CN103397092B - 一种啤酒污染菌的快速筛查方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种啤酒污染菌的快速筛查方法，属于啤酒技术领域，采用3重PCR同时扩增3种抗酒花基因horA、horB、horC快速判定是否具有啤酒污染能力的有害菌，通过毛细管电泳分离3重PCR扩增产物，所述多重PCR反应中应用引物SEQIDNO.1-6，本发明不仅快速确定啤酒中是否存在污染菌，实现有效的监测及预防作用；而且检测结果准确，避免假阴性及假阳性的检测结果。
Description
技术领域
本发明属于啤酒技术领域用于啤酒污染菌检测方法，特别涉及一种基于多重PCR技术以及毛细管电泳分离技术，用于啤酒中污染菌快速筛选的方法。
背景技术
啤酒的酿造过程是建立在纯啤酒酵母的发酵和对污染微生物控制的基础上的，啤酒中主要的污染微生物是带有抗酒花基因的乳酸菌，对于此类微生物的检测方式主要分为两类，第一类是基于培养基的传统培养法，国内外大多数啤酒厂采用此类方法，但检测时间长，且只能定量不能定性到种属，因此无法及时指导生产技术人员对啤酒生产过程进行监控；第二类是基于PCR技术的分子生物学检测方法，PCR技术从核酸、基因水平极大地提高了检测效率及灵敏度，能够定性到种、属或一类目标菌，检测快速且定性能力强，因此无论对于成品啤酒质量的监控，或者生产过程问题的溯源排查，PCR技术的应用都具有广阔的前景和深远的意义，但一次反应只能检测一类微生物。
大量实验已证实，大多数啤酒有害的乳酸菌都通过基因的水平转移而获得horA,使hop抗性基因具有跨种属的特性，因此目前国内外主要使用horA引物对大多数啤酒腐败细菌进行PCR检测，但近年也有文献证明，某些缺失horA基因的乳酸菌仍具有啤酒污染能力，进一步验证其质粒中携带了horB或horC，因此使用以上三种抗酒花基因进行联合检测，可以100%检测出所有对啤酒有害的乳酸细菌避免了假阴性检测结果的发生，但目前检测方法多为使用单重PCR对每个抗酒花基因进行逐一检测，检测成本高、耗时费力，且不能一次反应得出检测结果，不利于大量样品的快速检测。
发明内容
本发明针对现有技术的缺陷，克服常规啤酒中污染菌检测技术操作繁琐，费时耗力等不足，提供一种由3对引物组成的引物体系，通过采用高通量的多重PCR技术与高分辨率的毛细管电泳分离技术相结合的方式，从而实现对啤酒生产过程快速确定啤酒中是否存在污染菌的检测。
本发明的技术方案是：
本发明对3种抗酒花基因对样品进行分析，若能检测出其中任一种抗酒花基因，则说明样品中含有具有啤酒污染能力的啤酒污染菌。
一种啤酒污染菌的快速筛查方法，采用3重PCR同时扩增3个抗酒花基因horA、horB、horC，再通过毛细管电泳分离所述3重PCR扩增产物，所述3重PCR反应中应用引物SEQ ID NO.1-6。
本发明的啤酒污染菌的快速筛查方法的方法，所述方法具体步骤如下：
（1）啤酒污染菌的培养及DNA模板提取：
将检测样品在厌氧环境中26℃静置过夜富集培养；取培养液离心收集细胞沉淀；加入50mMEDTA480ul再加入10mg/ml溶菌酶120ul，37℃孵育60min，13,000×g离心2min，移去上清液，之后采用试剂盒提取啤酒污染菌的DNA模板；
（2）多重PCR扩增：
所用引物体系为表1所述的SEQ ID NO.1-6应用引物，20ulPCR反应体系：100nM正向混合引物2ul，100nM反向混合引物2ul，25mM的MgCl24ul，5×PCRBuffer4ul，5U/ul的Taq聚合酶0.7ul，DNA模板1ul，补足双蒸水使总体积为20ul；95℃预变性10min；以94℃ 30s；58℃ 30s；70℃ 1min为1个循环，共进行35个循环；4℃保温；
表1本发明设计的用于抗酒花基因检测的3重引物体系各引物序列
（3）毛细管电泳分离条件：
分离体系：1ul所述步骤（2）中所得的扩增产物与95%去离子甲酰胺38.5ul，400bpDNA Marker0.5ul混合均匀；分离条件：在50℃、6.0KV电压下，分离35min；（4）检测鉴定：
所述步骤（2）中所得的扩增产物经过毛细管电泳分离时，通过多重基因表达遗传分析系统自动检索、收集样品中荧光信号，3个抗酒花基因的片段长度为247bp、302bp、362bp相应位置分别得到horA、horB、horC的特征峰。
表2 3种抗酒花基因特征峰位置
本发明的有益效果是：与现有技术相比本发明具有如下特点：
其一，本发明可在同一PCR管中进行，操作简单，能快速确定啤酒中是否存在污染菌，且检测结果准确，避免传统单一抗酒花基因检测时容易出现假阴性检测结果的现象；
其二，通过分析抗酒花基因确定污染菌株是否存在啤酒污染潜力，及时发现啤酒中有害乳酸菌，实现有效的监测及预防作用；
其三，本发明相对于目前其他以PCR技术为基础的分子生物学检测手段，能够在一次反应中集成检测3种抗酒花基因，节约了检测成本，节省了检测时间，检测时间由原7-14天缩短到8h。
附图说明
图1为本发明具体实施例1的多重PCR-毛细管电泳谱图；
图2为本发明具体实施例2的多重PCR-毛细管电泳谱图。
具体实施方式
本发明的具体实施方式如下：
实施例1：
（1）啤酒污染菌的培养及DNA模板提取：
分别挑取平板培养基上长出的短乳杆菌Lactobacillus brevis、意外片球菌Pediococcus clausenii单菌落加入10mL成品酒液中，混匀，制成菌悬液，取1mL该菌悬液加入1.5ml离心管中，13,000×g离心2min，收集细胞沉淀，移去上清液；加入480ul的50mMEDTA彻底重悬细胞；加入120ul的10mg/ml溶酶菌，37℃孵育60min，13,000×g离心2min，移去上清液。之后按照普洛麦格公司的Genomic DNA Purification Kit试剂盒的使用说明提取啤酒污染菌的DNA模板，并使用紫外分光光度计在260nm波长条件下测定提取的DNA质量，将DNA溶液稀释至250ng/ul，-20℃保存备用。
（2）三重PCR扩增
所用引物体系为表1所述的SEQ ID NO.1-6，20ulPCR反应体系：100nM正向混合引物2ul，100nM反向混合引物2ul，25mM的MgCl24ul，5×PCRBuffer4ul，5U/ul的Taq聚合酶0.7ul，DNA模板1ul，补足双蒸水使总体积为20ul；95℃预变性10min；以94℃ 30s；58℃ 30s；70℃ 1min为1个循环，共进行35个循环；4℃保温；
（3）毛细管电泳分离条件
分离体系：1ul所述步骤（2）中所得的扩增产物与95%去离子甲酰胺38.5ul，400bpDNA Marker0.5ul混合均匀；分离条件：在50℃、6.0KV电压下，分离35min；
（4）数据分析
使用贝克曼库尔特的GenomeLabGeXP Genetic Analysis System分析系统自动对分离结果进行分析，结果图1所示。
其中，短乳杆菌Lactobacillus brevis、意外片球菌Pediococcus clausenii为常见的啤酒污染菌。图1所示，3种抗酒花基因均被检出，检测过程酒体对检测结果没有影响，使用本发明在一次反应，能够捕捉到样品中3种抗酒花基因的特征峰。
实施例2：
取某啤酒厂生产车间500mL生酒1瓶，使用孔径为0.45μm的滤膜分2次进行过滤，每次使用1片滤膜过滤250mL，对一片滤膜使用啤酒有害菌检测培养基MRS-琼脂在26℃，经7天厌氧培养后检测得到4个菌落，并以此作为实验对照；对另一片滤膜，使用1mL无菌水进行震荡洗涤，收集洗涤液加入1.5ml离心管中，13,000×g离心2min，收集细胞沉淀，移去上清液；加入480ul50mMEDTA彻底重悬细胞；加入120ul的10mg/ml溶酶菌，37℃孵育60min，13,000×g离心2min，移去上清液。之后按照普洛麦格公司Genomic DNA Purification Kit试剂盒的使用说明提取啤酒污染菌的DNA模板，多重PCR反应体系使用Thermo-DNA Polymerase DNA试剂盒，使用3重PCR反应体系，所用引物体系为表1所述的SEQ ID NO.1-6，20ulPCR反应体系：100nM正向混合引物2ul，100nM反向混合引物2ul，25mM的MgCl24ul，5×PCR缓冲液4ul，5U/ul的Taq聚合酶0.7ul，DNA模板1ul，补足双蒸水使总体积为20ul；95℃预变性10min；以94℃ 30s；58℃ 30s；70℃ 1min为1个循环，共进行35个循环；4℃保温；毛细管电泳分离条件：采用分离体系：1ul上述多重PCR扩增产物与95%去离子甲酰胺38.5ul，400bpDNA Marker0.5ul混合均匀；分离条件：在50℃、6.0KV电压下，分离35min，使用贝克曼库尔特的GenomeLabGeXP Genetic Analysis System分析系统自动对分离结果进行分析，得到多重PCR-毛细管电泳谱图，结果如图2所示，检测出horA抗酒花基因的特征峰，说明样品中含有具有啤酒污染能力的啤酒污染菌，且与对照培养实验结果相吻合。
实施例3：
本发明也可以有一个前置的检测步骤，本发明的检测方法用于在前置检测的9重PCR-毛细管电泳检测方法，未检出9种常见污染菌短乳杆菌Lactobacillus brevis、干酪乳杆菌Lactobacillus casei、乳酸杆菌Lactobacilluscoryniformi、植物乳杆菌Lactobacillus plantarum、类丘状乳杆菌Lactobacillusparacollinoides、林氏乳杆菌Lactobacillus lindneri、有害片球菌Pediococcusdamnosus、意外片球菌Pediococcus inopinatus、克氏片球菌Pediococcusclausenii的情况下，进行的补充步骤，进一步快速确定啤酒中是否存在污染菌。本发明的操作步骤如实施例1或2所述。
所述9重PCR-毛细管电泳检测方法的具体步骤如下：
（1）啤酒污染菌的培养及DNA模板提取：
将检测样品在厌氧环境中26℃静置过夜富集培养；取培养液离心收集细胞沉淀；加入50mMEDTA480ul再加入10mg/ml溶菌酶120ul，37℃孵育60min，13,000×g离心2min，移去上清液，之后采用试剂盒提取啤酒污染菌的DNA模板；
（2）多重PCR扩增
PCR引物体系用于9种常见啤酒污染菌的定性检测，由于乳酸菌在16SrDNA序列的高度保守性，因此本发明在各菌种此区域设计种内特异性引物，所用引物体系为表1所述的SEQ ID NO.1-18，20ulPCR反应体系：200nM正向混合引物2ul，200nM反向混合引物2ul，25mM的MgCl24ul，5×PCR Buffer 4ul，5U/ul的Taq聚合酶0.7ul，DNA模板1ul，补足双蒸水使总体积为20ul；95℃预变性10min；以94℃ 30s；58℃ 30s；70℃ 1min为1个循环，共进行35个循环；4℃保温；
表3本发明设计的用于啤酒污染菌鉴定到种的9重引物体系各引物序列
（3）毛细管电泳分离条件
分离体系：1ul所述步骤（2）中所得的扩增产物与95%去离子甲酰胺38.5ul，400bpDNA Marker0.5ul混合均匀；在50℃、6.0KV电压下，分离35min；
（4）检测鉴定
所述步骤（2）中所得的扩增产物经过毛细管电泳分离时，通过多重基因表达遗传分析系统自动检索、收集样品中荧光信号，所述9种啤酒污染菌的片段长度190bp、345bp、172bp、213bp、288bp、133bp、310bp、231bp、272bp相应位置分别得到短乳杆菌Lactobacillus brevis、干酪乳杆菌Lactobacillus casei、乳酸杆菌Lactobacillus coryniformi、植物乳杆菌Lactobacillus plantarum、类丘状乳杆菌Lactobacillus paracollinoides、林氏乳杆菌Lactobacillus lindneri、有害片球菌Pediococcus damnosus、意外片球菌Pediococcus inopinatus、克氏片球菌Pediococcus clausenii，的特征峰。
序列表
<110> 青岛啤酒股份有限公司
<120> 一种啤酒污染菌的快速筛查方法
<160> 6
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 37
<212> 引物
<213>horA
<400>1
aggtgacact atagaataat tgcaaactca tgaagaa 37
<210> 2
<211> 39
<212> 引物
<213> horA
<400>2
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<210> 3
<211> 38
<212> 引物
<213>horB
<400>3
aggtgacact atagaatatc aggtttttcc tccagcat 38
<210> 4
<211> 39
<212> 引物
<213>horB
<400>4
gtacgactca ctatagggac gcgaaaatga ttcaggatt 39
<210> 5
<211> 38
<212> 引物
<213>horC
<400>5
aggtgacact atagaatatg gctaatcaca cataaaag 38
<210>6
<211> 39
<212> 引物
<213>horC
<400>6
gtacgactca ctatagggaa ctactggagt gctgaaaat 39
Claims (2)
1.一种啤酒污染菌的快速筛查方法，其特征在于，采用3重PCR同时扩增3个抗酒花基因horA、 horB、 horC，再通过毛细管电泳分离所述3重PCR扩增产物，所述3重PCR反应中应用引物SEQ ID NO.1-6。
2.根据权利要求1所述的啤酒污染菌的快速筛查方法，其特征在于，所述方法具体步骤如下：
（1）啤酒污染菌的培养及DNA模板提取：
将检测样品在厌氧环境中26℃静置过夜富集培养；取培养液离心收集细胞沉淀；加入50mM EDTA 480μl再加入10mg/ml溶菌酶120μl，37℃孵育60min，13,000×g 离心2min，移去上清液，之后采用试剂盒提取啤酒污染菌的DNA模板；
（2）多重PCR扩增
所述的应用引物为SEQ ID NO.1-6，20μl PCR反应体系：100nM正向混合引物2μl，100nM反向混合引物2μl，25mM的MgCl2 4μl，5×PCR Buffer 4μl，5U/μl的Taq聚合酶 0.7μl，DNA模板 1μl，补足双蒸水使总体积为20μl；95℃预变性 10min；以94℃ 30s；58℃ 30s；70℃ 1min为1个循环，共进行35个循环；4℃保温；
（3）毛细管电泳分离条件
分离体系：1μl所述步骤（2）中所得的扩增产物与95%去离子甲酰胺38.5μl，400bp DNA Marker0.5μl混合均匀；分离条件：在50℃、6.0KV电压下，分离35min；
（4）检测鉴定
所述步骤（2）中所得的扩增产物经过毛细管电泳分离时，通过多重基因表达遗传分析系统自动检索、收集样品中荧光信号，3个抗酒花基因的片段长度为247bp、302bp、362bp相应位置分别得到horA、 horB、 horC的特征峰。
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