CN111349696B

CN111349696B - 一种农作物中链格孢菌的定量快速鉴定方法

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Publication number: CN111349696B
Application number: CN202010368621.0A
Authority: CN
Inventors: 李毅然; 秦晋一; 梁靓; 薛佳欣; 兰茜; 郭佳琪
Original assignee: Xi'an Customs Technical Center
Current assignee: Xi'an Customs Technical Center
Priority date: 2020-05-01
Filing date: 2020-05-01
Publication date: 2023-04-28
Anticipated expiration: 2040-05-01
Also published as: CN111349696A

Abstract

本发明涉及一种农作物中链格孢菌的定量快速鉴定方法，采用ITS序列扩增和DNA分子鉴定确定进口农作物携带的微生物属种；纯化培养该菌株，收集细胞膜并测定其磷酸脂肪酸(PLFA)种类和含量；比较不同生物干重下的PLFA分布图谱，确定菌株的生物取样量范围。数理统计分析PLFA指纹图谱，明确特征脂肪酸的种类和分布；最终利用多元线性回归建立理论模型，通过特征脂肪酸的响应值推算出农作物携带链格孢菌的生物干重。本发明的定量快速鉴定方法，能够快速鉴定农作物中的链格孢菌，缩短鉴定时间，提高鉴定效率，防止农作物夹杂携带病原菌进行传播，进而保障我国的生物安全。

Description

一种农作物中链格孢菌的定量快速鉴定方法

技术领域

本发明涉及一种农作物中链格孢菌的定量快速鉴定方法，属于病原链格孢菌鉴定的领域。

背景技术

农作物中，尤其是进口农作物，如小麦、玉米等农作物，经长途运输，可能使农作物中携带的真菌病爆发，严重影响农作物的品质，其夹杂携带的病原菌还可能对国内经济作物造成潜在危害。经检验此病菌主要为链格孢菌。

链格孢菌是半知菌暗色丝孢菌中重要的一类真菌，种属划分上为子囊菌座囊菌纲格孢腔菌目格孢腔菌科链格孢属。该属真菌种类多，在土壤、空气和农作物残体中均有分布，绝大多数种能兼性寄生在植物上，是常见的植物病原菌。植物病原菌是农作物的主要致病菌之一,它能引起包括玉米、小麦、烟草、马铃薯、番茄、苹果、梨等几十种农作物发病。链格孢除了引起农作物病害外，如日本梨黑斑病、烟草赤星病、番茄早疫病、马铃薯早疫病和柑橘幼苗萎黄病等还极易引起农产品霉变，导致蔬菜、瓜果和储存食品腐败变质。发生作物病害及食品腐败现象是由于病菌的代谢产物——毒素导致的。产生的植物毒素主要分为寄主专化性毒素(host-selective toxins，HSTs)和非寄主专化性毒素(nonhost-selectivetoxins，NHSTs)两类。产生的毒素能不断累积于农作物、瓜果蔬菜和日常食物中，对食品安全造成严重威胁。小麦、高粱等谷类作物，苹果、柑橘、西红柿等瓜果蔬菜，苹果汁、红酒等酒水饮品，橄榄油、莱籽油等常见食用油，以及其他农产品中均可检测出链格孢毒素。此外，不但生物富集效应能使毒素不断积累，而且链格孢的孢子能通过释放过敏原，引发哮喘病等人体疾病，从而威胁人体健康。链格孢引起的农作物病害危害严重，对农业生产安全、农产品食用安全有着严重威胁，加强有关链格孢的研究并建立起有针对性的防控策略和技术，则显得尤为重要。

现有技术鉴定微生物的技术从宏观到微观通常分成4个不同的水平：菌落、细胞形态和生理生化水平；细胞组分水平；蛋白质水平；基因水平。传统的微生物分离鉴定方法其检测步骤繁杂、速度慢、准确性差，已经不适用于这方面的研究。而在基因水平上，以聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)为基础的分子生物学检测手段，因为其快速、灵敏、准确的特点，被大范围的使用。这种分子生物学技术可以在PCR扩增的基础上，检测鉴定一些原含量很低的DNA序列。

目前在越来越先进的生物技术发展背景下，一些更为科学的微生物群落分析鉴定方法应运而生，如磷脂脂肪酸(phospholipid fatty acid,PLFA)法、DNA测序法等方法。由于提取DNA步骤繁琐，仪器要求较高，工作环境洁净度要求苛刻，送出去商品测序耗时较长，成本较高，并不是鉴定链格孢菌的最便捷方法，如中国专利公开号CN103343168A报道了一种快速鉴定病原真菌的方法，改良了DNA测序方法，与传统方法相比具有操作简单、成本低、速度快等优点，但是该方法无法定量检测病原真菌。而PLFA分析法最初被大量应用于土壤微生物，后来渐渐应用到环境微生物、地下水、水体沉积物,以及水污染及处理领域等微生物群落结构和功能的研究中。本发明采用磷脂脂肪酸(PLFA)分析法进行微生物的快速分析鉴定，进而推算出农作物携带链格孢菌的生物干重，建立了一种简便有效的定量快速鉴定方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种操作简单、低成本、检测快速的农作物中链格孢菌的定量快速鉴定方法。

为实现上述目的，本发明采取如下技术方案：

.一种农作物中链格孢菌定量的快速鉴定方法，包括以下步骤：(1)菌株的采集；(2)菌株的培养；(3)分离菌种的DNA鉴定；(4)分离菌种的磷酸脂肪酸鉴定；(5)利用线性回归计算农作物携带链格孢菌的生物干重。

优选地，步骤(1)中菌株的采集来自于小麦、玉米、烟草、马铃薯、番茄、苹果、梨中的一种。

优选地，步骤(2)中采集后的菌株接种于PDA琼脂固体平板培养基中培养经过2-4天，待其培养出菌落。然后将其分离纯化得到的菌株接种于PDA培养基，在培养箱中于25℃、黑暗条件下培养，观察两株菌的菌落的形态特点，待菌种生长起来后置于冰箱，温度为4℃中冷藏备用。

优选地，步骤(3)中分离菌种的DNA鉴定步骤为：DNA提取→DNA浓度及纯度检测→PCR扩增→琼脂糖凝胶电泳；采用通用引物ITS1和ITS4对分离出的微生物的核糖体DNA转录间隔区(Internal transcribed spacer,ITS)进行了PCR扩增；通过对扩增产物进行测序，在NCBI数据库进行核酸搜索，获取同源细菌的序列，确定链格孢菌，纯化培养该菌株。

优选地，步骤(3)中其中PCR的反应体系为：DNA模板×4μL；dNTPs为10mmol/L×1Ul；ITS1为10umol/L×2ul；ITS4为10umol/L×2ul；10×含MgCl₂的Buffer×8Ul；Taq聚合酶1.0μL；RNase Free Water×32Ul；PCR反应过程为：94℃预变性3分钟，94℃变性1分钟，55℃退火1分钟，72℃延伸50秒，进行33个循环，最后72℃延伸10分钟。

优选地，步骤(4)中用液体培养基培养的菌种提取PLFA，将液体培养基中菌落进行破壁、皂化、脂肪酸甲基化、萃取、碱洗涤，最后置于气相色谱仪；实验用色谱分析条件：色谱柱为Agilent 19091B-102石英毛细管柱；进样口温度250℃，进样口压力21Psi，检测器温度300℃；程序升高柱温：40℃起始，50℃/min升温升至280℃，维持2min；载气H₂流量30mL/min，尾吹气N₂流量25mL/min；进样量1μL，进样分流比45:1；最后以MIDI微生物鉴定系统进行脂肪酸分析。

优选地，步骤(5)中收集细胞膜并测定其磷酸脂肪酸(PLFA)种类和含量，比较不同生物干重下的PLFA分布图谱，确定菌株的生物取样量范围，数理统计分析PLFA指纹图谱，明确特征脂肪酸的种类和分布，最终利用多元线性回归建立理论模型，通过特征脂肪酸的响应值推算出农作物中携带链格孢菌的生物干重。

优选地，生物干重的取样范围应确定为0.07g-0.09g；链格孢菌的特征脂肪酸为15:0iso、15:0anteiso、16:1w7c和18:2w6,9c；特征脂肪酸响应值与生物干重之间的回归需建立双重模型。

响应值与生物干重之间的多元线性回归为：

Y_a,b,c＝0.047+6.183×10^(-5)×a+4.330×10^(-6)×b+1.386×10^(-7)×c

式中：Ya,b,c为15:0anteiso、18:2w6,9c、16:1w7c回归计算出的生物干重，a，b，c分别为15:0anteiso、16:1w7c和18:2w6c,9c的响应值；分析15:0iso的响应值与生物干重之间的线性回归模型为

Y_d＝0.036+2.864×10^(-5)×d

式中：Yd为15:0iso回归计算出的生物干重，d表示15:0iso响应值。

本发明所获得的有益技术效果：

(1)本发明的农作物中链格孢菌的定量快速鉴定方法操作简单、方法简便、低成本、检测快速；具体采用磷脂脂肪酸(PLFA)分析法进行微生物的快速分析鉴定，进而推算出农作物中携带链格孢菌的生物干重。

(2)本发明在实际应用中，获取一定量的生物磷脂脂肪酸的响应值是十分困难的，而获取一定量的生物干重相对容易许多，因此研究生物干重与生物磷脂脂肪酸响应值之间的定量关系具有十分重要的实际意义。此双重线性回归模型可通过生物细胞膜磷酸脂肪酸响应值推算出其实际干重，这样我们可以根据自己需要得到的生物细胞膜磷酸脂肪酸响应值的量，来确定所需的生物干重，可为实验者省去多次实验，简化实验操作步骤。此外，该方法能够准确计算出链格孢菌生物干重，尤其在进口农作物的检测等领域具有十分重要的实际意义，进一步保障了我国的生物安全。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

在附图中：

附图1为不同生物干重下磷脂脂肪酸种类和分布；

附图2为生物干重与链格孢菌细胞膜磷酸脂肪酸响应值之间的冗余分析；

附图3为利用磷肪酸计算生物干重的双重线性回归模型。

具体实施方式

以下将参照附图，通过实施例方式举例或详细地描述本发明的技术方案。在此需要说明的是，对于这些实施例方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。

实施例1

1、实验部分：

1.1主要实验设备

气相色谱仪(6850美国)；正置荧光显微镜(BX61日本)；台式恒温振荡器(IS-RDD3美国)；生化培养箱(MIR-254日本)；高压灭菌锅(HVE-50日本)；电热鼓风干燥箱(101A-1上海)；单通道移液器(Transferpette德国)；全自动纯水/超纯水系统(Elix3/MiiliQ美国)；台式涡旋器(中国)；小型台式离心机(Sigma-14德国)；电子天平(AL204瑞士)；紫外可见分光光度计(UV-2550日本)；Lab Dancer(S25美国)；球磨仪(中国)；快速PCR仪(S1000美国)；电泳仪(PowerPac美国)；荧光成像仪(ChemiDoc美国)；数字显示水浴锅(HH-2中国)。

1.2主要实验药剂

75％酒精(宝鸡市康利工贸有限公司)；次氯酸钠；LB肉汤培养基(北京奥博星生物技术有限责任公司)；马铃薯葡萄糖琼脂(含氯霉素北京路桥技术有限责任公司)；DAPI荧光染料；磷酸缓冲液；基因组提取盒(天根生化科技有限公司)；Taq聚合酶(Takara)；DNaseFree Water(Takara)；10×Buffer(含MgCl₂北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)；DNTP(Takara)；琼脂糖(上海制药集团化学试剂有限公司)；10×TBE(无Dnase酶西安赫特生物)；DL2000 Marker(Takara)；Loading Buffer(Takara)；EB类似物；通用型DNA回收试剂盒(天根生化科技有限公司)；饱和NaCl；甲醇；浓盐酸；NAOH颗粒；正己烷；甲基叔丁醚。

1.3菌株的培养

本次研究中，在陕西省出入境检疫局的协助，提供了筛选出的样品。前期将样品接种于PDA琼脂固体平板培养基中培养经过2-4天，待其培养出菌落。然后将其分离纯化得到的菌株接种于PDA培养基，在培养箱中于25℃、黑暗条件下培养，观察两株菌的菌落的形态特点，待菌种生长起来后置于冰箱(T＝4℃)中冷藏备用。

1.4分离菌种的DNA鉴定

分离菌种的DNA鉴定步骤为：DNA提取→DNA浓度及纯度检测(Nanodrop A₂₆₀/A₂₈₀>1.8)→PCR扩增→琼脂糖凝胶电泳。

本实验采用通用引物ITS1和ITS4对分离出的微生物的核糖体DNA转录间隔区(Internal transcribed spacer,ITS)进行了PCR扩增PCR的反应体系为：DNA模板×4μL；dNTPs(10mmol/L)×1Ul；ITS1(10umol/L)×2ul；ITS4(10umol/L)×2ul；10×Buffer(含MgCl₂)×8Ul；Taq聚合酶1.0μL；RNase Free Water×32Ul；其中，DNA浓度及纯度检测及琼脂糖凝胶电泳采用现有常规技术实施，优选地，DNA浓度及纯度检测采用Nanodrop仪器确定，浓度由仪器直接显示，纯度以A₂₆₀/A₂₈₀检测指标大于1.8即表明其纯度符合要求，PCR扩增之后进行琼脂糖凝胶电泳，只是为了检查是否到达测序纯度要求，该步骤中优选电压采用85V，琼脂糖凝胶占比1.5％。

PCR反应过程为：94℃预变性3分钟；94℃变性1分钟，55℃退火1分钟，72℃延伸50秒，33个循环；最后72℃延伸10分钟。

扩增产物经通用型DNA回收试剂盒进行纯化，纯化产物送外进行序列测定。

1.5分离菌种的磷酸脂肪酸鉴定

本实验用液体培养基培养的菌种提取PLFA。崔昌浩等人曾同时对比固体和液体培养基培养菌种提取脂肪酸，发现液体培养相较于固体培养的后提取的脂肪酸种类和含量更多，适于气相色谱分析。基于这一原理，将液体培养基中菌落进行破壁、皂化、脂肪酸甲基化、萃取、碱洗涤，最后置于气相色谱仪。实验用色谱分析条件：色谱柱为Agilent 19091B-102(30m×0.32mm×0.25μm)石英毛细管柱；进样口温度250℃，进样口压力21Psi，检测器温度300℃。程序升高柱温：40℃起始，50℃/min升温升至280℃，维持2min；载气H₂(30mL/min)，尾吹气N₂(25mL/min)；进样量1μL，进样分流比45:1。最后以MIDI微生物鉴定系统进行脂肪酸分析。

1.6利用线性回归计算农作物携带链格孢菌的生物干重

收集链格孢菌并测定其磷酸脂肪酸(PLFA)种类和含量，比较不同生物干重下的PLFA分布图谱，确定菌株的生物取样量范围，数理统计分析PLFA指纹图谱，明确特征脂肪酸的种类和分布，建立农作物携带链格孢菌的生物干重与脂肪酸响应值之间的多元线性回归关系模型，利用特征脂肪酸的响应值，推算出农作物携带链格孢菌的生物干重。

2、实验结果

2.1菌株的DNA分子鉴定

通过对扩增产物进行测序，在NCBI数据库进行核酸搜索，获取同源细菌的序列，确定B菌为格孢属链格孢菌(Alternaria alternata)。迄今为止从链格孢菌中分离出的几种寄主特异性毒素包括对多种作物重要品种如梨、苹果、柑橘和番茄等有活性的化合物。大多数情况下，HST产生链格孢菌的致病因子，其可破坏植物组织并诱发疾病植物病原链格孢菌产生寄主选择性毒素，该选择性毒素是一类低分子量的次生代谢物，在植物与病原的相互作用中起着控制致病性和毒力的作用。致病性是引起疾病的能力，而毒力是指引起疾病的程度或严重程度。

目前已知的7种由链格孢菌引起的病害中，HSTs是真菌致病的主要原因。由于形态上的相似性，但病理上存在差异，该病原体已被定义为A.Alternat a的病理类型。目前A.alternata HSTs在发病机制中的作用已被广泛研究。研究显示A.alternata HSTs是在渗透辅助作用之前从发芽分生孢子中释放HST，HST通过抑制宿主细胞的防御反应来诱导宿主细胞的易感性，从而使植物发病。

Takashi Tsuge在植物病原真菌黑斑病产生的寄主选择性毒素的研究中从六种病理类型中测定了HST的化学结构，并对HST产生的分子遗传学的研究，确定了编码HST基因簇的超数染色体，并为A.Alternat a病型的进化提供了新的见解。

2.2PLFA-检疫方法中生物采样量的确定

在实际操作中，获取一定量的生物磷脂脂肪酸(PLFA)的响应值是十分困难的，但采集一定量的生物干重相对容易许多，所以研究生物干重与生物磷脂脂肪酸响应值之间的定量关系具有十分重要的实际意义。遂下文对两者之间的关系进行研究。利用磷脂脂肪酸图谱分析，采集不同生物干重下磷脂脂肪酸种类和含量分布。结果显示，作图结果见图1。15:0iso、15:0anteiso、16:1w7c、18:2w6,9c磷酸脂肪酸的响应值占总响应值超过50％，按百分比从大到小排列依次为18:2w6,9c>15:0iso>16:1w7c>15:0anteiso。当生物干重为0.07g、0.075g、0.08g、0.09g时，18:2w6,9c的响应值占比在47％左右；15:0iso的响应值占比稳定在为3％；15:0anteiso和16:1w7c的响应值占比在1％左右，而当0.19g生物干重时，18:2w6,9c的响应值占比为37％；15:0iso的响应值占比为11％；15:0anteiso的响应值占比为2％，16:1w7c的响应值占比为1％。由此可见，在0.19g生物干重下，脂肪酸分布占比与0.07g、0.75g、0.08g和0.09g生物干重中脂肪酸分布占比，有显著性差异。用软件SPSS25对这几组数据进行差异性比较，当生物干重大于0.19g时，在α＝0.01下，其磷酸脂肪酸的占比会发生极其显著性差异。在本研究中，当生物干重为0.07g-0.09g这一范围内，其各种磷酸脂肪酸的占比无显著性差异。因此，生物干重的取样范围应确定为0.07g-0.09g。

2.3格孢属链格孢菌的特征脂肪酸确定

表1生物干重与细胞膜磷酸脂肪酸响应值之间的相关性分析

*.在0.05级别(双尾)，相关性显著。

**.在0.01级别(双尾)，相关性显著。

不同生物干重与相应提取的磷脂脂肪酸进行数理分析比较，结果显示15:0iso、15:0anteiso、16:1w7c和18:2w6,9c这四种脂肪酸与生物干重的肯德尔系数高达1，同时相伴概率P值明显小于显著性水平0.05，这说明15:0iso、15:0anteiso、16:1w7c和18:2w6,9c这四种脂肪酸与生物干重呈显著线性相关。选取15:0iso、15:0anteiso、16:1w7c和18:2w6,9c磷酸脂肪酸的响应值和生物干重进行冗余分析作图。

分析结果如图2所示。图2中两条线段的夹角大小可反映两变量之间的相关程度，夹角越小说明相关程度越大，反之，则证明相关程度越小。从图2可知，15:0iso、15:0anteiso、16:1w7c和18:2w6,9c这几种磷酸脂肪酸响应值与生物干重之间的夹角都小于45°，均具有较强的相关性。磷酸脂肪酸与生物干重之间夹角大小的顺序为：16:1w7c>18:2w6,9c>15:0anteiso>15:0iso。这与相关性分析，得出的结论相一致。因此确定，链格孢菌的特征脂肪酸为15:0iso、15:0anteiso、16:1w7c和18:2w6,9c。与MIDI系统中链格孢属菌磷脂脂肪酸一致。

利用磷肪酸计算生物干重的线性回归模型建立

磷酸脂肪酸的响应值占总响应值的百分比，从大到小依次为18:2w6,9c>15:0iso>16:1w7c>15:0anteiso；磷酸脂肪酸响应值与生物干重的相关性，由强到弱依次为15:0iso>15:0anteiso>18:2w6,9c>16:1w7c。通过线性回归模型建立，发现其中15:0iso单独与生物干重呈良好的线性关系，15:0anteiso、16:1w7c和18:2w6，9c的综合值与生物干重也呈现明显相关，因此特征脂肪酸响应值与链格孢菌生物干重之间的回归需建立双重模型。

用软件SPSS 25分析15:0anteiso、18:2w6,9c、16:1w7c的响应值与生物干重之间的多元线性回归，得到理论模型为

Y_a,b,c＝0.047+6.183×10^(-5)×a+4.330×10^(-6)×b+1.386×10^(-7)×c

式中：Ya,b,c为15:0anteiso、18:2w6,9c、16:1w7c回归计算出的生物干重，a，b，c分别为15:0anteiso、16:1w7c和18:2w6c,9c的响应值。此外，分析15:0iso的响应值与生物干重之间的线性回归模型为：

Y_d＝0.036+2.864×10^(-5)×d

利用特征脂肪肪酸计算生物干重的双重线性回归模型模型图，通过线性回归模型建立，发现其中15:0iso单独与生物干重呈良好的线性关系，15:0anteiso、16:1w7c和18:2w6，9c的综合值与生物干重也呈现明显相关，因此特征脂肪酸响应值与生物干重之间的回归需建立双重模型。从图3分析得，当生物干重的实际值为0.075g时，双重模型会出现很大的误差，多元线性回归模型和单元线性回归模型相比，单元线性回归模型的误差较大。随着生物干重的变化，单元线性回归模型的变化也较明显。但是，由单元线性回归模型推算生物干重只需知道15iso的响应值，由多元线性回归模型推算生物干重需知道15anteiso、18:2w6,9c、16:1w7c的响应值，相比之下通过单元线性回归模型推算生物干重其计算较简单。应该注意：在应用模型时应同时考虑Ya,b,c和Yd，只有当计算出的Ya,b,c与Yd的差值在0.0018g这一范围内，该模型才有实际应用意义。

以上所述仅为本发明的优选实施例或实施例的列举，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原理之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种农作物中链格孢菌定量的快速鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)菌株的采集；

(2)菌株的培养；

(3)分离菌种的DNA鉴定；所述分离菌种的DNA鉴定步骤为：DNA提取→DNA浓度及纯度检测→PCR扩增→琼脂糖凝胶电泳；

(4)分离菌种的磷酸脂肪酸鉴定；采用液体培养基培养的菌种提取PLFA，将液体培养基中菌落进行破壁、皂化、脂肪酸甲基化、萃取、碱洗涤，后置于气相色谱仪，最后以MIDI微生物鉴定系统进行脂肪酸分析；

(5)利用线性回归计算农作物携带链格孢菌的生物干重；收集细胞膜并测定其磷酸脂肪酸(PLFA)种类和含量，比较不同生物干重下的磷酸脂肪酸PLFA分布图谱，确定菌株的生物取样量范围，数理统计分析磷酸脂肪酸PLFA指纹图谱，明确特征脂肪酸的种类和分布，最终利用多元线性回归建立理论模型，通过特征脂肪酸的响应值推算出农作物携带链格孢菌的生物干重；

所述生物干重的取样范围应确定为0.07g-0.09g；所述链格孢菌的特征脂肪酸为15:0iso、15:0anteiso、16:1w7c和18:2w6,9c；所述特征脂肪酸响应值与生物干重之间的回归需建立双重模型；所述特征脂肪酸响应值与生物干重之间的多元线性回归为：

Y_a,b,c＝0.047+6.183×10^(-5×a+4.330×10^(-6)×b+1.386×10^(-7×c

式中：Ya,b,c为15:0anteiso、18:2w6,9c、16:1w7c回归计算出的生物干重，a，b，c分别为15:0anteiso、16:1w7c和18:2w6c,9c的响应值；

所述15:0iso的响应值与生物干重之间的线性回归模型为Y_d＝0.036+2.864×10^(-5)×d

2.根据权利要求1所述的农作物中链格孢菌定量的快速鉴定方法，其特征在于，步骤(1)中菌株的采集来自于小麦、玉米、烟草、马铃薯、番茄、苹果、梨中的一种或几种。

3.根据权利要求1所述的农作物中链格孢菌定量的快速鉴定方法，其特征在于，步骤(2)中采集后的菌株接种于PDA琼脂固体平板培养基中培养经过2-4天，待其培养出菌落；然后将其分离纯化得到的菌株接种于PDA培养基，在培养箱中于25℃、黑暗条件下培养，观察两株菌的菌落的形态特点，待菌种生长起来后置于冰箱，温度为4℃中冷藏备用。

4.根据权利要求1所述的农作物中链格孢菌定量的快速鉴定方法，其特征在于，步骤(3)中PCR扩增采用通用引物ITS1和ITS4对分离出的微生物的核糖体DNA转录间隔区进行了PCR扩增；通过对扩增产物进行测序，在NCBI数据库进行核酸搜索，获取同源细菌的序列，确定链格孢菌，纯化培养该菌株。

5.根据权利要求1所述的农作物中链格孢菌定量的快速鉴定方法，其特征在于，步骤(3)中其中PCR的反应体系为：DNA模板×4μL；dNTPs为10mmol/L×1Ul；ITS1为10umol/L×2ul；ITS4为10umol/L×2ul；10×含MgCl₂的Buffer×8Ul；Taq聚合酶1.0μL；RNase FreeWater×32Ul；PCR反应过程为：94℃预变性3分钟，94℃变性1分钟，55℃退火1分钟，72℃延伸50秒，进行33个循环，最后72℃延伸10分钟。

6.根据权利要求1所述的农作物中链格孢菌定量的快速鉴定方法，其特征在于，步骤(4)实验用色谱分析条件：色谱柱为Agilent 19091B-102石英毛细管柱；进样口温度250℃，进样口压力21Psi，检测器温度300℃；程序升高柱温：40℃起始，50℃/min升温升至280℃，维持2min；载气H₂流量30mL/min，尾吹气N₂流量25mL/min；进样量1μL，进样分流比45:1。