CN110846424B - 出入境口岸微生物的快速检验检疫方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种出入境口岸微生物的快速检验检疫方法方法，属于分子生物学检测鉴定领域，主要包括如下步骤：样本采集；样品制备；高通量测序；生物信息学分析和关联分析五个步骤。该方法基于宏基因组学，可以对出入境口岸微生物的菌群结构进行定性和定量检测，灵敏度高、结果准确。

Description

出入境口岸微生物的快速检验检疫方法

技术领域

本发明属于分子生物学检测鉴定领域，具体涉及一种快速检测出入境口岸微生物方法。

背景技术

自2013年以来，我国已成为世界第一大贸易国，随着国际贸易日益繁荣和多元化，伴随进出口贸易活动发生跨国微生物污染突发事件的风险大幅上升，严重危害公众安全、环境安全和国土安全。同时由于国内微生物领域快速发展，通过邮寄方式寄送微生物菌种的频率和规模都在迅速发展，由邮寄渠道发生外来微生物入侵的可能性也在不断增长。面对严峻的微生物入侵形势，严密而周全的检疫手段必不可少。为了应对外来微生物入侵，我国先后出台了《人间传染的病原微生物名录》、《检验检疫动物病原微生物实验活动生物安全要求细则》以及《动物病原微生物实验活动生物安全要求细则》等众多检验检疫名录以及相关检疫标准，希冀将可能的微生物入侵阻挡在口岸之外。

然而由于微生物的品种繁多、变异迅速以及人们对于微生物的认知不足，经常会有较为迅猛的外来致病菌疫情从国外蔓延至国内。如2016年2月9日，确诊了中国大陆首例输入性寨卡病毒感染病例；2016年7月，北京口岸发现了我国首例输入性裂谷热病例；2018年8月，辽宁沈阳确诊首例非洲猪瘟疫情等不一而足。这些事件意味着我国需要不断在新的形势下更新微生物检验检疫手段，将危险扼杀与萌芽之前。

当前我国的主要的微生物检验检疫手段是以富集培养，分离、鉴定、动物感染实验以及理化分析等传统描述型手段为主，部分特定菌或病毒采用分子生物学手段进行鉴定。

对于传统的描述性手段，由于菌种的不同，需要采取不同的检测方案。如大肠杆菌的检测需要通过乳糖蛋白胨发酵实验以及革兰氏染色等手段进行；而对于霍乱弧则需要碱性蛋白胨水增培养基进行增殖、TCBS琼脂和CHROMIDVIBRIO弧菌显色培养基进行分析纯化，镜检后再培养并通过细菌鉴定仪鉴定；对于肠球菌则是另一套检测方案。综上所述，传统的鉴定方法存在着耗时长、操作繁琐、灵敏度低以及容易漏检等缺陷，这意味着将分子生物学手段引入检验检疫，构建全面而严密的检验检疫手段的重要性大大提升。

目前口岸检验检疫中运用的分子生物学手段主要有聚合酶链式反应(PCR)、核酸杂交以及生物芯片等手段。这些手段相较于传统手段，更加灵敏、特异以及快速。对于PCR而言，通过同时引入多种特异性引物同时检测多种病原体，包括普通PCR、反转录PCR、多重PCR、巢式PCR、PCR单链构象多态性(PCRSSCP)、限制性片段长度多态性(RFLP)、RAPD技术、荧光定量PCR、随机扩增的多态性DNA技术(RAPD)和重复序列PCR技术(Rep-PCR)等。通过PCR手段进行检测的主要有分支杆菌、幽门螺杆菌、支原体、衣原体、螺旋体以及大多数病毒；核酸杂交法主要用于无法培养且无诊断抗原的病毒，主要包括荧光原位杂交、斑点杂交等；生物芯片主要运用于检测大肠埃希菌、痢疾志贺菌、伤寒沙门菌及分支杆菌的分型及耐药性突变等。

以上三种运用较为广泛的分子生物学手段尽管拥有比传统手段更为宽广的适用范围，但仍然并非对于所有微生物普遍适用。而随着高通量测序的发展以及宏基因组学的快速进步，其成本及检出限在不断降低，且随着生物信息学的发展其检测准确性在不断提高。这意味着将宏基因组相关手段引入口岸微生物检验检疫体系是一个很好的选择。

中国专利201810879060.3申请中公开了一种液相芯片技术检测微生物的方法，包括以下步骤：S1，根据微生物基因序列设计合成对应的布鲁氏菌探针、沙门氏菌探针、狂犬病毒探针、弓形虫探针、巴氏通体探针和弯曲杆菌探针；S2，将S1中各探针分别与第一、第二、第三、第四、第五和第六荧光编码微球相连，分别获得第一、第二、第三、第四、第五和第六偶联微球的探针溶液；S3，将待测物样品，经DNA抽提和PCR扩增获得待测PCR产物，将待测PCR产物加入偶联微球的探针溶液，在Luminex仪器中读取信号，与阈值比较，判断待测物样品为阴性或阳性。该发明虽然能通过高通量检测技术检测多种微生物，但只能对微生物的有无进行定性的判定，无法完成定量分析。

中国专利201810372651.1申请中公开了一种快速筛查食源性病原菌的方法，属于食品安全检测技术领域。所述食源性病原菌快速筛查方法基于细菌特异性酶反应，反应体系包括支持目标菌生长的营养成分、干扰菌抑制剂及细菌特异性酶试卤灵类反应底物，测试时通过将定量测试样品放入反应体系中，在适宜温度下培养5～8h，直接观察反应体系中的颜色变化或在573nm波长激发后，检测585nm处荧光的产生与否即可获得食源性病原菌定性检测结果。但该发明使用的是直接培养方法，检测时间长，该发明检测结果的准确性易受培养过程的影响。

发明内容

本发明的目的在于基于宏基因组学，提供一种快速检测出入境口岸微生物方法。

本发明所述的检测方法，包括样本统计、样品制备、高通量测序、生物信息学分析、关联分析和评分六个步骤。

1、样本统计：统计样本的采集地点、类型和环境特征；

2、样品制备：从样本中提取总DNA；

3、高通量测序：利用步骤2提取的总DNA构建高通量测序文库，进行高通量测序；

4、生物信息学分析：步骤3获得的测序结果进行聚类注释，获得样品中的细菌种类以及菌群结构；

5、关联分析：将菌群结构与环境特征进行关联分析；

6、评分：利用步骤5得到的关联分析结果进行综合评分。

其中，步骤1样本统计包括：统计样本的采集地点、类型以及经纬度。

其中，步骤1样本统计包括：采集样品是否为种植作物、施肥种类、相关物理、化学、生物指标作为环境特征指标。

其中，步骤2样品制备包括：细胞裂解、沉淀蛋白、沉淀DNA、溶解DNA和纯化DNA五个步骤。

具体的，根据样品类型选择DNA提取试剂盒进行样品制备。

其中，步骤3高通量测序包括：构建高通量测序文库构建和进行高通量测序两个步骤。

具体的，包括以下三个步骤：

(1)根据16S rRNA基因的V3-V4区附近的细菌保守区序列设计带有标签的特异性引物，以步骤2中提取的总DNA作为模板，PCR扩增获得测序文库；

(2)进行实时荧光定量PCR鉴定步骤(1)的扩增浓度，保证测序文库符合上机最低要求；

(3)将步骤(2)得到的符合上机浓度最低要求的测序文库进行高通量测序。

具体的，步骤(3)中每个样品的reads数不低于20000条。

具体的，对高通量测序结果进行质量控制、双端连接、去除标签序列和测序引物、去除嵌合体、去除非细菌序列后获得样品中所有的细菌序列，将获得的细菌序列进行聚类注释，获得每个样品中的细菌种类以及菌群结构。

具体的，标签去除为三段标签序列的拆分。

其中，步骤4生物信息学分析包括：

(1)去除引物接头，获取样品真实序列；

(2)去除冗余序列，加快分析进度并降低对分析设备硬件的要求；

(3)根据相似性聚类，并与数据库进行比对，获取各序列的注释信息；

(4)将去除引物接头的序列与聚类结果进行比较，获取每个样品每种菌群的具体序列数以及其相对丰度。

其中，步骤5关联分析包括以下三个步骤：

(1)利用统计软件Lefse，通过Kruskal-Wallis秩和检验对不同环境下的物种进行差异分析，确定所有的差异菌种；

(2)利用统计软件Lefse，通过Wilcoxon秩和检验对所有差异菌种进行检验，确定其亚种趋同于统一分类级别；

(3)生成线性分析模型，确定差异菌群。

其中，步骤6评分包括以下三个步骤：

(1)通过大规模常规样品(对照样品)计算其Unifrac矩阵；

(2)基于该矩阵，通过层次聚类获得待测样品的相似性，以绘图形式展现；

(3)根据常规样品矩阵范围(正常值范围)，判断待测样品是否超出该范围，是则视为异常样品。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

利用本发明的检测方法，基于宏基因组技术，通过基因文库的构建可以充分利用微生物资源，无需培养，检测快速、结果准确，并且利用本发明的检测方法可以对菌群结构进行定性和定量分析。

具体实施方式

为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施例，进一步阐明本发明，但下述实施例仅仅为本发明的优选实施例，并非全部。基于实施方式中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得其它实施例，都属于本发明的保护范围。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1

具体实施步骤如下；

一、样本统计

对样本的采集地点、类型、经纬度信息进行采集。

二、样品制备

利用试剂盒EZNA Soil DNA kit，货号为D5625-02(200)进行样品制备。

1、将台式高速冷冻离心机调节至4℃，两个恒温水浴槽温度分别调整为65℃以及70℃，并将Elution Buffer置于65℃水浴锅预热。

2、向样品管中加入500mg玻璃珠、1mL Buffer SLX MLU，关闭离心管，置于银汞调和器，打散混匀20s。

3、向打散的样品管中加入100μL DS Buffer，轻柔混匀后放入70℃水浴锅中水浴10min，在水浴期间进行间歇震荡。

4、水浴后，取出样品，在室温离心机中离心，离心条件为3000rpm，3min；离心后取800μL上清于新的1.5mL离心管中，加入270μL SP2 Buffer。

5、将第4步获得的混合液混合均匀后，冰浴5min后，于4℃的离心机中在13000rpm条件下离心5min。

6、取800μL上清于新的离心管，加入0.7倍体积(560μL)的异丙醇，反复翻转20～30次，使液体混匀后，在4℃离心机中13000rpm离心10min；移除上清后，将离心管倒置于吸水纸上，使液体彻底流尽。

7、向离心管中加入200μL预热的Elution Buffer，在振荡器上震荡10s后放于65℃水浴锅中水浴15min，使沉淀彻底溶解。

8、混匀HTR Reagent试剂，取75μL加入到第8步获得的溶液中，震荡混匀，静置2min后，在室温离心机中13000rpm离心2min。若上清依然浑浊，则重复至溶液澄清为止。

9、取200μL上清置于新的离心管中，加入等体积XP2溶液。震荡混匀，将混合溶液转移至离心吸附柱中，室温10000rpm离心1min。

10、向吸附柱中加300μL XP2溶液，室温10000rpm离心1min。

11、更换新的收集管，向吸附柱中加入700μL SPW Wash Buffer，室温10000rpm离心1min；重复洗脱1次。

12、弃净收集管中的废液，将吸附柱置于空的收集管中，在室温离心机中13000rpm离心2min，使吸附柱中的液体弃干净；打开吸附柱，使乙醇挥发干净。

13、向晾干的吸附柱中加入50μL Elution Buffer，于65℃水浴锅中水浴15min，使DNA充分溶解后13000rpm离心2min。

14、再向吸附柱中加入50μL Elution Buffer，重新洗脱一次。

三、高通量测序

1、根据16S rRNA基因的V3-V4区附近的细菌保守区序列设计带有标签的特异性引物。

2、以步骤二中提取的总DNA作为模板，通过PCR扩增获得测序文库。

3、实时荧光定量PCR鉴定测序文库的扩增浓度，保证测序文库符合上机最低要求。

4、将步骤得到的符合上机浓度最低要求的测序文库进行高通量测序。

对高通量测序结果进行质量控制、双端连接、去除标签序列和测序引物、去除嵌合体、去除非细菌序列后获得样品中所有的细菌序列，将获得的细菌序列进行聚类注释，获得每个样品中的细菌种类以及菌群结构。将高通量测序的图像测序信号转换为细菌的核酸序列信息。

四、生物信息学分析

1、去除引物接头，获取样品真实序列。

2、去除冗余序列，加快分析进度并降低对分析设备硬件的要求。

3、根据相似性聚类，并与数据库进行比对，获取各序列的注释信息。

4、将去除引物接头的序列与聚类结果进行比较，获取每个样品每种菌群的具体序列数以及其相对丰度。

五、关联分析

1、利用统计软件Lefse，通过Kruskal-Wallis秩和检验对不同环境下的物种进行差异分析，确定所有的差异菌种。

2、利用统计软件Lefse，通过Wilcoxon秩和检验对所有差异菌种进行检验，确定其亚种趋同于统一分类级别。

3、生成线性分析模型，确定差异菌群。

六、评分

1、通过大规模常规样品(对照样品)计算其Unifrac矩阵。

2、基于该矩阵，通过层次聚类获得待测样品的相似性，以绘图形式展现。

3、根据常规样品矩阵范围(正常值范围)，判断待测样品是否超出该范围，是则视为异常样品。

实施例2

样本来源：BJ样品为来自于北京郊区荒地的土壤；HLJ、JL以及LN样品为来自于东北三省人参根际土壤。

实验方法：本发明实施例1中所述方法。

实验结果：

结果显示，同种细菌在不同地点中Reads分布并不均匀，部分菌种在众多样品中的平均reads数甚至小于1条，相对含量在此范围内的细菌通过传统培养的方法往往难以检测到。由此说明：

1)本发明方法可以在微生物含量极低的状态下进行检测，而且相较于传统方法检测灵敏、效果好。

2)通过本发明的检测方法可以获得不同来源样本的菌群结构的差异信息，为后续大数据分析以及数据库建设提供有力支撑。

实验例1

样本数量：8-12

实验方法：1、本发明实施例1中所述方法；

2、中国专利申请201710048877.1中实施例3所述方法。

实验结果：

结果显示，本发明可以在样本DNA含量为2.14pg/μL的低浓度条件下检出，与对比文件中国专利申请201710048877.1中的9.785pg/μL相比，本发明的检测方法可以在DNA含量低的情况下也可以检测出样品中的细菌，检测灵敏，结果稳定，更适用于微生物的快速检测了，尤其是口岸微生物的检验检疫。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一种出入境口岸微生物的快速检验检疫方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)样本统计：统计样本的采集地点、类型和环境特征；

(2)样品制备：从样本中提取总DNA；

(3)高通量测序：利用步骤(2)提取的总DNA构建高通量测序文库，进行高通量测序；

(4)生物信息学分析：步骤(3)获得的测序结果进行聚类注释，获得样品中的细菌种类以及菌群结构；

(5)关联分析：将菌群结构与环境特征进行关联分析；

(6)评分：利用步骤(5)得到的关联分析结果进行综合评分；

其中，步骤(1)所述样本统计包括：统计样本的采集地点、类型以及以经纬度、是否种植作物、施肥种类、相关物理、化学、生物指标作为相关指标的环境特征；

步骤(2)所述样品制备依次包括以下步骤：细胞裂解、沉淀蛋白、沉淀DNA、溶解DNA、纯化DNA，最终获得总DNA；

步骤(3)所述高通量测序包括：

S1：根据16S rRNA基因的V3-V4区附近的细菌保守区序列设计带有标签的特异性引物，以步骤(2)提取的总DNA作为模板，PCR扩增获得测序文库；

S2：进行实时荧光定量PCR鉴定步骤S1的扩增浓度，保证测序文库符合上机最低要求；

S3：将S2得到的符合上机浓度最低要求的测序文库进行高通量测序；

所述的步骤S3中，要求最后每个样品的reads数不低于20000条；

所述的高通量测序还包括步骤S4：将步骤S3获得的测序结果进行质量控制、双端连接、去除标签序列和测序引物、去除嵌合体、去除非细菌序列后获得样品中所有的细菌V3-V4区序列；

所述的高通量测序步骤S4中标签序列去除为三段标签拆分；

步骤(4)所述生物信息学分析包括：

S1、去除引物接头，获取样品真实序列；

S2、去除冗余序列，加快分析进度并降低对分析设备硬件的要求；

S3、根据相似性聚类，并与数据库进行比对，获取各序列的注释信息；

S4、将去除引物接头的序列与聚类结果进行比较，获取每个样品每种菌群的具体序列数以及其相对丰度；

步骤(5)所述关联分析包括：

S1、利用统计软件Lefse，通过Kruskal-Wallis秩和检验对不同环境下的物种进行差异分析，确定所有的差异菌种；

S2、利用统计软件Lefse，通过Wilcoxon秩和检验对所有差异菌种进行检验，确定其亚种趋同于统一分类级别；

S3、生成线性分析模型，确定差异菌群；

步骤(6)所述评分包括：

S1、通过将大规模常规样品作为对照样品计算其Unifrac矩阵；

S2、基于该矩阵，通过层次聚类获得待测样品的相似性，以绘图形式展现；

S3、根据常规样品矩阵范围作为正常值范围，判断待测样品是否超出该范围，是则视为异常样品。