CN103361439A - 一种集成检测9种啤酒污染菌的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种集成检测9种啤酒污染菌的方法，属于啤酒技术领域，采用9重PCR一次性同时扩增9种污染菌短乳杆菌Lactobacillusbrevis、干酪乳杆菌Lactobacilluscasei、乳酸杆菌Lactobacilluscoryniformi、植物乳杆菌Lactobacillusplantarum、类丘状乳杆菌Lactobacillusparacollinoides、林氏乳杆菌Lactobacilluslindneri、有害片球菌Pediococcus damnosus、意外片球菌Pediococcus inopinatus、克氏片球菌Pediococcus clausenii，再通过毛细管电泳分离9重PCR扩增产物，所述多重PCR反应中应用引物SEQIDNO.1-18；用于啤酒中污染微生物检测的高通量、半定量分析方法，在啤酒污染菌的检测、溯源方面具有重要的意义。
Description
技术领域
本发明属于啤酒技术领域用于啤酒污染菌检测方法，特别涉及一种基于多重PCR技术以及毛细管电泳分离技术，用于啤酒中常见污染菌检测的高通量、半定量分析方法。
背景技术
啤酒的酿造过程是建立在纯啤酒酵母的发酵和对污染微生物控制的基础上的，啤酒中主要的污染微生物是带有抗酒花基因的乳酸菌，对于此类微生物的检测方式主要分为两类，第一类是基于培养基的传统培养法，国内外大多数啤酒厂采用此类方法，但检测时间长，且只能定量不能定性到种属，因此无法及时指导生产技术人员对啤酒生产过程进行监控；第二类是基于PCR技术的分子生物学检测方法，PCR技术从核酸、基因水平极大地提高了检测效率及灵敏度，能够定性到种、属或一类目标菌，检测快速且定性能力强，因此无论对于成品啤酒质量的监控，或者生产过程问题的溯源排查，PCR技术的应用都具有广阔的前景和深远的意义，但一次反应只能检测一类微生物。
多重PCR技术是在同一PCR反应体系里加入两对以上的引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，具有高效、高通量的特点，同时可以降低检测成本。目前多重PCR技术已经在食品检测及病原体诊断等多个方面得到广泛应用，但由于易造成啤酒污染的乳酸菌种类多且同源性较高，需在各自种内保守区域逐一设计特异性引物，且由于多对单引物组成的多重PCR引物体系的设计规则复杂，设计过程需平衡引物体系内各单引物浓度，同时优化反应体系、调整扩增程序以保证多对引物的同步扩增，且受后期PCR产物在凝胶电泳中分辨率的限制的影响，目前的多重PCR反应至多只能做到5-6重PCR，仍无法满足近十种啤酒污染菌的高通量的检测需求。
发明内容
本发明的目的在于针对现有技术的缺陷，克服常规啤酒中污染菌检测技术操作繁琐，费时耗力以及检测种类少等不足，提供一种由9对引物组成的引物体系，通过采用高通量的多重PCR技术与高分辨率的毛细管电泳分离技术相结合的方式，从而实现对啤酒生产过程多种常见污染菌进行高通量、半定量的扫描式检测。
为解决上述问题，本发明采取的技术方案如下：
由于啤酒中主要的污染微生物是带有抗酒花基因的乳酸菌，本发明针对表1所述9种常见污染菌进行扫描式检测。
一种集成检测9种啤酒污染菌的方法，采用9重PCR一次性同时扩增9种污染菌短乳杆菌Lactobacillus brevis、干酪乳杆菌Lactobacillus casei、乳酸杆菌Lactobacillus coryniformi、植物乳杆菌Lactobacillus plantarum、类丘状乳杆菌Lactobacillus paracollinoides、林氏乳杆菌Lactobacillus lindneri、有害片球菌Pediococcus damnosus、意外片球菌Pediococcus inopinatus、克氏片球菌Pediococcus clausenii，再通过毛细管电泳分离所述9重PCR的扩增产物，所述9重PCR反应中应用引物SEQIDNO.1-18。
本发明一种集成检测9种啤酒污染菌的方法，所述方法具体步骤如下：
（1）啤酒污染菌的培养及DNA模板提取：
将检测样品在厌氧环境中26℃静置过夜富集培养；取培养液离心收集细胞沉淀；加入50mM EDTA480ul再加入10mg/ml溶菌酶120ul，37℃孵育60min，13,000×g离心2min，移去上清液，之后采用试剂盒提取啤酒污染菌的DNA模板；
（2）多重PCR扩增
PCR引物体系用于9种常见啤酒污染菌的定性检测，由于乳酸菌在16SrDNA序列的高度保守性，因此本发明在各菌种此区域设计种内特异性引物，所用引物体系为表1所述的SEQ ID NO.1-18，20ul PCR反应体系：200nM正向混 合引物2ul，200nM反向混合引物2ul，25mM的MgCl24ul，5×PCR Buffer 4ul，5U/ul的Taq聚合酶0.7ul，DNA模板1ul，补足双蒸水使总体积为20ul；95℃预变性10min；以94℃ 30s；58℃ 30s；70℃ 1min为1个循环，共进行35个循环；4℃保温；
表1本发明设计的用于啤酒污染菌鉴定到种的9重引物体系各引物序列
（3）毛细管电泳分离条件
分离体系：1ul所述步骤（2）中所得的扩增产物与95%去离子甲酰胺38.5ul，400bp DNA Marker 0.5ul混合均匀；在50℃、6.0KV电压下，分离35min；
（4）检测鉴定
所述步骤（2）中所得的扩增产物经过毛细管电泳分离时，通过多重基因表达遗传分析系统自动检索、收集样品中荧光信号，所述9种啤酒污染菌的片段长度190bp、345bp、172bp、213bp、288bp、133bp、310bp、231bp、272bp相应位置分别得到短乳杆菌Lactobacillus brevis、干酪乳杆菌Lactobacillus casei、乳酸杆菌Lactobacillus coryniformi、植物乳杆菌Lactobacillus plantarum、类丘状乳杆菌Lactobacillus paracollinoides、林氏乳杆菌Lactobacillus lindneri、有害片球菌Pediococcus damnosus、意外片球菌Pediococcus inopinatus、克氏片球菌Pediococcus clausenii，的特征峰；
表2 9种污染菌特征峰位置
（5）半定量分析
通过多重基因表达遗传分析系统自动对所述步骤（4）中特征峰的峰面积积分得到PK值，所述的PK值与菌悬液浓度的对数值绘制标准曲线，对污染菌的数量进行半定量分析。
优选的，所述步骤（5）中的菌悬液浓度为101～105CFU/mL。
本发明的有益效果：与现有技术相比本发明具有如下特点：
其一，本发明克服传统的检测方法的特异性不高、灵敏度低、操作繁琐、耗时等问题，具有较高的检测特异性和灵敏度，操作简单，检测时间由原7-14 天缩短到8h，且能够对污染菌鉴定到种；
其二，本发明相对于目前其他以PCR技术为基础的分子生物学检测手段，能够在一次反应中高通量的集成检测9种啤酒常见污染菌，节约了检测成本，节省了检测时间；
其三，本发明可以根据污染菌的特征峰面积对污染菌的数量进行半定量分析，确定污染程度；
因此，本发明可以实现对啤酒生产过程9种污染菌进行高通量、半定量的扫描式检测，在啤酒污染菌的检测、溯源方面具有重要的意义。
附图说明
图1为本发明的实例1的9重PCR-毛细管电泳谱图；
图2为本发明的实施例2中菌浓为101cfu时9重PCR-毛细管电泳谱图；
图3为本发明的实施例2中菌浓为102cfu时9重PCR-毛细管电泳谱图；
图4为本发明的实施例2中菌浓为103cfu时9重PCR-毛细管电泳谱图；
图5为本发明的实施例2中菌浓为104cfu时9重PCR-毛细管电泳谱图；
图6为本发明的实施例2中菌浓为105cfu时9重PCR-毛细管电泳谱图；
图7为不同菌浓度的Log值与PK值的对应关系的标准曲线图；
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细描述。
实施例1
（1）啤酒污染菌的培养及DNA模板提取：
取某啤酒厂生产车间成品酒1瓶，在无菌室植入Lac.brevis、Lac.casei、Lac.coryniformis、Lac.plantarum、Lac.paracollinoides、Lac.lindneri、Ped. damnosus、Ped.inopinatus、Ped.claussenii菌株，使用MRS肉汤培养基对啤酒及啤酒生产过程样品在厌氧环境中26℃静置过夜富集培养；取1ml培养液收集于1.5ml离心管中，13,000×g离心2min，收集细胞沉淀，移去上清液；加入480ul的50mM EDTA彻底重悬细胞；加入120ul的10mg/ml溶酶菌，37℃孵育60min，13,000×g离心2min，移去上清液。之后按照普洛麦格公司的Genomic DNA Purification Kit试剂盒的使用说明提取啤酒污染菌的DNA模板，并使用紫外分光光度计在260nm波长条件下测定提取的DNA质量，将DNA溶液稀释至250ng/ul，-20℃保存备用。
（2）多重PCR扩增
使用9重PCR反应体系，所用引物体系为表1所述的SEQ ID NO.1-18，20ulPCR反应体系：200nM正向混合引物2ul，200nM反向混合引物2ul，25mM的MgCl24ul，5×PCR Buffer 4ul，5U/ul的Taq聚合酶0.7ul，DNA模板1ul，补足双蒸水使总体积为20ul；95℃预变性10min；以94℃ 30s；58℃ 30s；70℃ 1min为1个循环，共进行35个循环；4℃保温；
表1本发明设计的用于啤酒污染菌鉴定到种的9重引物体系各引物序列
（3）毛细管电泳分离条件
分离体系：1ul所述步骤（2）中所得的扩增产物与95%去离子甲酰胺38.5ul，400bp DNA Marker 0.5ul混合均匀；分离条件：在50℃、6.0KV电压下，分离35min；
（4）数据分析
使用贝克曼库尔特的GenomeLab GeXP Genetic Analysis System分析系统自动对分离结果进行分析，结果如下图1所示：检测过程酒体对检测结果没有影响，使用本发明在一次反应，能够捕捉到样品中所添加的9种污染菌的特征峰。
实施例2
取某啤酒厂生产车间成品酒1瓶，在无菌室植入105CFU/mL浓度的干酪乳杆菌Lac.casei菌株，并使用同样酒基对该菌悬液进行梯度稀释，稀释成104CFU/mL、103CFU/mL、102CFU/mL、101CFU/mL的浓度，取1ml培养液收集于1.5ml离心管中，13,000×g离心2min，收集细胞沉淀，移去上清液；加入480ul50mMEDTA彻底重悬细胞；加入120ul的10mg/ml溶酶菌，37℃孵育60min，13,000×g离心2min，移去上清液。之后按照普洛麦格公司 
Genomic DNA Purification Kit试剂盒的使用说明提取啤酒污染菌的DNA模板，多重PCR反应体系使用
DNA Polymerase DNA试剂盒，使用9重PCR反应体系，所用引物体系为表1所述的SEQ ID NO.1-18，20ulPCR反应体系：200nM正向混合引物2ul，200nM反向混合引物2ul，25mM的MgCl24ul，5×PCR缓冲液4ul，5U/ul的Taq聚合酶0.7ul，DNA模板1ul，补足双蒸水使总体积为20ul；95℃预变性10min；以94℃ 30s；58℃ 30s；70℃ 1min为1个循环，共进行35个循环；4℃保温；毛细管电泳分离条件：采用分离体系：1ul上述多重PCR扩增产物与95%去离子甲酰胺38.5ul，400bp DNA Marker0.5ul混合均匀；分离条件：在50℃、6.0KV电压下，分离35min，得到Lac.casei在不同菌浓下的多重PCR-毛细管电泳谱图，结果如下图2-6所示，在菌浓为 105CFU/mL、104CFU/mL、103CFU/mL、102CFU/mL、101CFU/mL时的多重PCR-毛细管电泳谱图。
使用贝克曼库尔特公司的GenomeLab GeXP Genetic Analysis System分析系统自动对以上结果进行峰面积积分，结果如下表3所示：
表3不同浓度的菌悬液多重PCR-毛细管电泳定量分析结果
将不同菌悬液浓度的对数值与PK值进行线性分析，结果如图7所示，由以上数据可以看出，使用本发明所开发的啤酒中污染微生物多重PCR-毛细管电泳分离检测技术可以对菌悬液浓度在101～105范围内的污染菌进行半定量的分析。
实施例3
挑取Lac.casei菌株单个菌落加入10mL成品啤酒液中，制成菌悬液，并使用成品酒液对菌悬液进行5次10倍稀释，取1mL最终稀释液在MRS-琼脂培养基上进行涂布，26℃厌氧培养7天后，对培养后菌落进行计数作为实验对照，培养结果见表4；另取1mL最终稀释液加入1.5ml离心管中，13,000×g离心2min，收集细胞沉淀，移去上清液；加入480ul 50mM EDTA彻底 重悬细胞；加入120ul的10mg/ml溶酶菌，37℃孵育60min，13,000×g离心2min，移去上清液。之后按照普洛麦格公司
Genomic DNA Purification Kit试剂盒的使用说明提取啤酒污染菌的DNA模板，多重PCR反应体系使用
DNA Polymerase DNA试剂盒，使用9重PCR反应体系，所用引物体系为表1所述的SEQ ID NO.1-18，20ulPCR反应体系：200nM正向混合引物2ul，200nM反向混合引物2ul，25mM的MgCl24ul，5×PCR缓冲液4ul，5U/ul的Taq聚合酶0.7ul，DNA模板1ul，补足双蒸水使总体积为20ul；95℃预变性10min；以94℃ 30s；58℃ 30s；70℃ 1min为1个循环，共进行35个循环；4℃保温；毛细管电泳分离条件：采用分离体系：1ul上述多重PCR扩增产物与95%去离子甲酰胺38.5ul，400bp DNAMarker 0.5ul混合均匀；分离条件：在50℃、6.0KV电压下，分离35min，使用贝克曼库尔特公司的GenomeLab GeXP Genetic Analysis System分析系统自动对以上结果进行峰面积积分，得到PK值24635rfuxmm，将所得到的PK值作为y值带入菌浓的Log值与PK值的对应方程式y=69368x-77461中，得到x值为1.42，即菌悬液中含菌量的对数值为101.42，即可得到菌悬液中含菌量为26CFU，由此可见该方法检测结果能够在数量级上与培养法检测结果保持一致，可对检测结果进行半定量分析。
表4两种检测结果
实施例4
由于啤酒中主要的污染微生物是带有抗酒花基因的乳酸菌，本发明可以首先针对表1所述9种常见污染菌，按照实施例1-3中的检测方法进行扫描式检测，98%以上的啤酒中的污染菌为该9种常见污染菌，若未检测出以上9种常见污染菌，为了进一步快速确定啤酒中是否存在污染菌，则可以采用3重PCR同时扩增3个抗酒花基因horA、horB、horC对样品进行进一步分析，若能检测出其中任一种抗酒花基因，则说明样品中含有未知的具有啤酒污染能力的啤酒污染菌，可以更全面、及时的发现啤酒中有害菌，实现有效的监测及预防作用。
9重PCR的检测方法如实施例1-3所述，3重PCR的检测方法如下，
（1）啤酒污染菌的培养及DNA模板提取：
当通过9重PCR检测未检测出所述9中常见污染菌时，将该检测样品在厌氧环境中26℃静置过夜富集培养；取培养液离心收集细胞沉淀；加入50mMEDTA480ul再加入10mg/ml溶菌酶120ul，37℃孵育60min，13,000×g离心2min，移去上清液，之后采用试剂盒提取啤酒污染菌的DNA模板；
（2）多重PCR扩增：
所用引物体系为表5所述应用引物，20ulPCR反应体系：100nM正向混合引物2ul，100nM反向混合引物2ul，25mM的MgCl24ul，5×PCR Buffer 4ul，5U/ul的Taq聚合酶0.7ul，DNA模板1ul，补足双蒸水使总体积为20ul；95℃预变性10min；以94℃ 30s；58℃ 30s；70℃ 1min为1个循环，共进行35个循环；4℃保温；
表5用于抗酒花基因检测的3重引物体系各引物序列
（3）毛细管电泳分离条件：
分离体系：1ul所述步骤（2）中所得的扩增产物与95%去离子甲酰胺38.5ul，400bp DNA Marker0.5ul混合均匀；分离条件：在50℃、6.0KV电压下，分离35min；
（4）检测鉴定：
所述步骤（2）中所得的扩增产物经过毛细管电泳分离时，通过多重基因表达遗传分析系统自动检索、收集样品中荧光信号，3个抗酒花基因的片段长度为247bp、302bp、362bp相应位置分别得到horA、horB、horC的特征峰。
若能检测出其中任一种抗酒花基因，则说明样品中含有除所述9种常见污染菌的未知具有啤酒污染能力的啤酒污染菌，可以通过平板培养、基因测序等方法进一步确定未知菌的名称。
序列表
<110>青岛啤酒股份有限公司
<120>一种集成检测9种啤酒污染菌的方法
<160>18
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>37
<212>引物
<213>Lactobacillus brevis
<400>1
aggtgacact atagaataag cttccgttga atgacgt 37
<210>2
<211>39
<212>引物
<213>Lactobacillus brevis
<400>2
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<210>3
<211>38
<212>引物
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<400>3
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<211>39
<212>引物
<213>Lactobacillus casei
<400>4
gtacgactca ctatagggat aaggttcttc gcgttgctt 39
<210>5
<211>38
<212>引物
<213>Lactobacillus coryniformi
<400>5
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<210>6
<211>40
<212>引物
<213>Lactobacillus coryniformi
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<210>7
<211>38
<212>引物
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<400>7
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<211>39
<212>引物
<213>Lactobacillus plantarum
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<211>38
<212>引物
<213>Lactobacillus paracollinoides
<400>9
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<210>10
<211>39
<212>引物
<213>Lactobacillus paracollinoides
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<211>38
<212>引物
<213>Lactobacillus lindneri
<400>11
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<211>39
<212>引物
<213>Lactobacillus lindneri
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<211>38
<212>引物
<213>Pediococcus damnosus
<400>13
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<212>引物
<213>Pediococcus damnosus
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<211>38
<212>引物
<213>Pediococcus clausenii
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<212>引物
<213>Pediococcus clausenii
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序列表
<110> 青岛啤酒股份有限公司
<120> 一种集成检测9种啤酒污染菌的方法
<160> 18
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 37
<212> 引物
<213>Lactobacillus brevis
<400>1
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<210> 2
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<212> 引物
<213>Lactobacillus brevis
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<212> 引物
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<212> 引物
<213>Lactobacillus casei
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<212> 引物
<213>Lactobacillus coryniformi
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<212> 引物
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<212> 引物
<213>Lactobacillus plantarum
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<212> 引物
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<212> 引物
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<212> 引物
<213>Pediococcusclausenii
<400>17
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<212> 引物
<213>Pediococcus clausenii
<400>18
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Claims (3)
1.一种集成检测9种啤酒污染菌的方法，其特征在于，采用9重PCR一次性同时扩增9种污染菌短乳杆菌Lactobacillus brevis、干酪乳杆菌Lactobacilluscasei、乳酸杆菌Lactobacillus coryniformi、植物乳杆菌Lactobacillus plantarum、类丘状乳杆菌Lactobacillus paracollinoides、林氏乳杆菌Lactobacillus lindneri、有害片球菌Pediococcus damnosus、意外片球菌Pediococcus inopinatus、克氏片球菌Pediococcus clausenii，再通过毛细管电泳分离所述9重PCR扩增产物，所述9重PCR反应中应用引物SEQ ID NO.1-18。
2.根据权利要求1所述的集成检测9种啤酒污染菌的方法，其特征在于，所述方法具体步骤如下：
（1）啤酒污染菌的培养及DNA模板提取：
将检测样品加入MRS肉汤培养基中在厌氧环境中26℃静置过夜富集培养；取培养液离心收集细胞沉淀；加入50mM EDTA 480ul再加入10mg/ml溶菌酶120ul，37℃孵育60min，13,000×g离心2min，移去上清液，之后采用试剂盒提取啤酒污染菌的DNA模板；
（2）多重PCR扩增
所述应用引物为SEQ ID NO.1-18，20ulPCR反应体系：200nM正向混合引物2ul，200nM反向混合引物2ul，25mM的MgCl24ul，5×PCR Buffer 4ul，5U/ul的Taq聚合酶0.7ul，DNA模板1ul，补足双蒸水使总体积为20ul；95℃预变性10min；以94℃ 30s；58℃ 30s；70℃ 1min为1个循环，共进行35个循环；4℃保温；
（3）毛细管电泳分离条件
分离体系：1ul所述步骤（2）中所得的扩增产物与95%去离子甲酰胺38.5ul，400bp DNA Marker 0.5ul混合均匀；在50℃、6.0KV电压下，分离35min；
（4）检测鉴定
所述步骤（2）中所得的扩增产物经过毛细管电泳分离时，通过多重基因表达遗传分析系统自动检索、收集样品中荧光信号，所述9种啤酒污染菌的片段长度190bp、345bp、172bp、213bp、288bp、133bp、310bp、231bp、272bp相应位置分别得到污染菌短乳杆菌Lactobacillus brevis、干酪乳杆菌Lactobacilluscasei、乳酸杆菌Lactobacillus coryniformi、植物乳杆菌Lactobacillus plantarum、类丘状乳杆菌Lactobacillus paracollinoides、林氏乳杆菌Lactobacillus lindneri、有害片球菌Pediococcus damnosus、意外片球菌Pediococcus inopinatus、克氏片球菌Pediococcus clausenii的特征峰；
（5）半定量分析
通过多重基因表达遗传分析系统自动对所述步骤（4）中特征峰的峰面积积分得到PK值，所述的PK值与菌悬液浓度的对数值绘制标准曲线，对污染菌的数量进行半定量分析。
3.根据权利要求2所述的集成检测9种啤酒污染菌的方法，其特征在于，所述步骤（5）中的菌悬液浓度为101～105CFU/mL。
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