CN104073500A - 一种筛选与prrsv感染和抗性相关的基因的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种利用高通量测序结合生物信息学的方法筛选与蓝耳病毒（PRRSV）感染和抗性相关的基因的方法，所述方法包括（1）样品挑选；（2）提取样品总RNA；（3）Solexa文库构建；（4）测序；（5）FASTX检测过滤低质量Reads；（6）BWA0.5.8将Reads比对猪基因组，并计算每个基因的表达量；（7）DEGseq软件分析差异表达基因；（8）与PRRSV感染和抗性相关基因的获取。本发明的筛选与PRRSV感染和抗性相关的基因的方法为深入理解PRRSV对于猪的治病分子机制提供了重要的信息，并在此基础之上为寻找防治和治疗蓝耳病的新靶点提供了新的方法，继而为进一步研究蓝耳病的新的防治方法奠定了基础。

Description

一种筛选与PRRSV感染和抗性相关的基因的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种利用高通量测序结合生物信息学的方法筛选与蓝耳病毒（PRRSV）感染和抗性相关的基因的方法。

背景技术

目前猪呼吸与繁殖系统综合征（PRRS)最早出现在20世纪八十年代中期的美国，随后欧洲也被发现，最初病因不明确，被称作神秘猪病，因为该病会引起病猪四肢末端充血，耳朵发蓝，又叫蓝耳病。该病临床症状表现为母猪流产，木乃伊胎，死胎，育成猪生长发育缓慢，间质性肺炎等。1991年荷兰首先从病猪身上分离出了一种RNA病毒Lelystad Virus（I型蓝耳病毒），同时美国分离出了另一种病毒VR-2332(II型蓝耳病毒)，从而明确了该病的致病原因是由一种病毒引起的。中国大陆在1996年首次发现蓝耳病，到2006年在全中国又爆发了一场大规模的高热病，感染了200万以上头造成大约40万死亡，而且不同于传统的蓝耳病毒，该病毒还感染了大量的成年母猪，后证实该病是由一种高致病性的蓝耳病毒引起的，是一种变异的II型蓝耳病毒，与一种中国的蓝耳病病毒亚型HB-1高度同源，该病毒有一个特点是在非结构蛋白2（NSP2）区有一个不连续的20个氨基酸的缺失。

病毒的靶细胞主要是肺泡巨噬细胞或者单核细胞来源的树突状细胞。感染PRRSV后，不能引起有效的免疫应答，感染初期产生的抗体不具备中和抗体的效果，而且病毒可能会借助抗体进入细胞，形成抗体依赖的增强效应，从而促进病毒的扩散。体内和体外细胞实验证实病毒感染后引起非典型的天然免疫应答效应：I型干扰素IFN-alfa，TFN-alfa的表达受到抑制，白细胞介素-10（IL-10）表达量升高，从而引起病毒免疫抑制和持续感染。感染PRRSV后在2-3周以后才能引起细胞免疫反应，而且检测到的免疫细胞同其他病毒如伪狂犬病毒相比较少，同时产生的CD3CD8high细胞不具有杀伤细胞活性，从而可能不能及时清除体内的病毒。蓝耳病毒的突变率很高，类型多，目前的疫苗的效果有限而且弱毒苗具有反强的危险性，在防治上比较困难，急需寻找一种新的方法来弥补传统方法的不足。有报道用RNAi的方法，设计针对PRRSV的shRNA可以在体内和体外抑制PRRSV的增殖，也有研究用干扰素可以抑制PRRSV在体外细胞MRAC-145上的复制。不同的个体和品种对PRRSV的抗性也有差异。

高通量第二代测序方法（如：Illumina’s Genome Analyzer II)，具有识别单个碱基变异的高分辨率，运用pair-end方法可以提高测序的效率和reads的长度，通过把测序的Reads比对到参考基因组上，高通量测序方法可以更准确地提高基因组的注释信息，识别非转录区，新转录本和可变剪接，也可以分析基因表达差异信息。

如果能够得知与蓝耳病毒感染相关或抗性有关的基因，就能得到治疗和防治蓝耳病的新的靶点，继而进一步得到多种防治蓝耳病的方法，但是至今鲜有运用高通量测序方法来分析筛选与蓝耳病毒感染和抗性有关的基因的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种筛选与蓝耳病毒（PRRSV）感染和抗性相关的基因的方法，从而为治疗和防治蓝耳病寻找新的靶点。

具体的，本发明的目的是提供一种利用高通量测序结合生物信息学的方法筛选与PRRSV感染和抗性相关的基因的方法，利用所述方法分析感染前后和不同品种间的差异基因，继而筛选得到一些与PRRSV感染和抗性相关的基因。

本发明的筛选与PRRSV感染和抗性相关的基因的方法，包括如下步骤：

（1）样品挑选：选取两个品种的对蓝耳病有抗性差异的35日龄猪，分别取两个品种猪在未感染PRRSV前（第0天）的组织样和感染PRRSV后第5天的组织样，各组织样均存放在RNA保存液RNAlater中；

（2）提取样品总RNA：提取RNA保存液RNAlater中的各组织样的总RNA；

（3）Solexa文库构建：从总RNA中纯化mRNA，合成双链cDNA片段并进行纯化；

（4）测序：将各组织样的cDNA片段用cluster station放入芯片（Flow cell）中进行扩增，然后用genome analyzer II进行pair-end测序；

（5）利用FASTX检测过滤低质量Reads；

（6）利用BWA0.5.8将Reads比对猪基因组，对单一比对上的序列进行注释，并计算每个基因的表达量，基因表达量用RPKM值表示，计算公式为：

RPKM=比对上的reads数/总reads数/基因长度×10⁹

（7）利用DEGseq软件分析差异表达基因，符合P≤0.001，FDR≤0.001，|log2foldchange|≥1则为差异显著；

（8）与PRRSV感染和抗性相关基因的获取：根据上一步标准所筛得的差异表达基因，获得两个品种感染前和感染后第5天的差异显著基因交集a（即C0C5的差异显著基因和T0T5的差异显著基因交集为a）和感染前两个品种间的差异表达基因集（即C0T0差异显著基因）b，a与b的交集的基因即为与PRRSV感染和抗性相关的候选基因。

优选地，步骤（1）中选取两个品种的对蓝耳病有抗性差异的35日龄长白猪和通城猪各6头，隔离饲养，分别取两个品种猪在未感染PRRSV前（第0天）的肺组织样，每个品种猪取3头，然后将剩余的两个品种猪接种蓝耳病毒，在感染PRRSV后第5天取肺组织样，每个品种猪取3头，各肺组织样均存放在RNA保存液RNAlater中。

优选地，步骤（2）中用trizol RNA提取试剂提取各组织样的总RNA，并用Nanodrop2000检测，选取OD_260/280=1.8～2.2，OD_260/230≥2.0，28S:18S≥1.0，23S:16S≥1.0，密度≥400ng/ul的总RNA，将相同品种的3个个体的总RNA混合。

优选地，步骤（3）Solexa文库构建的方法为illumina平台测序常规建库方法，具体为：

（A1）从10ug总RNA中用连接有poly-T的磁性小珠纯化mRNA；

（A2）预热PCR仪到94°C，将纯化的mRNA与反应混合液共20ul放入PCR管中，在PCR仪上94°C加热5分钟，切断mRNA；

（A3）用反转录酶和随机引物将切断的mRNA反转成第一链cDNA，去除第一链cDNA中的RNA，合成双链cDNA分子；

（A4）用T4DNA聚合酶和klenow聚合酶修复cDNA分子的粘膜端，形成平末端cDNA分子，在补平的cDNA分子3’平末端加一个腺苷酸A，并连接上具有T末端的接头；

（A5）电泳并回收纯化上述反应产物，PCR反应扩增纯化的cDNA片段。

步骤（A5）中反应产物约为200bp。

优选地，步骤（5）中，过滤掉质量小于20、碱基的总数目小于整个reads总数目的50%的reads。

优选地，步骤（6）中猪基因组序列在NCBI或GenBank上的版本号Sscrofa10.2。

其中，步骤（8）中a为两个品种感染前后的差异显著基因的交集，其为感染PRRSV后对宿主与病毒互作参与了重要生物学功能的基因；b为感染前两个品种间的差异基因，抗性差异是两个品种在感染前本底基因的表达差异造成的，感染前品种间的差异基因造成了抗性的差异；a与b的交集为既在感染前后有显著差异表达，又在感染前两个品种间有差异表达的基因，其为参与PRRSV感染和抗性相关的重要基因。

本发明的筛选与PRRSV感染和抗性相关的基因的方法利用高通量测序结合生物信息学的方法，为寻找防治和治疗蓝耳病的新靶点提供了新的方法，继而为进一步研究蓝耳病的新的防治方法奠定了基础。利用本发明方法不仅可以快速、高效的找到与PRRSV致病的相关基因和潜在的防治和治疗蓝耳病的新的靶基因，而且还可以发现新的参与PRRSV致病过程的分子，为更深入的理解PRRSV致病机理提供了重要的指导信息。

附图说明

图1为两个品种感染前后的差异显著基因；

图2为感染前（第0天）两个品种间的差异显著基因。

其中，-3.00、-2.00、-1.00、0.00、1.00、2.00、3.00表示标准化后的相对表达值。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，本发明实施例中所用的实验材料、生化试剂和仪器等均可市售获得，实施例中所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。

1、实验材料

长白和通城猪各6头；

105TCID50/ml的wuhan-3高致病性蓝耳病毒（来自华中农业大学陈淑君老师实验室）

2、实验试剂

RNA保存液RNAlater购自Life Technologies公司；

Trizol RNA提取试剂购自invitrogen公司，货号为15596-026；

DEPC水：去离子水中加入0.1%DEPC，37℃过夜，高压灭菌；

RNA操作所用枪头、离心管经0.1%DEPC水浸泡过夜，去离子水冲洗2-3遍，高压灭菌；

RNA操作所用75%乙醇：以DEPC处理的水配制乙醇；

mRNA Solexa测序文库构建试剂盒购自Illumina公司。

3、实验仪器及软件

高通量测序仪Genome Analyser II购自Illumina公司；

生物信息分析软件如下：

数据质量评估软件：FASTX

http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/download.html；

测序Reads mapping软件BWA0.5.8

http://sourceforge.net/projects/bio-bwa/files/；

差异基因表达分析软件DEGseq

http://www.bioconductor.org/packages/2.10/bioc/html/DEGseq.html。

实施例1

（1）样品挑选：选取两个品种的对蓝耳病有抗性差异的35日龄长白猪和通城猪各6头，隔离饲养，分别在两个品种猪未感染PRRSV前（第0天）先宰杀每个品种猪各3头，并取其肺组织样，存放在RNA保存液RNAlater中，作为对照，然后将剩余的两个品种猪分别皮下静脉注射接种5ml105TCID50/ml的wuhan-3高致病性蓝耳病毒（来自华中农业大学陈淑君老师实验室），每天测量体温，并观察记录临床症状，在感染PRRSV后第5天宰杀感染猪，取各肺组织样，每个品种猪各取3头，保存在RNA保存液RNAlater中。

其中，C0,C5,T0,T5分别表示未感染PRRSV前（第0天）的长白猪，感染PRRSV后第5天的长白猪，未感染PRRSV前（第0天）通城猪，感染PRRSV后第5天的通城猪。

（2）提取样品总RNA：将RNA保存液RNAlater中的各肺组织样取出，用trizol RNA提取试剂提取各组织样的总RNA，并用Nanodrop2000检测，选取OD_260/280=1.8～2.2，OD_260/230≥2.0，28S:18S≥1.0，23S:16S≥1.0，密度≥400ng/ul的总RNA，将相同品种的3个个体的总RNA混合。

（3）按illumina平台测序常规建库方法进行Solexa文库构建：

（A1）从10ug总RNA中用连接有poly-T的磁性小珠纯化mRNA；

（A2）预热PCR仪到94°C，将纯化的mRNA与反应混合液共20ul放入PCR管中，在PCR仪上94°C加热5分钟，切断mRNA；

（A3）用反转录酶和随机引物将切断的mRNA反转成第一链cDNA，去除第一链cDNA中的RNA，合成双链cDNA分子；

（A4）用T4DNA聚合酶和klenow聚合酶修复cDNA分子的粘膜端，形成平末端cDNA分子，在补平的cDNA分子3’平末端加一个腺苷酸A，并连接上具有T末端的接头；

（A5）2%琼脂糖凝胶电泳上述反应产物，回收200bp左右的cDNA分子并进行纯化，PCR反应扩增纯化的cDNA片段。

跑琼脂糖胶电泳检测最终产物的大小和浓度。

（4）测序：将各样品的cDNA片段用cluster station放入芯片（Flow cell）中进行扩增，然后用Illuminagenome analyzer II进行pair-end常规测序；

（5）利用FASTX检测过滤低质量Reads：过滤掉质量小于20、碱基的总数目小于整个reads总数目的50%的reads。

（6）利用BWA0.5.8将Reads比对猪基因组，猪基因组序列在NCBI或GenBank上的版本号Sscrofa10.2，测序Reads比对结果和预测的基因数目如表1所示，对单一比对上的序列进行注释，并计算每个基因的表达量，基因表达量用RPKM值表示，计算公式为：

RPKM=比对上的reads数/总reads数/基因长度×10⁹

表1测序Reads比对结果和预测的基因数目

（7）利用DEGseq软件分析差异表达基因，符合P≤0.001，FDR≤0.001，|log2foldchange|≥1则为差异显著；

（8）与PRRSV感染和抗性相关基因的获取：根据上一步标准所筛得的差异表达基因，获得两个品种感染前后的差异显著基因的交集a和感染前两个品种间的差异显著基因集b，a与b的交集的基因即为与PRRSV感染和抗性相关的基因，其中，C0C5差异显著基因4281个，T0T52127个，两者交集a为1610个，C0T0差异显著基因b为828个，a与b的交集为282个，选取a与b交集的基因差异倍数在前20的共有差异显著基因作为与PRRSV感染和抗性最相关的候选基因，符合所述标准的6个基因如表2所示。

其中，a为两个品种感染前后的差异显著基因的交集，即C0C5差异显著基因和T0T5差异显著基因所共有的差异显著基因，如图1所示，a为感染PRRSV后对宿主与病毒互作参与了重要生物学功能的基因；b为感染前两个品种间的差异显著基因即C0T0差异显著基因，如图2所示，抗性差异是两个品种在感染前本底基因的表达差异造成的，感染前品种间的差异基因造成了抗性的差异；a与b的交集为既在感染前后有显著差异表达，又在感染前两个品种间有差异表达的基因，其为参与PRRSV感染和抗性相关的重要基因。

表2符合标准的6个基因

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (5)

1.一种筛选与PRRSV感染和抗性相关的基因的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

（1）样品挑选：选取两个品种的对蓝耳病有抗性差异的35日龄猪，分别取两个品种猪在未感染PRRSV前的组织样和感染PRRSV后第5天的组织样，各组织样均存放在RNA保存液RNAlater中；

（2）提取样品总RNA：提取RNA保存液RNAlater中的各组织样的总RNA；

（3）Solexa文库构建：从总RNA中纯化mRNA，合成双链cDNA片段并进行纯化；

（4）测序：将各组织样的cDNA片段用cluster station放入芯片中进行扩增，然后用genome analyzer II进行pair-end测序；

（5）利用FASTX检测过滤低质量Reads；

（6）利用BWA0.5.8将Reads比对猪基因组，对单一比对上的序列进行注释，并计算每个基因的表达量，基因表达量用RPKM值表示，计算公式为：

RPKM=比对上的reads数/总reads数/基因长度×10⁹；

（7）利用DEGseq软件分析差异表达基因，符合P≤0.001，FDR≤0.001，|log2foldchange|≥1则为差异显著；

（8）与PRRSV感染和抗性相关基因的获取：根据上一步标准所筛得的差异表达基因，获得两个品种感染前和感染后第5天的差异显著基因交集a和感染前两个品种间的差异表达基因集b，a与b的交集的基因即为与PRRSV感染和抗性相关的候选基因。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中选取两个品种的对蓝耳病有抗性差异的35日龄长白猪和通城猪各6头，隔离饲养，分别取两个品种猪在未感染PRRSV前的肺组织样，每个品种猪取3头，然后将剩余的两个品种猪接种蓝耳病毒，在感染PRRSV后第5天取肺组织样，每个品种猪取3头，各肺组织样均存放在RNA保存液RNAlater中。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中用trizol RNA提取试剂提取各组织样的总RNA，并用Nanodrop2000检测，选取OD_260/280=1.8～2.2，OD_260/230≥2.0，28S:18S≥1.0，23S:16S≥1.0，密度≥400ng/ul的总RNA，将相同品种的3个个体的总RNA混合。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（3）Solexa文库构建的方法包括如下步骤：

（A1）从10ug总RNA中用连接有poly-T的磁性小珠纯化mRNA；

（A2）预热PCR仪到94°C，将纯化的mRNA与反应混合液共20ul放入PCR管中，在PCR仪上94°C加热5分钟，切断mRNA；

（A3）用反转录酶和随机引物将切断的mRNA反转成第一链cDNA，去除第一链cDNA中的RNA，合成双链cDNA分子；

（A4）用T4DNA聚合酶和klenow聚合酶修复cDNA分子的粘膜端，形成平末端cDNA分子，在补平的cDNA分子3’平末端加一个腺苷酸A，并连接上具有T末端的接头；

（A5）电泳并回收纯化上述反应产物，PCR反应扩增纯化的cDNA片段。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（5）中，过滤掉质量小于20、碱基的总数目小于整个reads总数目的50%的reads。