali1）：5’-CCGCCGGTCCATCAGTCTCTCTG-3’，
特异性引物（dali2）：5’-GCTTGTAGGGGGTTTAGAGGCAAGC-3’。
由上海生工公司合成。
3）用于检测大丽轮枝菌的PCR反应体系：
PCR反应体系，其中l0×PCR buffer2μL，15mM MgCl2 0.5μL，2.5mM dNTPs1.6μL，5μM引物各0.5μL，Taq酶(5U/μL)0.2μL，DNA模板2μL，灭菌双蒸水12.7μL，终体积为20μL。
4）用于检测大丽轮枝菌的PCR扩增程序：
94℃预变性3min；94℃变性1min，63℃退火1min，72℃延伸1min，共30个循环；最后72℃延伸10min。
5）PCR产物的鉴定：
取10μL PCR产物用1%(重量/体积)琼脂糖凝胶电泳分离，经溴化乙锭染色后于紫外灯下根据扩增产物的大小判定结果。
实施结果
特异性检测引物对dali1/dali2对大丽轮枝菌及其近缘种、属真菌的PCR扩增结果（见附图1）显示该对引物具有很好的特异性。在63℃退火条件下，只对大丽轮枝菌有372bp扩增产物，对其他对照菌株均无扩增产物。
实施例2 大丽轮枝菌特异性引物的灵敏度检测
1）大丽轮枝菌DNA模板浓度从高至低系列稀释：
将大丽轮枝菌DNA模板浓度从高至低10×系列稀释，由高浓度1μg/mL系列稀释至0.1ng/mL。
2）用于检测大丽轮枝菌的特异性引物：
特异性引物（dali1）：5’-CCGCCGGTCCATCAGTCTCTCTG-3’，
特异性引物（dali2）：5’-GCTTGTAGGGGGTTTAGAGGCAAGC-3’。
由上海生工公司合成。
3）用于检测大丽轮枝菌的PCR反应体系：
PCR反应体系，其中l0×PCR buffer2μL，15mM MgCl2 0.5μL，2.5mM dNTPs1.6μL，5μM引物各0.5μL，Taq酶(5U/μL)0.2μL，DNA模板2μL,，灭菌双蒸水12.7μL，终体积为20μL。
4）用于检测大丽轮枝菌的PCR扩增程序：
94℃预变性3min；94℃变性1min，63℃退火1min，72℃延伸1min，共30个循环；最后72℃延伸10min。
5）PCR产物的鉴定：
取10μL PCR产物用1%(重量/体积)琼脂糖凝胶电泳分离，经溴化乙锭染色后于紫外灯下根据扩增产物的大小判定结果。
实施结果
大丽轮枝菌特异引物的灵敏度检测结果（见附图2）显示该对引物具有很高的灵敏性，可检测大丽轮枝菌DNA浓度低至0.1ng/mL。
实施例3 荧光定量PCR法检测发病番茄植株及病土中大丽轮枝菌的数量
1）样品DNA制备：
温室内接种发病的番茄植株病根、病茎与番茄病土分别收集于EP管内，-20℃保存备用。采用液氮研磨各样品，常规CTAB法提取样品DNA。
2）用于检测大丽轮枝菌的特异性引物：
特异性引物（dali1）：5’-CCGCCGGTCCATCAGTCTCTCTG-3’，
特异性引物（dali2）：5’-GCTTGTAGGGGGTTTAGAGGCAAGC-3’。
由上海生工公司合成。
3）用于检测大丽轮枝菌的荧光定量PCR反应体系：
反应总体积为20μL，SYBR Green Supermix10μL，特异性引物dali1（10μM/L）1μL，特异性引物dali2（10μM/L）1μL，DNA模板2μL，余量为无菌双蒸水6μL。
标准阳性模板，其浓度按定量标准曲线制备的要求系列稀释。
4）用于检测大丽轮枝菌的荧光定量PCR反应程序：
第1步:95.0℃运行3分钟
第2步:95.0℃运行10秒钟
第3步:57.0℃运行30秒钟
第4步:运行第2步,重复39次
第5步:熔解曲线温度65.0℃至95.0℃,每5秒钟增加0.5℃
实施结果
应用荧光定量PCR法及该发明试剂盒对发病番茄植株及番茄病土中的大丽轮枝菌的检测结果（见附图3，4，5），未知样品：1.病根（有明显症状，4.77×106个孢子），2.病根（有明显症状，4.45×106个孢子），3.病茎（有症状，9.84×103个孢子），4.病茎（有症状，9.78×103个孢子），5.病茎（有症状，9.62×103个孢子），6.病土（127个孢子），7.病土（109个孢子）。该结果显示该发明试剂盒及检测方法可灵敏精确地检测植株茎及土壤中的大丽轮枝菌的数量，检测结果可达到109个孢子。
Claims (10)
1.一种PCR快速检测大丽轮枝菌的方法，以大丽轮枝菌DNA为模板进行PCR反应，其特征在于，所述PCR反应体系中加入有一对特异性引物dali1/dali2，该特异性引物的序列分别为：
特异性引物dali1：5’-CCGCCGGTCCATCAGTCTCTCTG-3’，
特异性引物dali2：5’-GCTTGTAGGGGGTTTAGAGGCAAGC-3’。
2.根据权利要求1所述的方法，所述PCR反应体系为：l0×PCR buffer2μL，15mM MgCl2 0.5μL，2.5mM dNTPs1.6μL，5μM引物dali1/dali2各0.5μL，浓度为5U/μL的Taq酶0.2μL，DNA模板2μL,，灭菌双蒸水12.7μL，终体积为20μL；PCR扩增程序为：94℃预变性3min；94℃变性1min，63℃退火1min，72℃延伸1min，共30个循环；最后72℃延伸10min。
3.根据权利要求1所述的方法，所述PCR快速检测为实时荧光定量PCR检测。
4.根据权利要求3所述的方法，所述PCR反应体系中加入有荧光基团SYBR Green Supermix。
5.根据权利要求4所述的方法，所述PCR体系总体积为20μL，SYBR Green Supermix 10μL，1μL浓度为10μM/L的特异性引物dali1，1μL浓度为10μM/L的特异性引物dali2，DNA模板2μL，余量为无菌双蒸水6μL，检测程序为：
第1步:95.0℃运行3分钟，
第2步:95.0℃运行10秒钟，
第3步:57.0℃运行30秒钟，
第4步:运行第2步,重复39次，
第5步:熔解曲线温度65.0℃至95.0℃,每5秒钟增加0.5℃。
6.根据权利要求1所述的方法，所述大丽轮枝菌DNA来自植物组织或土壤。
7.一种检测大丽轮枝菌的试剂盒，包括一PCR反应体系，所述PCR反应体系中含有特异性引物dali1/dali2：
特异性引物dali1：5’-CCGCCGGTCCATCAGTCTCTCTG-3’，
特异性引物dali2：5’-GCTTGTAGGGGGTTTAGAGGCAAGC-3’。
8.根据权利要求7所述的试剂盒，所述PCR反应体系还包括荧光基团SYBR Green Supermix。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，所述PCR反应体系为：SYBR Green Supermix10μL，1μL浓度为10μM/L的特异性引物dali1，1μL浓度为10μM/L的特异性引物dali2，无菌双蒸水6μL；需加入的待测大丽轮枝菌DNA模板2μL。
10.根据权利要求1所述的试剂盒，还包括标准阳性模板，所述标准阳性模板为大丽轮 枝菌菌株DNA经特异性引物dali1/dali2扩增，扩增产物与pGEMT-T Easy载体连接后获得的标准质粒DNA。
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