CN105316413B - 一种可同时检测果汁饮料中四种污染菌的基因快速筛查方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种可同时检测果汁饮料中污染菌的基因快速筛查方法。该方法包括果汁饮料污染菌的培养及DNA模板提取，然后通过采用高通量的多重PCR技术与高分辨率的毛细管电泳分离技术相结合的方式，从而实现检测样品中是否含有具有果汁饮料污染能力的污染菌。本发明相对于目前其他以PCR技术为基础的分子生物学检测手段，能够在一次反应中集成检测4种果汁饮料污染菌，节约了检测成本，节省了检测时间，检测时间由原7～14天缩短到8h。
Description
技术领域
本发明属于果汁饮料中污染菌检测方法，特别是一种基于多重PCR技术以及毛细管电泳分离技术，涉及一种可同时检测果汁饮料中四种污染菌的基因快速筛查方法，用于几种常见果汁饮料中污染菌的基因快速筛选方法。
背景技术
果汁是人们生活中喜爱的液体饮料之一，是以水果为原料经过物理方法如压榨、离心、萃取等得到的汁液产品。果汁饮料，尤其是纯果汁里富含身体必需的维生素和微量元素。随着消费者的健康意识增强，果汁饮料的消费量日益增加。
果汁饮料生产加工过程中可能会污染一些病原微生物，在运输和储存中，暴露于非冷藏环境会加剧污染菌的增殖，从而造成异味物质和引起果汁饮料浑浊，从而引起果汁饮料变质，危害消费者的健康。如何能够快速、有效的检测果汁饮料中是否存在污染菌成为本领域亟待解决的问题。
对于果汁饮料中微生物的检测方式主要分为两类，第一类是基于培养基的传统培养法，国内外大多数果汁饮料厂采用此类方法，但检测时间长，且只能定量不能定性到种属，因此无法及时指导生产技术人员对果汁饮料生产过程进行监控；第二类是基于PCR技术的分子生物学检测方法，PCR技术从核酸、基因水平极大地提高了检测效率及灵敏度，能够定性到种、属或一类目标菌，检测快速且定性能力强，因此无论对于成品果汁饮料质量的监控，或者生产过程问题的溯源排查，PCR技术的应用都具有广阔的前景和深远的意义，但一次反应只能检测一类微生物。
大量实验已证实，几种果汁饮料污染菌桔青霉Penicillium citrinum、酿酒酵母Saccharomyces cereviseae、酵母菌Dekera naardenensis、黑曲霉Aspergillus niger，可经受果汁巴氏杀菌过程而存活，从而对高温消毒处理后的果汁仍能造成危害。这几种污染菌的鉴别是一项较复杂的工作，这些微生物需要较长的培养孵育时间，检测过程复杂，因而有必要进行更快速的检测方法。但目前检测方法多为培养基的传统培养法，或者使用单重PCR对每个有害菌进行逐一检测，检测成本高、耗时费力，且不能一次反应得出检测结果，不利于大量样品的快速检测。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的缺陷，克服果汁饮料中几种污染菌检测技术操作繁琐，费时耗力等不足，提供一种由4对引物组成的引物体系，通过采用高通量的多重PCR技术与高分辨率的毛细管电泳分离技术相结合的方式，从而实现对果汁饮料中是否存在污染菌污染的检测。
本发明的技术方案是：
本发明针对4种污染菌对样品进行分析，若能检测出其中任一种污染菌，则说明样品中含有具有果汁饮料污染能力的污染菌。
一种果汁饮料污染菌的快速筛查方法，采用4重PCR同时扩增4种污染菌的基因，再通过毛细管电泳分离所述4重PCR扩增产物，所述4重PCR反应中应用引物SEQ ID NO.1-8。
本发明方法具体如下：
步骤(1)、果汁饮料污染菌的培养及DNA模板提取：
将检测样品在无氧环境中26℃静置过夜富集培养；通过真空泵过滤收集细胞沉淀于滤膜上；将滤膜转移至反应试管，加入50mM EDTA 480ul再加入10mg/ml溶菌酶120ul，37℃孵育60min，13,000×g离心2min，移去上清液，之后采用试剂盒提取果汁饮料污染菌的DNA模板；
步骤(2)、多重PCR扩增：
将多重PCR扩增反应体系振荡混匀后，进行多重PCR扩增,得到扩增产物；
所述的多重PCR扩增反应体系为20ul由100nM正向混合引物2ul，100nM反向混合引物2ul，25mM的MgCl24ul，5×PCRBuffer4ul，5U/ul的Taq聚合酶0.7ul，DNA模板1ul，余量的双蒸水组成；其中正向混合引物中SEQ ID NO.1引物、SEQ ID NO.3引物、SEQ ID NO.5、SEQID NO.7引物的浓度比为1:1:1:1，反向混合引物中SEQ ID NO.2引物、SEQ ID NO.4引物、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8引物的浓度比为1:1:1:1；
所述的多重PCR扩增反应的条件是95℃预变性10min；以94℃30s；58℃30s；70℃1min为1个循环，共进行35个循环；4℃保温；
表1本发明用于污染菌的基因检测的4重引物体系各引物序列
步骤(3)、毛细管电泳分离条件：
分离体系：1ul所述步骤(2)中所得的扩增产物与体积含量为95％去离子甲酰胺38.5ul，400bpDNA Marker0.5ul混合均匀；
分离条件：在50℃、6.0KV电压下，分离35min；
步骤(4)、检测鉴定：
步骤(2)中所得的扩增产物经过毛细管电泳分离时，通过多重基因表达遗传分析系统自动检索、收集样品中荧光信号判断是否在基因片段长度为160bp、192bp、201bp、247bp相应位置处出现特征峰；若在160bp相应位置处出现特征峰，则判断为该检测样品中含有桔青霉Penicillium citrinum；若在192bp相应位置处出现特征峰，则判断为该检测样品中含有酿酒酵母Saccharomyces cereviseae；若在201bp相应位置处出现特征峰，则判断为该检测样品中含有酵母菌Dekera naardenensis；若在247bp相应位置处出现特征峰，则判断为该检测样品中含有黑曲霉Aspergillus niger。
表2果汁饮料污染菌基因特征峰位置
与现有技术相比本发明具有如下特点：
其一，本发明可在同一PCR管中进行，操作简单，能快速确定果汁饮料中是否存在污染菌，且检测结果准确；
其二，通过分析基因确定桔青霉Penicillium citrinum、酿酒酵母Saccharomycescereviseae、酵母菌Dekera naardenensis、黑曲霉Aspergillus niger在果汁饮料中的微量存在，及时发现果汁饮料中有害菌，实现有效的监测及预防作用；
其三，本发明相对于目前其他以PCR技术为基础的分子生物学检测手段，能够在一次反应中集成检测4种果汁饮料污染菌，节约了检测成本，节省了检测时间，检测时间由原7～14天缩短到8h。
附图说明
图1为本发明具体实施例1的多重PCR-毛细管电泳谱图；
图2为本发明具体实施例2的多重PCR-毛细管电泳谱图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明做进一步的分析。
实施例1：
(1)果汁饮料污染菌的培养及DNA模板提取：
挑取平板培养基上长出的桔青霉Penicillium citrinum、酿酒酵母Saccharomyces cereviseae、酵母菌Dekera naardenensis、黑曲霉Aspergillus niger单菌落加入10mL成品苹果汁中，混匀，制成菌悬液；取1mL该菌悬液加入1.5ml离心管中，13,000×g离心2min，收集细胞沉淀，移去上清液；加入480ul的50mMEDTA彻底重悬细胞；加入120ul的10mg/ml溶酶菌，37℃孵育60min，13,000×g离心2min，移去上清液。之后按照Qiagen公司的Genomic DNA Purification Kit试剂盒的使用说明提取果汁饮料污染菌的DNA模板，并使用紫外分光光度计在260nm波长条件下测定提取的DNA质量，将DNA溶液稀释至250ng/ul，-20℃保存备用。
(2)四重PCR扩增
所用引物体系为表1所述的SEQ ID NO.1-8，20ulPCR反应体系：100nM正向8，20ulPCR反应体系：100nM正向混合引物2ul，100nM反向混合引物2ul，25mM的MgCl24ul，5×PCRBuffer4ul，5U/ul的Taq聚合酶0.7ul，DNA模板1ul，补足双蒸水使总体积为20ul；95℃预变性10min；以94℃30s；58℃30s；70℃1min为1个循环，共进行35个循环；4℃保温；(3)毛细管电泳分离条件
分离体系：1ul所述步骤(2)中所得的扩增产物与95％去离子甲酰胺38.5ul，400bpDNA Marker0.5ul混合均匀；分离条件：在50℃、6.0KV电压下，分离35min；
使用贝克曼库尔使用贝克曼库尔特的GenomeLabGeXP Genetic Analysis System分析系统自动对分离结果进行分析，结果图1所示，在基因片段长度为160bp、192bp、201bp、247bp相应位置处均出现特征峰，故四种污染菌基因被检出，认为检测过程果汁对检测结果没有影响，使用本发明能够捕捉到样品中桔青霉Penicillium citrinum、酿酒酵母Saccharomyces cereviseae、酵母菌Dekera naardenensis、黑曲霉Aspergillus niger基因的特征峰。
实施例2：
取某果汁饮料厂生产车间500mL的果汁10瓶，使用孔径为0.45μm的滤膜分2次进行过滤，每次使用1片滤膜过滤250mL；对一片滤膜使用黑曲霉Aspergillus niger检测培养基察氏培养基在26℃，经7天厌氧培养后检测得到18个菌落，并以此作为实验对照；对另一片滤膜，使用1mL无菌水进行震荡洗涤，收集洗涤液加入1.5ml离心管中，13,000×g离心2min，收集细胞沉淀，移去上清液；加入480ul50mMEDTA彻底重悬细胞；加入120ul的10mg/ml溶酶菌，37℃孵育60min，13,000×g离心2min，移去上清液。之后按照Qiagen公司GenomicDNAPurification Kit试剂盒的使用说明提取果汁饮料污染菌的DNA模板。
多重PCR反应体系使用Thermo-DNA Polymerase DNA试剂盒，使用3重PCR反应体系，所用引物体系为表1所述的SEQ ID NO.1-8，20ulPCR反应体系：100nM正向混合引物2ul，100nM反向混合引物2ul，25mM的MgCl24ul，5×PCR缓冲液4ul，5U/ul的Taq聚合酶0.7ul，DNA模板1ul，补足双蒸水使总体积为20ul；95℃预变性10min；以94℃30s；58℃30s；70℃1min为1个循环，共进行35个循环；4℃保温；
毛细管电泳分离条件：采用分离体系：1ul上述多重PCR扩增产物与95％去离子甲酰胺38.5ul，400bpDNA Marker0.5ul混合均匀；分离条件：在50℃、6.0KV电压下，分离35min，使用贝克曼库尔特的GenomeLabGeXP Genetic Analysis System分析系统自动对分离结果进行分析，得到多重PCR-毛细管电泳谱图。结果如图2所示，在247bp相应位置处出现特征峰，则判断检测出黑曲霉Aspergillus niger，说明样品中含有具有果汁饮料污染能力的黑曲霉，且与对照培养实验结果相吻合。
实施例3：
乳酸菌(Lactobacillus)是果汁饮料中另一种常见污染菌。本实例可以证明本发明对桔青霉Penicillium citrinum、酿酒酵母Saccharomyces cereviseae、酵母菌Dekeranaardenensis、黑曲霉Aspergillus niger的检测特异性，即本发明的检测方法在仅乳酸菌(Lactobacillus)存在情况下，未显示特征峰，即说明乳酸菌(Lactobacillus)存在不会对检测产生干扰。
本实例再采用常见污染菌短乳杆菌Lactobacillus brevis、干酪乳杆菌Lactobacillus casei、乳酸杆菌Lactobacillus coryniformi、植物乳杆菌Lactobacillusplantarum作为干扰菌。操作步骤如实施例1或2所述。
(1)污染菌的培养及DNA模板提取：
分别挑取平板培养基上长出的短乳杆菌Lactobacillus brevis、干酪乳杆菌Lactobacillus casei、乳酸杆菌Lactobacillus coryniformi、植物乳杆菌Lactobacillusplantarum单菌落加入10mL成品果汁中，混匀，制成菌悬液；取1mL该菌悬液加入1.5ml离心管中，13,000×g离心2min，收集细胞沉淀，移去上清液；加入480ul的50mMEDTA彻底重悬细胞；加入120ul的10mg/ml溶酶菌，37℃孵育60min，13,000×g离心2min，移去上清液。之后按照Qiagen公司的Genomic DNA Purification Kit试剂盒的使用说明提取污染菌的DNA模板，并使用紫外分光光度计在260nm波长条件下测定提取的DNA质量，将DNA溶液稀释至250ng/ul，-20℃保存备用。
所用引物体系为表1所述的SEQ ID NO.1-8，20ulPCR反应体系：100nM正向混合引物2ul，100nM反向混合引物2ul，25mM的MgCl24ul，5×PCRBuffer4ul，5U/ul的Taq聚合酶0.7ul，DNA模板1ul，补足双蒸水使总体积为20ul；95℃预变性10min；以94℃30s；58℃30s；70℃1min为1个循环，共进行35个循环；4℃保温；
(3)毛细管电泳分离条件
分离体系：1ul所述步骤(2)中所得的扩增产物与95％去离子甲酰胺38.5ul，400bpDNA Marker0.5ul混合均匀；分离条件：在50℃、6.0KV电压下，分离35min；
使用贝克曼库尔特的GenomeLabGeXP Genetic Analysis System分析系统自动对分离结果进行分析，结果显示，没有特征峰出现，即平板培养基上长出的短乳杆菌Lactobacillus brevis、干酪乳杆菌Lactobacillus casei、乳酸杆菌Lactobacilluscoryniformi、植物乳杆菌Lactobacillus plantarum的存在对检测结果均没有影响，不会出现假阳性结果。
上述实施例并非是对于本发明的限制，本发明并非仅限于上述实施例，只要符合本发明要求，均属于本发明的保护范围。
EQUENCE LISTING
<110> 杭州电子科技大学
<120> 一种可同时检测果汁饮料中四种污染菌的基因快速筛查方法
<130> 1
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
tcgatgacac tcagacatcc cacccgtgtt gcccgaacct a 41
<210> 2
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
gtacgactca ctatagggat tgttgaaagt tttaactaat 40
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<211> 38
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 3
tcgatgacac tcagacatca gaacgtcctg ccatacaa 38
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<212> DNA
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gtacgactca ctatagggaa atgaccaact cccatccgta 40
<210> 5
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<212> DNA
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<211> 39
<212> DNA
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<210> 7
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<212> DNA
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<210> 8
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 8
gtacgactca ctatagggag gtctccggcc agtatttagc 40
Claims (5)
1.一种可同时检测果汁饮料中四种污染菌的基因快速筛查方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
步骤(1)、果汁饮料污染菌的培养及DNA模板提取：
将检测样品在无氧环境中26℃静置过夜富集培养；通过真空泵过滤收集细胞沉淀于滤膜上；将滤膜转移至反应试管，加入50mM EDTA 480 μ L 再加入10mg/mL溶菌酶120 μ L ，37℃孵育60min，13,000×g离心2min，移去上清液，之后采用试剂盒提取果汁饮料污染菌的DNA模板；
步骤(2)、多重PCR扩增：
将多重PCR扩增反应体系振荡混匀后，进行多重PCR扩增， 得到扩增产物；
所述的多重PCR扩增反应体系为20 μ L ， 由100nM正向混合引物2 μ L ，100nM反向混合引物2 μ L ，25mM的MgCl2 4 μ L ，5×PCR Buffer 4 μ L ，5U/μ L 的Taq聚合酶0.7 μL ，DNA模板1 μ L ，余量的双蒸水组成；其中引物体系为步骤(1)得到的SEQ ID NO.1～8引物体系；
步骤(3)、对含有上述扩增产物的分离体系进行毛细管电泳分离；
步骤(4)、检测鉴定：
步骤(2)中所得的扩增产物经过毛细管电泳分离时，通过多重基因表达遗传分析系统自动检索、收集样品中荧光信号判断是否在基因片段长度为160bp、192bp、201bp、247bp相应位置处出现特征峰；若在160bp相应位置处出现特征峰，则判断为该检测样品中含有桔青霉(Penicillium citrinum)；若在192bp相应位置处出现特征峰，则判断为该检测样品中含有酿酒酵母(Saccharomyces cereviseae)；若在201bp相应位置处出现特征峰，则判断为该检测样品中含有酵母菌Dekera naardenensis；若在247bp相应位置处出现特征峰，则判断为该检测样品中含有黑曲霉(Aspergillus niger)。
2.如权利要求1所述的一种可同时检测果汁饮料中四种污染菌的基因快速筛查方法，其特征在于步骤(2)正向混合引物中SEQ ID NO.1引物、SEQ ID NO.3引物、SEQ ID NO.5引物、SEQ ID NO.7引物的浓度比为1:1:1:1，反向混合引物中SEQ ID NO.2引物、SEQ ID NO.4引物、SEQ ID NO.6引物、SEQ ID NO.8引物的浓度比为1:1:1:1。
3.如权利要求1所述的一种可同时检测果汁饮料中四种污染菌的基因快速筛查方法，其特征在于步骤(2)所述的多重PCR扩增反应的条件是95℃预变性10min；以94℃30s；58℃30s；70℃1min为1个循环，共进行35个循环；4℃保温。
4.如权利要求1所述的一种可同时检测果汁饮料中四种污染菌的基因快速筛查方法，其特征在于步骤(3)分离体系：1 μ L 所述步骤(2)中所得的扩增产物与体积含量为95％去离子甲酰胺38.5 μ L ，400bp DNA Marker 0.5 μ L 混合均匀。
5.如权利要求1所述的一种可同时检测果汁饮料中四种污染菌的基因快速筛查方法，其特征在于步骤(3)分离条件：在50℃、6.0KV电压下，分离35min。
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Application publication date: 20160210 Assignee: Shaoxing Keqiao Intelligent Agricultural Research Institute Co Ltd Hangzhou University of Electronic Science and technology Assignor: HANGZHOU DIANZI University Contract record no.: X2023980030245 Denomination of invention: A rapid genetic screening method for simultaneous detection of four contaminating bacteria in fruit juice drinks Granted publication date: 20181113 License type: Common License Record date: 20230109 |
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