CN106191320B

CN106191320B - Hpse基因在筛选抗蓝耳病猪中的应用

Info

Publication number: CN106191320B
Application number: CN201610615793.7A
Authority: CN
Inventors: 郭春和; 刘小红; 陈瑶生; 朱振邦
Original assignee: National Sun Yat Sen University
Current assignee: National Sun Yat Sen University
Priority date: 2016-07-29
Filing date: 2016-07-29
Publication date: 2019-11-26
Anticipated expiration: 2036-07-29
Also published as: CN106191320A

Abstract

本发明公开了HPSE基因在筛选抗蓝耳病猪中的的应用，并提供了一组HPSE基因表达量检测引物，包括上游引物HPSE‑F和下游引物HPSE‑R，序列分别如SEQ ID NO.1~2所示。本发明研究显示，猪体内HPSE基因表达量与PRRSV感染息息相关，HPSE基因编码的乙酰肝素酶（Heparanase）通过调节细胞膜上硫酸乙酰肝素表达量，进而调节PRRSV释放和感染效率；当HPSE表达量低时，猪对PRRSV具有抗性，反之易感。HPSE基因可以作为一种新型的判定PRRSV易感性或抗性的标准，为鉴别猪对PRRSV易感性以及PRRSV抗性猪的筛选和培育奠定了坚实的基础，对猪蓝耳病的防控具有重要的意义。

Description

HPSE基因在筛选抗蓝耳病猪中的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体地，涉及HPSE基因在筛选抗蓝耳病猪中的应用。

背景技术

猪繁殖与呼吸综合征（Porcine reproductive and respiratory syndrome，PRRS），俗称蓝耳病，是由猪繁殖与呼吸综合征病毒（Porcine reproductiveandrespiratory syndrome virus，PRRSV）引起，于1987年最早出现在美国，随后在欧洲出现报道。我国于1996年由郭宝清等首次分离到PRRSV，将分离毒株命名为CH-1a，证实了该病在我国存在。早在1992年，世界动物卫生组织（Office International Des Epizooties，OIE）就将该病列为B类传染病。目前，PRRS是养猪业中最重要的传染病之一，在全球对养猪业造成巨大的经济损失。2005年，PRRS对美国养猪业造成的经济损失高达56,000万美元，而现在，每年损失估计将高达66,400万美元。PRRS几乎分布在所有的养猪国家。猪感染PRRSV后，一般会继发细菌如副猪嗜血杆菌、链球菌等感染。在临床上，PRRS与猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2，PCV-2）混合感染病例较多。2006年，我国大部分省份及越南爆发了猪高热病（Porcine high fever syndrome，PHFS），给养猪业造成了巨大的经济损失，此病是由变异的PRRSV引起，命名为高致病型猪繁殖与呼吸综合征病毒（Highlypathogenic porcine reproductive and respiratory syndrome virus，HP-PRRSV）。HP-PRRSV特征为高热、高致病性及高死亡率。目前，农业部已将该病列入重大动物疫病强制免疫计划。

PRRSV的防控是目前我国乃至世界的难题。PRRSV难于防控主要表现在以下几方面：（1）嗜巨噬细胞性和免疫抑制性疾病，PRRSV主要感染猪的肺泡巨噬细胞（Porcinealveolar macrophages，PAMs），PAMs是免疫细胞，破坏PAMs，从而破坏机体免疫系统，从而引起免疫抑制；（2）抗原变异性，目前PRRSV变异较快，弱毒疫苗的使用是促使病毒变异的一个原因，最近有文献报道，美国出现了蓝耳新毒株NADC30，而我国也分离到类似美国的新毒株，命名为NADC30-like，而另有文献报道从猪场中分离到与疫苗毒基因组高度同源的PRRSV致病毒株，且毒力增强，分析有可能是疫苗毒反强或重组并散毒；（3）疫苗没有交叉保护力，目前市场上PRRSV疫苗几乎无交叉保护力，不同毒株间不交叉保护力；（4）抗体依赖性增强，PRRSV的感染会刺激机体产生抗体，但低效价的抗体不但不能中和病毒，反而对病毒的增殖有促进作用；（5）病毒持续性感染，PRRSV感染后，能够长时间在猪体内检测到病毒血症，PRRSV在体内持续时间长达5个月；（6）混合感染，目前临床上多见蓝耳与其他疾病混合感染，特别是圆环病毒、副猪嗜血杆菌、猪肺疫等与PRRSV的混合感染，使PRRSV的防控难上加难。

目前研究显示，PRRSV感染靶细胞并在胞内大量复制后，需从细胞膜表面释放出来，这时膜上的硫酸乙酰肝素（Heparan sulfate，HS）会与病毒粒子相互黏连，抑制病毒粒子释放。故若能找到调控HS的基因即可调节PRRSV释放，影响PRRSV感染，从而可针对此基因开展新的猪蓝耳病防控技术。并且，若能找到调控HS的基因，还可以以此基因作为猪对PRRSV抗性或易感性的判定标准，筛选猪对蓝耳病病毒的抗性或易感性，这可能是未来蓝耳病防治的重要途径之一，通过建立筛选PRRSV抗性或易感性猪的方法，为PRRSV抗病育种奠定基础。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是克服现有猪蓝耳病防治技术的缺陷和不足，提供乙酰肝素酶基因（Heparanse，HPSE）在筛选抗蓝耳病猪中的应用。本发明研究表明，PRRSV感染PAMs和Marc-145细胞后，通过NF-κB信号通路促进HPSE基因表达，提高乙酰肝素酶活性，从而对细胞膜表面硫酸乙酰肝素HS进行切割，防止PRRSV病毒颗粒粘附在HS上，以促进PRRSV病毒颗粒释放，提高PRRSV感染效率。即HPSE基因通过切割细胞表面HS进而提高PRRSV感染率，HPSE基因的表达量与PRRSV的复制息息相关，有望成为一种新型的筛选抗蓝耳病猪的方法，对PRRSV抗性猪的培育具有很好的临床应用价值。

本发明的目的是提供HPSE基因在筛选抗蓝耳病猪中的应用。

本发明的另一目的是提供一种提高猪对蓝耳病毒抗性的方法。

本发明的再一目的是提供HPSE基因在提高猪对蓝耳病毒抗性以及在制备提高猪对蓝耳病毒抗性的药物或制剂方面的应用。

本发明的再一目的是提供HPSE基因在培育对蓝耳病毒具有抗性的猪品种方面的应用。

本发明上述目的通过以下技术方案实现。

HPSE基因在筛选抗蓝耳病猪中的应用。所述猪HPSE基因的序列号为NM_001146130.2。

所述蓝耳病毒包括经典毒株和高致病性毒株。

一种鉴别评价猪对蓝耳病毒易感性的方法（也即上述应用的方法），是检测猪体内HPSE基因的表达水平，根据HPSE基因的表达水平鉴别猪对蓝耳病毒（PRRSV）是具有抗性还是具有易感性。

所述鉴别的标准是：HPSE表达量低时，猪对蓝耳病毒（PRRSV）具有抗性；反之具有易感性。

具体操作时，HPSE表达量的高低以本领域技术中猪体内HPSE表达量的普遍水平为依据。这里所说的高低是相对的，根据HPSE表达量较高或较低，从而判定猪是否可能对PRRSV具有抗性。

另外，本发明对于HPSE基因表达量的检测方法不作限制。可以是本领域内任意的基因表达量检测方法。

作为一种可优选的实施方案，本发明提供了一种检测猪HPSE基因表达量的引物组，所述引物组包括上游引物HPSE-F和下游引物HPSE-R，序列分别如SEQ ID NO.1~2所示。

另外，以下所述的应用均应在本发明的保护范围之内：

HPSE基因在提高猪对蓝耳病毒抗性方面的应用。

HPSE基因在制备提高猪对蓝耳病毒抗性的药物或制剂方面的应用。

HPSE基因在筛选和/或培育对蓝耳病毒具有抗性的猪品种方面的应用。

HPSE基因表达抑制剂在提高猪对蓝耳病毒抗性方面的应用。

HPSE基因表达抑制剂在制备提高猪对蓝耳病毒抗性的药物或制剂方面的应用。

本发明经过大量的研究和探索，首次发现猪体内HPSE基因可以通过切割细胞表面HS进而提高PRRSV感染率；PRRSV感染靶细胞后促进HPSE基因表达，提高乙酰肝素酶活性，从而对细胞膜表面硫酸乙酰肝素HS进行切割，防止PRRSV病毒颗粒粘附在HS上，以促进PRRSV病毒颗粒释放。即HPSE基因表达量与PRRSV感染息息相关，当HPSE表达量低时，猪对PRRSV具有抗性，反之易感。

本发明还通过体外siRNA干扰和过表达实验充分分析了HPSE基因与PRRSV复制的关系。另外还研究了HPSE基因调节PRRSV复制的分子机制，即HPSE基因表达的乙酰肝素酶通过迁移到细胞膜上切割HS，抑制PRRSV颗粒粘附在HS上，促进其释放。

另外，本发明选用了不同品种猪研究HPSE基因在筛选抗蓝耳病猪中的应用。分别选取我国地方品种通城猪、梅山猪（对蓝耳病不易感）及国外品种长白猪、大白猪（对蓝耳病易感）为例，进行PRRSV攻毒，解剖后根据血清和肺、淋巴结组织中病毒滴度TCID₅₀及PRRSV N蛋白表达水平确定通城猪、梅山猪及国外品种长白猪、大白猪对PRRSV感染力差别，根据HPSE基因表达水平研究其与4种品种猪对PRRSV感染力关系。结果显示，本发明所述利用HPSE基因筛选抗蓝耳病猪的方法是可靠的、准确的。

本发明具有以下有益效果：

本发明首次研究发现了猪体内HPSE基因表达量与PRRSV感染息息相关，HPSE可以通过切割细胞表面HS进而提高PRRSV感染率；PRRSV感染PAMs和Marc-145细胞后促进HPSE基因表达，从而抑制HS表达。因此HPSE基因可以作为一种新型的判定PRRSV抗性或易感性的方法；当HPSE表达量低时，猪对PRRSV具有抗性，反之易感。

本发明的发现为筛选抗蓝耳病猪以及PRRSV抗病育种奠定基础，对PRRSV抗性猪的筛选和培育具有很好的临床应用价值，对于猪蓝耳病的防控具有重要的意义。同时，本发明也为HPSE基因提供了一种新的应用。

附图说明

图1为通过共聚焦实验观察PRRSV感染Marc145细胞0、24、36 h后，硫酸乙酰肝素HS表达量的变化。

图2为PRRSV感染PAMs细胞后激活NF-κB信号通路；（A）PRRSV感染PAMs细胞后，使NF-κB信号通路p65亚基进入细胞核；（B）PRRSV感染PAMs细胞后，使NF-κB信号通路p65亚基表达量升高。

图3为PRRSV感染PAMs和Marc145细胞0、6、12、24、36 h后，使NF-κB信号通路IκBα亚基磷酸化升高，即激活NF-κB信号通路。

图4为PRRSV感染PAMs和Marc145细胞0、6、12、24、36 h后，HPSE编码的乙酰肝素酶Heparanase表达量逐渐升高。

图5为HPSE基因经siRNA S1、S2、S3干扰后，相对于NC对照组，表达量明显下降。

图6为HPSE基因经siRNA干扰后，PRRSV复制被抑制及病毒滴度降低；（A）HPSE基因经siRNA干扰后，PRRSV接毒，相对于NC对照组，HPSE干扰后抑制PRRSV N蛋白表达；（B）蛋白条带灰度扫描进一步验证HPSE干扰后抑制PRRSV N蛋白表达；（C）HPSE基因经siRNA干扰后，PRRSV接毒，相对于NC对照组，HPSE干扰后病毒滴度降低。

图7为HPSE基因工作原理示意图：PRRSV通过激活NF-κB信号通路来促进HPSE基因表达，使乙酰肝素酶Heparanase切割细胞膜上硫酸乙酰肝素HS，从而使PRRSV释放出来。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

本发明以下实施例的统计学分析：所有试验至少3次独立重复，结果采用平均值和标准误表示，使用单因素方差分析和T检测分析。所有统计分析均采用以P<0.05作为具有显著统计学差异的检验标准，分析软件为SPSS 16.0和GraphPad Prism 5。

实施例1 PRRSV感染抑制硫酸乙酰肝素HS表达

1、用含10%胎牛血清的DMEM培养基培养Marc-145细胞至汇合度60-70%，PBS洗1遍，换成含2%胎牛血清的DMEM培养基，并以MOI=0.1比例加入PRRSV于37℃、5% CO₂加湿培养箱中培养0、24、36 h。PBS洗3遍，4%多聚甲醛固定10 min，PBS洗10 min，10% Triton-100穿孔15 min，PBS洗10 min，然后用PBS稀释的1% BSA封闭30 min，加入抗HSPG2蛋白一抗（1：200稀释）4℃孵育过夜，抗鼠二抗作用（1：1000稀释）1 h，用DAPI染料染核5 min，PBS洗10 min。先在普通荧光倒置显微镜下检测硫酸乙酰肝素HS是否着色，然后在共聚焦显微镜下观察。

2、结果如图1所示，PRRSV感染Marc145细胞0、24、36 h后，硫酸乙酰肝素HS表达量逐渐下降。

实施例2 PRRSV感染激活NF-κB信号通路

1、分别用含10%胎牛血清的DMEM和RPMI 1640培养基培养Marc-145和PAMs细胞至汇合度60-70%，PBS洗1遍，换成含2%胎牛血清的DMEM和RPMI 1640培养基，并以MOI=0.1比例加入PRRSV于37℃、5% CO₂加湿培养箱中培养0、6、12、24、36 h。按上述方法分别对NF-κB信号通路p65亚基做共聚焦和qRT-PCR检测，并分别收集细胞对NF-κB信号通路IκBα亚基做Western Blot检测。

2、结果如图2和3所示，PRRSV感染PAMs细胞后，使NF-κB信号通路p65亚基进入细胞核（图2A），使NF-κB信号通路p65亚基表达量升高（图2B）；PRRSV感染PAMs和Marc-145细胞后，使NF-κB信号通路IκBα亚基磷酸化升高（图3）。

综上所述，PRRSV感染PAMs和Marc-145细胞后激活NF-κB信号通路。

实施例3 PRRSV感染促进HPSE基因表达

1、分别用含10%胎牛血清的DMEM和RPMI 1640培养基培养Marc-145和PAMs细胞至汇合度60-70%，PBS洗1遍，换成含2%胎牛血清的DMEM和RPMI 1640培养基，并以MOI=0.1比例加入PRRSV于37℃、5% CO₂加湿培养箱中培养0、6、12、24、36 h。分别收集细胞对HPSE基因编码的乙酰肝素酶Heparanase做Western Blot检测。

2、结果如图4所示，PRRSV感染PAMs（图4A）和Marc-145（图4B）细胞后，使HPSE基因编码的乙酰肝素酶Heparanase表达量逐渐升高。即PRRSV感染PAMs和Marc-145细胞后促进HPSE基因表达。

HPSE基因表达升高，乙酰肝素酶活性升高，进而切割HS，抑制PRRSV颗粒粘附在HS上，从而促进病毒释放。

实施例4 HPSE基因干扰

1、将设计好的3对HPSE siRNA及1对Negative Control （对照）送Thermo FisherScientific公司合成，使用Lipofectamine™ RNAiMAX转染试剂 (购自Thermo FisherScientific公司)。在2个6孔板中用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液培养PAMs细胞至60-70%密度，分别将siRNA（3对siRNA和1个对照）及Lipofectamine™ RNAiMAX用Opti-MEM^®Reduced Serum Medium稀释，稀释后按1:1比例混合并室温培养5 min，然后加入到换有新鲜RPMI 1640培养液的PAMs细胞上37℃、5% CO₂培养箱中培养6 h，弃上清，PBS洗1遍，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液继续培养48 h，收集细胞通过Western Blot实验验证HPSE干扰效果。另外一个6孔板培养48 h后，在培养基中加入PRRSV，再培养24 h，分别收集细胞和细胞上清通过Western Blot和TCID₅₀实验验证HPSE干扰后对PRRSV复制影响。

2、结果如图5所示，HPSE基因经siRNA干扰后，相对于对照组，3对siRNA都显著性地抑制了HPSE 蛋白表达。

HPSE基因干扰后，PRRSV接毒，结果如图6所示，相对于对照组，3对siRNA处理后，PRRSV N蛋白表达明显被抑制了（图6A）；通过灰度扫描发现，相对于NC对照组，siRNA S1、S2显著性地抑制PRRSV N蛋白表达（图6 B）；同时通过病毒滴度TCID₅₀测定发现，相对于NC对照组，siRNA S2显著抑制PRRSV病毒滴度（图6C）。

综上所述，HPSE基因经siRNA干扰后，PRRSV复制被抑制。

实施例5 HPSE基因过表达

1、构建pcDNA3.1-HPSE过表达载体，在2个6孔板中用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液培养PAMs细胞至60-70%密度，使用Lipofectamine™ 2000 （购自Thermo FisherScientific公司）分别将pcDNA3.1-HPSE和pcDNA3.1空载体转入PAMs细胞，在37℃、5% CO₂培养箱中培养6 h，弃上清，PBS洗1遍，用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液继续培养48 h，收集细胞检测过表达效果。另外一个6孔板培养48 h后，在培养基中加入PRRSV，再培养24h，收集细胞检测HPSE过表达后对PRRSV复制影响。

2、结果显示，相对于pcDNA3.1空载体对照组，pcDNA3.1-HPSE转染PAMs细胞后使HPSE表达量升高；同时，HPSE过表达后，相对于对照组，pcDNA3.1-HPSE处理组使PRRSV N蛋白表达量升高，表明PRRSV病毒感染升高。

另外，经过大量的研究显示，HPSE基因调节PRRSV释放的工作原理如附图7所示。PRRSV通过激活NF-κB信号通路来促进HPSE基因表达，使乙酰肝素酶Heparanase切割细胞膜上硫酸乙酰肝素HS，从而使PRRSV释放出来。

实施例6 HPSE基因在筛选抗蓝耳病猪中的应用

1、选取我国地方品种通城猪、梅山猪及国外品种长白猪、大白猪作为实验对象，验证本发明利用HPSE基因筛选抗蓝耳病猪的方法。

其中，已知通城猪和梅山猪对蓝耳病毒不易感，即具有抗性；而长白猪和大白猪对蓝耳病毒更易感。

2、实验方法

选择通城猪、梅山猪、长白猪、大白猪各6头，每3头1组，即分成2组，其中1组进行PRRSV攻毒，另外1组不做任何处理（对照），分别在攻毒前1 d和攻毒后第7、14、21、28 d采血，对照组同步采血，第28 d处死，采集肺、淋巴结组织。

取一部分血清进行TCID₅₀测定，剩余血清及肺、淋巴结组织提取RNA、反转，对HPSE基因及PRRSV N蛋白进行qRT-PCR检测，并对肺组织做病理切片。

根据TCID₅₀、PRRSV N蛋白表达水平及肺组织病理切片确定通城猪、梅山猪及国外品种长白猪、大白猪对PRRSV感染力，根据HPSE基因表达水平研究其与4种品种猪对PRRSV感染力关系。

3、根据结果可判断，通城猪和梅山猪对蓝耳病毒不易感，而长白猪和大白猪对蓝耳病毒更易感。

同时，HPSE基因表达水平检测结果显示，通城猪和梅山猪体内HPSE基因表达水平显著低于长白猪和大白猪。

SEQUENCE LISTING

<110> 中山大学

<120> HPSE基因在筛选抗蓝耳病猪中的应用

<130> 2016

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<170> PatentIn version 3.3

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<212> DNA

<213> 人工序列

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aaccatagac ggcaacctgg 20

<210> 2

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<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

tctcaggtat gcgggagaca 20

Claims

1.一种检测HPSE基因表达水平的试剂在制备筛选抗蓝耳病猪制剂中的应用，其特征在于，通过检测猪体内序列号为NM_001146130.2的猪HPSE基因的表达水平，HPSE表达量低时，猪对蓝耳病毒具有抗性；反之具有易感性。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，检测猪HPSE基因的表达水平的引物组包括上游引物HPSE-F和下游引物HPSE-R，序列分别如SEQ ID NO.1～2所示。