CN116004777A - 一种微生物抗生素抗性基因的高通量检测引物组、芯片、试剂盒及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种微生物抗生素抗性基因的高通量检测引物组、芯片、试剂盒及其检测方法。所述引物组含有101对引物序列，其中SEQ ID NO:1和2为一对上下游引物，SEQ ID NO:3和4为一对上下游引物，以此类推至SEQ ID NO:201和202为一对上下游引物。本发明不仅保留了荧光定量PCR检测的高灵敏度和准确度，而且具有芯片检测的高通量反应的优点，降低了检测成本；本发明能够用101对引物同时检测145个抗性基因，有利于环境抗性基因的日常监测和风险评估。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测，尤其涉及一种微生物抗生素抗性基因的高通量检测引物组、芯片、试剂盒及其检测方法。
背景技术
环境中抗生素抗性基因(又简称抗性基因)的主要风险在于其可通过水平基因转移传播到人类病原菌中，形成新的或多重抗性的病原菌，从而影响抗生素疗效，危害人类健康。目前，在自然、工程和临床等多个环境中已检测到多种抗性基因，且在不同环境介质间，抗性基因的丰度存在巨大差异。
常用的荧光定量PCR法由于通量的限制难以实现对多种抗性基因和大量样品的快速检测。鉴于环境样品通常具有复合污染的特征，如需对多种抗性基因进行定量，其所需的工作量较大，耗时较长，成本较高。因此，有必要开发可以同时量化多种抗性基因的高通量定量PCR检测技术，力求实现环境中抗性基因的高效快速检测，从而为准确评估复杂环境样品体系中抗性基因的风险与监管提供有效依据。
发明内容
本发明的目的在于提供一种环境中抗性基因的高通量定量检测方法的引物组，可用于高效、快速和准确地定量微生物抗性基因丰度，具有灵敏度高、特异性强和覆盖范围广等特点。
为实现上述目的，本发明提供一种微生物抗生素抗性基因的高通量检测引物组，其特征在于，所述引物组含有101对引物序列，其中SEQ ID NO:1和2为一对上下游引物，SEQID NO:3和4为一对上下游引物，以此类推至SEQ ID NO:201和202为一对上下游引物。
本发明还提供一种用于微生物抗性基因的高通量定量检测芯片，其特征在于，含有所述的引物组。
进一步，还含有阳性克隆质粒；所述阳性质粒为插入了一个抗性基因的质粒，所述抗性基因为所述引物组扩增得到的任一基因。每一个阳性质粒对应于一个基因。
本发明还提供一种用于微生物抗性基因的高通量定量检测试剂盒，其特征在于，含有所述的引物组。
进一步，还含有阳性克隆质粒；所述阳性质粒为插入了一个抗性基因的质粒，所述抗性基因为所述引物组扩增得到的任一基因。
所述引物组或所述检测芯片或所述检测试剂盒用于检测环境样品中微生物抗性基因的用途。
本发明还提供一种用于微生物抗性基因的高通量定量检测方法，其特征在于，包括如下步骤，
提取待测样品总DNA；
扩增：采用所述引物组或所述检测芯片或所述检测试剂盒对待测样品进行PCR扩增；
结果分析：采用标准质粒外标法对微生物抗性基因的丰度进行绝对定量。
进一步，所述PCR扩增的程序为：95℃预变性10min；随后95℃变性30s，60℃退火延伸30s，40个循环。
本发明根据145个抗性基因，设计了101对引物(见表1)。这145个抗性基因在人类相关环境中抗性基因富集倍数高于100，且位于可移动遗传元件上。表1所示引物序列中SEQID NO:1和2为一对上下游引物，SEQ ID NO:3和4为一对上下游引物，以此类推至SEQ IDNO:201和202为一对上下游引物。
表1引物相关信息表
标注：MLS：macrolide-lincosamide-streptogramin；SEQ ID NO:204中的Y代表cor t/u。
本发明不仅保留了荧光定量PCR检测的高灵敏度和准确度，而且具有芯片检测的高通量反应的优点，降低了检测成本；
本发明采用标准质粒外标法对微生物抗性基因的丰度进行绝对定量，检测准确度高；
本发明能够用101对引物同时检测145个抗性基因，有利于更加全面和准确地评估环境抗性基因的风险。
本发明为表征环境微生物抗性组提供了有利的高通量检测手段，有利于环境抗性基因的日常监测和风险评估。
附图说明
图1是芯片制备中抗性基因引物和对照(16S rRNA)在384孔板中的分配方案图。
图2是实施例1中的标准曲线质粒样品、污水处理厂的DNA样品和作为阴性对照的无菌水在384孔板中的分配方案图。
图3是101对引物的高通量荧光定量的标准曲线图。
图4是连续稀释混合质粒评估101对引物的灵敏度图。
图5是101对引物的扩增效率图。
图6是实施例1中抗性基因绝对丰度总和图。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出，其中自始至终相同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有相同或类似功能的元件。下面通过参考附图描述的实施例是示例性的， 旨在用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1：
现以污水处理厂样品为实施例，对本发明的高通量检测方法做进一步阐述。
1、污水处理厂水体样品描述
水体样品采集于广州白云山制药厂的污水处理厂的高浓度抗生素进水段(INF-H)、低浓度抗生素进水段(INF-L)、好氧池(OT)、厌氧池(AT)和出水段(EFF)这5个部分的污水样品。为排除天气原因对样品的影响，选取采集前后两天都无降雨天气进行采样。
2、样品DNA的提取
采用0.22μm的滤膜对所采集的5种污水样品进行过滤，剪碎滤膜，采用
(MP生物医药，美国)试剂盒提取总DNA。提取的DNA用1％的琼脂糖凝胶进行电泳，检测提取效果。并用Qubit检测试剂盒(赛默科技，美国)测定所提取DNA浓度，确保所有样品的DNA浓度为20ng/μL-40ng/μL，以满足后续定量实验要求。
3、标准曲线质粒样品的制备
每一对引物对应的抗性基因由环境混合DNA样品经过PCR扩增、目的片段切胶回收、DNA纯化、连接PMDTM19-T载体、转化培养、挑取单菌落测序、Blast比对验证和采用质粒提试剂盒(天根，北京)获得对应的阳性质粒。利用Qubit检测试剂盒测定阳性质粒浓度，确保每一个阳性质粒的拷贝数为1010copy/μL。混合所有阳性质粒，做成混合标液。最后，混合标液的浓度为108copies/μL。混合质粒以10倍梯度稀释至拷贝数范围为102-108copies/μL，用于制作标准曲线。
4、芯片的制备
采用SmartChip多样品纳米分配器(WaferGen，美国)对所述抗性基因引物、污水处理厂5种DNA样品和阳性克隆质粒在SmartChip纳米芯片(WaferGen，美国)上进行分配。采用SmartChip多样品纳米分配器仪器说明中120个引物×42个样品的方案，分别把抗性基因引物、DNA样品和阳性克隆质粒分样至芯片上。首先，将911μL LightCycler480 DNA SYBRGreenI Mix和547μL无菌水混合组成PCR反应液I。在
无酶孔板上按SmartChip多样品纳米分配器说明书加载120孔10.9μL PCR反应液I和2.7μL 96无菌孔板中抗性基因引物。并在SmartChip多样品纳米分配器上将引物384孔板分样到芯片上(如图1，图1为384板抗性基因相应的引物表)。其次，将493μL LightCycler480 DNA SYBR GreenI Mix、9μL灭菌的50mg/mL牛血清白蛋白溶液和287μL无菌水混合组成PCR反应液II。在
无酶孔板上按SmartChip多样品纳米分配器说明书加载42孔15.2μL PCR反应液II和3.8μL DNA样品(包括标准曲线质粒样品、污水处理厂样品和作为阴性对照的无菌水)，每个样品包含3个技术重复。并在SmartChip多样品纳米分配器上将样品384孔板分样到已加载引物的芯片上(如图2)，图2中，注：H2，H3，H4，H5，H6，H7和H8分别代表：拷贝数为102copies/μL的混合质粒样品、拷贝数为103copies/μL的混合质粒样品，拷贝数为104copies/μL的混合质粒样品，拷贝数为105copies/μL的混合质粒样品，拷贝数为106copies/μL的混合质粒样品，拷贝数为107copies/μL的混合质粒样品和拷贝数为108copies/μL的混合质粒样品，INF-H为污水处理厂的高浓度抗生素进水段样品，INF-L为低浓度抗生素进水段样品，OT为好氧池样品，AT为厌氧池样品，EFF为出水段样品，Water表示阴性对照。引物和DNA样品分配后都需要将芯片离心(3200rpm/5min)，离心后的芯片贴膜后备用。
5、高通量荧光定量PCR
使用SmartChip实时PCR系统对制备好的芯片进行荧光定量PCR检测。PCR扩增程序为：95℃预变性10min；随后95℃变性30s，60℃退火延伸30s，40个循环。程序自动升温进行熔解曲线分析。
6、数据分析
程序完成后，软件将自动分析并导出数据。导出的数据根据以下条件进行筛选：1)扩增效率需在80％-120％之间；2)循环临界值(CT)必须小于31；3)三个技术重复至少两个得到扩增的认定为有效扩增。
以101个质粒作为阳性对照，进行标准曲线分析(图3)和连续稀释试验(图4)评估101对引物的特异性、敏感性和效率。根据标准曲线和实验得出的ct值，计算得到表2，也就是每一个基因对应的基因绝对丰度数据。进一步得到图6的实施例1中抗性基因绝对丰度总和图。其中，图3是101对引物的高通量荧光定量的标准曲线图。图4是连续稀释混合质粒评估101对引物的灵敏度图，从图4可以看出最低丰度为0.00028ng/ul。图5是101对引物的扩增效率图。图5是根据SmartChip实时PCR系统对制备好的芯片(包含101对引物)进行荧光定量PCR检测，PCR结束后，软件将自动分析并导出数据，导出的数据中包含了efficiency数据，然后根据efficiency数据绘制得到图5。扩增效率计算公式：Eff＝10(-1/slope)-1,其中，斜率是对应于标准曲线的斜率。
7、结果分析
污水处理厂的高浓度抗生素进水段(INF-H)、低浓度抗生素进水段(INF-L)、好氧池(OT)、厌氧池(AT)和出水段(EFF)这5个部分的污水样品的抗性基因绝对丰度为3个平行样品的平均值，结果表2。
表2污水处理厂抗性基因绝对丰度表
注：total是这101个基因的丰度总和。
由表2可以看出，污水处理厂进水段、好氧池、厌氧池和出水段都检测出了不同丰度的抗性基因。其中，出水段的抗性基因绝对丰度显著低于进水段，说明检测出来的出水段的抗性基因显著少于进水段的抗性基因。与实际情况相符，检测方法准确。可见用于微生物抗性基因的高通量绝对定量检测引物、芯片及检测方法能够准确、高效地表征环境中抗性基因暴露量。因此，本发明对于量化和评估复杂环境样品体系中抗性基因的风险，具有广阔的应用前景。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。
Claims (8)
1.一种微生物抗生素抗性基因的高通量检测引物组，其特征在于，所述引物组含有101对引物序列，其中SEQ ID NO:1和2为一对上下游引物，SEQ ID NO:3和4为一对上下游引物，以此类推至SEQ ID NO:201和202为一对上下游引物。
2.一种用于微生物抗性基因的高通量定量检测芯片，其特征在于，含有权利要求1所述的引物组。
3.如权利要求2所述高通量定量检测芯片，其特征在于，还含有阳性克隆质粒；所述阳性质粒为插入了一个抗性基因的质粒，所述抗性基因为权利要求1所述引物组扩增得到的任一基因。
4.一种用于微生物抗性基因的高通量定量检测试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的引物组。
5.如权利要求4所述高通量定量检测试剂盒，其特征在于，还含有阳性克隆质粒；所述阳性质粒为插入了一个抗性基因的质粒，所述抗性基因为权利要求1所述引物组扩增得到的任一基因。
6.权利要求1的引物组或权利要求2-3任一所述检测芯片或权利要求4-5任一所述检测试剂盒用于检测环境样品中微生物抗性基因的用途。
7.一种用于微生物抗性基因的高通量定量检测方法，其特征在于，包括如下步骤，
提取待测样品总DNA；
扩增：采用权利要求1的引物组或权利要求2-3任一所述检测芯片或权利要求4-5任一所述检测试剂盒对待测样品进行PCR扩增；
结果分析：采用标准质粒外标法对微生物抗性基因的丰度进行绝对定量。
8.如权利要求7所述检测方法，其特征在于，所述PCR扩增的程序为：95℃预变性10min；随后95℃变性30s，60℃退火延伸30s，40个循环。
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