CN105132561A - 一种能同时鉴定巨型球菌、果胶杆菌、乳酸片球菌三种啤酒污染菌的快速检测方法 - Google Patents

一种能同时鉴定巨型球菌、果胶杆菌、乳酸片球菌三种啤酒污染菌的快速检测方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种能同时鉴定巨型球菌、果胶杆菌、乳酸片球菌三种啤酒污染菌的快速检测方法。该方法包括啤酒污染菌的培养及DNA模板提取，然后通过采用高通量的多重PCR技术与高分辨率的毛细管电泳分离技术相结合的方式，从而实现对啤酒生产过程快速确定啤酒中是否存在污染菌的检测。本发明相对于目前其他以PCR技术为基础的分子生物学检测手段，能够在一次反应中集成检测3种抗酒花基因极度厌氧菌，节约了检测成本，节省了检测时间，检测时间由原7～14天缩短到8h。

Description

一种能同时鉴定巨型球菌、果胶杆菌、乳酸片球菌三种啤酒污染菌的快速检测方法
技术领域
本发明属于啤酒技术领域,用于啤酒污染菌检测方法，特别涉及一种基于多重PCR技术以及毛细管电泳分离技术，用于啤酒中污染菌巨型球菌和果胶杆菌及乳酸片球菌的快速筛选方法。
背景技术
啤酒的酿造过程是建立在纯啤酒酵母的发酵和对污染微生物控制的基础上的，啤酒中主要的污染微生物是乳酸菌(Lactobacillus)，此外，还有巨型球菌(Megasphaera)、果胶杆菌(Pectinatus)和乳酸片球菌Pediococcus)。厌氧菌Megasphaer属巨型球菌、Pectinatus属果胶杆菌和Pediococcus属乳酸片球菌会产生异味物质和引起啤酒浑浊，从而引起啤酒变质。
对于啤酒微生物的检测方式主要分为两类，第一类是基于培养基的传统培养法，国内外大多数啤酒厂采用此类方法，但检测时间长，且只能定量不能定性到种属，因此无法及时指导生产技术人员对啤酒生产过程进行监控；第二类是基于PCR技术的分子生物学检测方法，PCR技术从核酸、基因水平极大地提高了检测效率及灵敏度，能够定性到种、属或一类目标菌，检测快速且定性能力强，因此无论对于成品啤酒质量的监控，或者生产过程问题的溯源排查，PCR技术的应用都具有广阔的前景和深远的意义，但一次反应只能检测一类微生物。
大量实验已证实，对啤酒有害的乳酸菌(Lactobacillus)虽然为厌氧菌，但在有氧条件下仍较容易生长，因此容易培养和检测。巨型球菌(Megasphaera)、果胶杆菌(Pectinatus)和乳酸片球菌(Pediococcus)为极度厌氧菌，鉴别是一项较复杂的工作，这些微生物需要严格的厌氧培养条件和冗长的孵育时间，检测过程复杂，因而有必要进行更快速的检测方法。但目前检测方法多为使用单重PCR对每个有害菌进行逐一检测，检测成本高、耗时费力，且不能一次反应得出检测结果，不利于大量样品的快速检测。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的缺陷，克服常规啤酒中污染菌巨型球菌、果胶杆菌和乳酸片球菌检测技术操作繁琐，费时耗力等不足，提供一种由3对引物组成的引物体系，通过采用高通量的多重PCR技术与高分辨率的毛细管电泳分离技术相结合的方式，从而实现对啤酒生产过程快速确定啤酒中是否存在污染菌的检测。
本发明的技术方案是：
本发明对检测样品进行分析，若能检测出巨型球菌、果胶杆菌、乳酸片球菌三种啤酒污染菌其中任意一种，则说明样品中含有具有啤酒污染能力的啤酒污染菌。
本发明一种啤酒污染菌的快速筛查方法，采用3重PCR同时扩增3种污染菌的基因16srRNA，再通过毛细管电泳分离所述3重PCR扩增产物，所述3重PCR反应中应用引物SEQIDNO.1～6。
本发明的啤酒污染菌的快速筛查方法的方法，所述方法具体步骤如下：
(1)啤酒污染菌的培养及DNA模板提取：
将检测啤酒样品在厌氧环境中26℃静置过夜富集培养；通过真空泵过滤收集细胞沉淀于滤膜上；将滤膜转移至反应试管，加入50mMEDTA480ul再加入10mg/ml溶菌酶120ul，37℃孵育60min，13,000×g离心2min，移去上清液，之后采用试剂盒提取啤酒污染菌的DNA模板；
(2)多重PCR扩增：
将多重PCR扩增反应体系振荡混匀后，进行多重PCR扩增,得到扩增产物；
所用引物体系为表1所述的SEQIDNO.1～6应用引物，所述的多重PCR扩增反应体系为20ul由100nM正向混合引物2ul，100nM反向混合引物2ul，25mM的MgCl24ul，5×PCRBuffer4ul，5U/ul的Taq聚合酶0.7ul，DNA模板1ul，余量的双蒸水组成；其中正向混合引物中SEQIDNO.1引物、SEQIDNO.3引物、SEQIDNO.5引物的浓度比为1:1:1，反向混合引物中SEQIDNO.2引物、SEQIDNO.4引物、SEQIDNO.6引物的浓度比为1:1:1；
所述的多重PCR扩增反应的条件是95℃预变性10min；以94℃变性30s；58℃退火30s；70℃延伸1min为1个循环，共进行35个循环；4℃保温；
表1本发明设计的用于污染菌的16srRNA基因检测的3重引物体系各引物序列
(3)毛细管电泳分离条件：
分离体系：1ul所述步骤(2)中所得的扩增产物与体积含量为95％的去离子甲酰胺38.5ul，400bpDNAMarker0.5ul混合均匀；分离条件：在50℃、6.0KV电压下，分离35min；
(4)检测鉴定：所述步骤(2)中所得的扩增产物经过毛细管电泳分离时，通过多重基因表达遗传分析系统自动检索、收集样品中荧光信号，3个基因的片段长度为161bp、181bp、176bp相应位置分别得到巨型球菌、果胶杆菌和乳酸片球菌的特征峰。
表2巨型球菌、果胶杆菌和乳酸片球菌基因特征峰位置
本发明的有益效果是：与现有技术相比本发明具有如下特点：
其一，本发明可在同一PCR管中进行，操作简单，能快速确定啤酒中是否存在污染菌，且检测结果准确；
其二，通过分析16srRNA基因确定极度厌氧菌巨型球菌(Megasphaera)、果胶杆菌(Pectinatus)和乳酸片球菌(Pediococcus)在啤酒中的微量存在，及时发现啤酒中有害菌，实现有效的监测及预防作用；
其三，本发明相对于目前其他以PCR技术为基础的分子生物学检测手段，能够在一次反应中集成检测3种抗酒花基因极度厌氧菌，节约了检测成本，节省了检测时间，检测时间由原7～14天缩短到8h。
附图说明
图1为本发明具体实施例1的多重PCR-毛细管电泳谱图；
图2为本发明具体实施例2的多重PCR-毛细管电泳谱图。
具体实施方式
下面对本发明做进一步分析。
实施例1：
(1)啤酒污染菌的培养及DNA模板提取：
挑取平板培养基上长出的乳酸片球菌Pediococcusdamnosus单菌落加入10mL成品酒液中，混匀，制成菌悬液；取1mL该菌悬液加入1.5ml离心管中，13,000×g离心2min，收集细胞沉淀，移去上清液；加入480ul的50mMEDTA彻底重悬细胞；加入120ul的10mg/ml溶酶菌，37℃孵育60min，13,000×g离心2min，移去上清液。之后按照Qiagen公司的GenomicDNAPurificationKit试剂盒的使用说明提取啤酒污染菌的DNA模板，并使用紫外分光光度计在260nm波长条件下测定提取的DNA质量，将DNA溶液稀释至250ng/ul，-20℃保存备用。
(2)三重PCR扩增
将多重PCR扩增反应体系振荡混匀后，进行多重PCR扩增,得到扩增产物；
所用引物体系为表1所述的SEQIDNO.1～6，所述的多重PCR扩增反应体系为100nM正向混合引物2ul，100nM反向混合引物2ul，25mM的MgCl24ul，5×PCRBuffer4ul，5U/ul的Taq聚合酶0.7ul，DNA模板1ul，补足双蒸水使总体积为20ul；
所述的多重PCR扩增反应的条件是95℃预变性10min；以94℃30s，58℃30s，70℃1min为1个循环，共进行35个循环；4℃保温；
(3)毛细管电泳分离条件
分离体系：1ul所述步骤(2)中所得的扩增产物与95％去离子甲酰胺38.5ul，400bpDNAMarker0.5ul混合均匀；
分离条件：在50℃、6.0KV电压下，分离35min；
(4)数据分析
使用贝克曼库尔特的GenomeLabGeXPGeneticAnalysisSystem分析系统自动对分离结果进行分析，结果图1所示，乳酸片球菌Pediococcusdamnosus基因被检出，检测过程酒体对检测结果没有影响，使用本发明能够捕捉到样品中Pediococcusdamnosus16srRNA基因的特征峰。
实施例2：
(1)啤酒污染菌的培养及DNA模板提取：
取某啤酒厂生产车间500mL生酒10瓶，使用孔径为0.45μm的滤膜分2次进行过滤，每次使用1片滤膜过滤250mL，对一片滤膜使用啤酒有害菌检测培养基MRS-琼脂在26℃，经7天厌氧培养后检测得到21个菌落，并以此作为实验对照；对另一片滤膜，使用1mL无菌水进行震荡洗涤，收集洗涤液加入1.5ml离心管中，13,000×g离心2min，收集细胞沉淀，移去上清液；加入480ul50mMEDTA彻底重悬细胞；加入120ul的10mg/ml溶酶菌，37℃孵育60min，13,000×g离心2min，移去上清液。之后按照Qiagen公司GenomicDNAPurificationKit试剂盒的使用说明提取啤酒污染菌的DNA模板；
(2)三重PCR扩增
将多重PCR扩增反应体系振荡混匀后，进行多重PCR扩增,得到扩增产物；
多重PCR反应体系使用Thermo-DNAPolymeraseDNA试剂盒，使用3重PCR反应体系，所用引物体系为表1所述的SEQIDNO.1-6，所述的多重PCR扩增反应体系为100nM正向混合引物2ul，100nM反向混合引物2ul，25mM的MgCl24ul，5×PCR缓冲液4ul，5U/ul的Taq聚合酶0.7ul，DNA模板1ul，补足双蒸水使总体积为20ul；
所述的多重PCR扩增反应的条件是95℃预变性10min；以94℃30s，58℃30s，70℃1min为1个循环，共进行35个循环；4℃保温；
(3)毛细管电泳分离条件
分离体系由1ul上述多重PCR扩增产物与95％去离子甲酰胺38.5ul，400bpDNAMarker0.5ul混合均匀构成；
分离条件：在50℃、6.0KV电压下，分离35min；
(4)数据分析
使用贝克曼库尔特的GenomeLabGeXPGeneticAnalysisSystem分析系统自动对分离结果进行分析，得到多重PCR-毛细管电泳谱图，结果如图2所示，检测出巨型球菌(Megasphaera)、果胶杆菌(Pectinatus)和乳酸片球菌(Pediococcus)16srRNA基因的特征峰，说明样品中含有具有啤酒污染能力的啤酒污染菌，且与对照培养实验结果相吻合。
实施例3：
乳酸菌(Lactobacillus)是啤酒中另一种常见污染菌。本实例可以证明本发明对巨型球菌(Megasphaera)、果胶杆菌(Pectinatus)和乳酸片球菌(Pediococcus)的检测特异性，即本发明的检测方法在仅乳酸菌(Lactobacillus)存在情况下，未显示特征峰，乳酸菌(Lactobacillus)存在不会对检测产生干扰。
本实例采用常见污染菌短乳杆菌Lactobacillusbrevis、干酪乳杆菌Lactobacilluscasei、乳酸杆菌Lactobacilluscoryniformi、植物乳杆菌Lactobacillusplantarum作为干扰菌。
本发明的操作步骤如实施例1或2所述。
(1)啤酒污染菌的培养及DNA模板提取：
分别挑取平板培养基上长出的短乳杆菌Lactobacillusbrevis、干酪乳杆菌Lactobacilluscasei、乳酸杆菌Lactobacilluscoryniformi、植物乳杆菌Lactobacillusplantarum单菌落加入10mL成品酒液中，混匀，制成菌悬液；取1mL该菌悬液加入1.5ml离心管中，13,000×g离心2min，收集细胞沉淀，移去上清液；加入480ul的50mMEDTA彻底重悬细胞；加入120ul的10mg/ml溶酶菌，37℃孵育60min，13,000×g离心2min，移去上清液。之后按照Qiagen公司的GenomicDNAPurificationKit试剂盒的使用说明提取啤酒污染菌的DNA模板，并使用紫外分光光度计在260nm波长条件下测定提取的DNA质量，将DNA溶液稀释至250ng/ul，-20℃保存备用。
(2)三重PCR扩增
将多重PCR扩增反应体系振荡混匀后，进行多重PCR扩增,得到扩增产物；
所用引物体系为表1所述的SEQIDNO.1～6，所述的多重PCR扩增反应体系为100nM正向混合引物2ul，100nM反向混合引物2ul，25mM的MgCl24ul，5×PCRBuffer4ul，5U/ul的Taq聚合酶0.7ul，DNA模板1ul，补足双蒸水使总体积为20ul；
所述的多重PCR扩增反应的条件是95℃预变性10min；以94℃30s，58℃30s，70℃1min为1个循环，共进行35个循环；4℃保温；
(3)毛细管电泳分离条件
分离体系：1ul所述步骤(2)中所得的扩增产物与95％去离子甲酰胺38.5ul，400bpDNAMarker0.5ul混合均匀；
分离条件：在50℃、6.0KV电压下，分离35min；
(4)数据分析
使用贝克曼库尔特的GenomeLabGeXPGeneticAnalysisSystem分析系统自动对分离结果进行分析，结果显示，没有特征峰出现，即乳酸菌(Lactobacillus)的存在对检测结果没有影响，不会出现假阳性结果。
序列表
SEQUENCELISTING
<110>杭州电子科技大学
<120>一种能同时鉴定巨型球菌、果胶杆菌、乳酸片球菌三种啤酒污染菌的快速检
测方法
<130>1
<160>6
<170>PatentInversion3.3
<210>1
<211>36
<212>DNA
<213>人工合成
<400>1
tcgatgacactcagacatacaacagctggaaacggc36
<210>2
<211>42
<212>DNA
<213>人工合成
<400>2
gtacgactcactatagggaccaaccagctaatcagacgcaaa42
<210>3
<211>39
<212>DNA
<213>人工合成
<400>3
tcgatgacactcagacatagtgaatgacggtaccctgtt39
<210>4
<211>38
<212>DNA
<213>人工合成
<400>4
gtacgactcactatagggaccccgcacttttaagatcc38
<210>5
<211>38
<212>DNA
<213>人工合成
<400>5
tcgatgacactcagacattgcttgcaccgaagatgatt38
<210>6
<211>39
<212>DNA
<213>人工合成
<400>6
gtacgactcactatagggataaaccatgcggttcatttt39

Claims (5)

1.一种能同时鉴定巨型球菌、果胶杆菌、乳酸片球菌三种啤酒污染菌的快速检测方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
步骤(1)、啤酒污染菌的培养及DNA模板提取：
将检测啤酒样品在厌氧环境中静置过夜富集培养，过滤收集细胞沉淀；然后在细胞沉淀中依次加入50mMEDTA480ul、10mg/ml溶菌酶120ul，37℃孵育60min，13,000×g离心2min，移去上清液；最后采用试剂盒提取啤酒污染菌的DNA模板；
步骤(2)、多重PCR扩增：
将多重PCR扩增反应体系振荡混匀后，进行多重PCR扩增,得到扩增产物；
所述的多重PCR扩增反应体系为20ul由100nM正向混合引物2ul，100nM反向混合引物2ul，25mM的MgCl24ul，5×PCRBuffer4ul，5U/ul的Taq聚合酶0.7ul，DNA模板1ul，余量的双蒸水组成；其中正向混合引物为SEQIDNO.1、3、5的混合引物，反向混合引物为SEQIDNO.2、4、6的混合引物；
步骤(3)、对含有上述扩增产物的分离体系进行毛细管电泳分离；
步骤(4)、检测鉴定：所述步骤(2)中所得的扩增产物经过毛细管电泳分离时，通过多重基因表达遗传分析系统自动检索、收集样品中荧光信号，判断是否在基因片段长度为161bp、181bp、176bp相应位置处出现特征峰；若在161bp相应位置处出现特征峰，则判断为该检测样品中含有巨型球菌；若在181bp相应位置处出现特征峰，则判断为该检测样品中含有果胶杆菌；若在176bp相应位置处出现特征峰，则判断为该检测样品中含有乳酸片球菌。
2.如权利要求1所述的一种能同时鉴定巨型球菌、果胶杆菌、乳酸片球菌三种啤酒污染菌的快速检测方法，其特征在于步骤(2)所述的多重PCR扩增反应体系中正向混合引物中SEQIDNO.1引物、SEQIDNO.3引物、SEQIDNO.5引物的浓度比为1:1:1，反向混合引物中SEQIDNO.2引物、SEQIDNO.4引物、SEQIDNO.6引物的浓度比为1:1:1。
3.如权利要求1所述的一种能同时鉴定巨型球菌、果胶杆菌、乳酸片球菌三种啤酒污染菌的快速检测方法，其特征在于步骤(2)所述的多重PCR扩增反应的条件是95℃预变性10min；以94℃变性30s；58℃退火30s；70℃延伸1min为1个循环，共进行35个循环；4℃保温。
4.如权利要求1所述的一种能同时鉴定巨型球菌、果胶杆菌、乳酸片球菌三种啤酒污染菌的快速检测方法，其特征在于步骤(3)所述的毛细管电泳分离体系包括1ul步骤(2)所得的扩增产物、体积含量为95％的去离子甲酰胺38.5ul、400bpDNAMarker0.5ul。
5.如权利要求1所述的一种能同时鉴定巨型球菌、果胶杆菌、乳酸片球菌三种啤酒污染菌的快速检测方法，其特征在于步骤(3)所述的毛细管电泳分离条件如下：在50℃、6.0KV电压下，分离35min。
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