CN111443200B - 一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒的夹心elisa定量检测法 - Google Patents
一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒的夹心elisa定量检测法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒夹心定量ELISA检测法及其应用。本发明基于硫酸乙酰肝素(heparan sulfate，HS)包被板，通过反应条件的优化，建立了猪圆环病毒2型(porcine type 2，PCV2)病毒样颗粒(VLPs)定量的夹心ELISA方法(PCV2 VLPs HS‑ELISA)。该方法利用PCV2 VLPs作为标准品建立了用于定量的标准曲线，检测最低浓度约62.5ng/ml，相关系数R2为0.998，具有操作简单、定量准确性好、灵敏度高等特点，可用于PCV2 VLPs的夹心ELISA快速定量及组装效率评价。
Description
技术领域
本发明涉及一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒夹心定量ELISA检测法及其应用，属于动物疾病诊断和生物制品领域。
背景技术
猪圆环病毒（Porcine type 2，PCV2）是一种无囊膜的单链环状DNA病毒，属于圆环病毒科，被认为是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（Postweaning multisystemic wastingsyndrome, PMWS）、猪皮炎肾病综合征等的主要病原体，PCV2能损伤猪免疫系统，引起猪严重的免疫抑制，常与其他病原体（猪蓝耳病毒、猪细小病毒、猪链球菌等）多重感染和混合感染，给养猪业造成重大经济损失。PCV2呈现全球性分布，PCV2感染猪的典型临床症状为体表皮肤出现丘疹或者不规则的红紫斑、精神不振等，在保育猪中，最常见的是呼吸道综合征，引起生长缓慢、厌食等不良情况。在妊娠期的母猪中，主要引起繁殖性障碍，产生死胎或者流产等情况。在部分临床案例中，PCV2的感染不产生明显症状。
疫苗是防御PCV2 感染的最有效手段之一，目前市场上销售的病毒样颗粒亚单位疫苗主要品牌有勃林格殷翰、普莱柯和武汉中博等，其主要抗原为PCV2 Cap蛋白或基于PCV2 Cap组装形成的PCV2病毒样颗粒（virus-like particles, VLPs），能够具有很好的保护效果。然而在VLPs疫苗的生产和质量控制过程中，对于有效抗原的定量方式非常重要。目前在对PCV2 VLPs及Cap蛋白的鉴定及定量方式主要包括透射电子显微镜、分子筛色谱法、间接免疫荧光、超速离心法和夹心ELISA法等。
目前PCV2夹心ELISA的公开专利（猪圆环病毒2型双抗体夹心ELISA试剂盒及其应用，申请号201811095919.8）以及（识别PCV2病毒样颗粒的单克隆抗体及其在定性及定量检测PCV2病毒样颗粒中的应用，申请号201811261025.1）中都是基于将制备的鼠源单克隆抗体包被在96孔板中，建立双抗夹心ELISA方法，这些方法的技术关键是利用小鼠杂交瘤细胞技术筛选出合适的鼠源单抗，整个过程技术要求高、周期长。硫酸乙酰肝素（HeparanSulfate，HS）是PCV2 细胞受体。Misinzo G. 等报道PCV2或PCV2 VLPs可通过与细胞表面硫酸乙酰肝素（Heparan sulfate, HS）或者硫酸软骨素B（Chondroitin Sulfate B, CS-B）结合而侵染细胞（Misinzo G, Delputte PL, Meerts P, Lefebvre DJ, and Nauwynck HJ.Porcine circovirus 2 uses heparan sulfate and chondroitin sulfate Bglycosaminoglycans as receptors for its attachment to host cells. Journal ofvirology 2006;80 (7): 3487-3494.）。减少以上受体分子在细胞膜上的分布，将会明显抑制PCV2 的侵染。因此本发明将HS包被到96孔板，建立PCV2 VLPs夹心ELISA方法，缩短了新型夹心ELISA方法的研发周期，此法适用于PCV2 VLPs夹心ELISA快速定量及组装效率评价。
发明内容
本发明的目的是基于硫酸乙酰肝素（heparan sulfate，HS）包被板，通过反应条件的优化，建立了猪圆环病毒2型（porcine type 2，PCV2）病毒样颗粒（VLPs）定量的夹心ELISA方法（PCV2 VLPs HS-ELISA）用于PCV2 VLPs的夹心ELISA快速定量及组装效率评价。
本发明的技术方案
1. 本发明所述一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒夹心定量ELISA检测法，其特征在于该方法是基于硫酸乙酰肝素（heparan sulfate，HS）包被板，通过反应条件的优化，建立了猪圆环病毒2型（porcine type 2，PCV2）病毒样颗粒定量的夹心ELISA方法。
2. 本发明所述一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒夹心定量ELISA检测法，其特征在于该方法包括以下步骤：
（1）用pH 7.4的PBS将HS稀释至1 μg/mL，按每孔100 μL加入96孔板中包被12 h，弃去板中液体，用300 μL PBST洗涤5次，拍干剩余液体；
（2）加入100 μl BSA封闭液封闭 3 h，弃去板中液体，用300 μL PBST洗涤5次，拍干剩余液体；
（3）PCV2 VLPs进行不同倍数稀释后，分别加入孔中，于37 ℃反应60 min，弃去板中液体，用300 μL PBST洗涤5次，拍干剩余液体；
（4）将兔多抗按1:2000进行稀释后，分别加入孔中于37 ℃反应60 min，弃去板中液体，用300 μL PBST洗涤5次，拍干剩余液体；
（5）羊抗兔的酶标二抗按1: 7000稀释后于37 ℃反应30 min，弃去板中液体，用300 μL PBST洗涤5次，拍干剩余液体；
（6）加入50 μl TMB室温显色5 min；
（7）加入50 μl 2 M的H2SO4终止反应，OD450读数。P/N=（阳性实验孔OD值-空白孔OD值）/（阴性对照孔OD值-空白孔OD值），P/N的比值越大表明结果为最优，阴性孔OD450＜0.2且P/N>2时成立。
3. 本发明所述一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒夹心定量ELISA检测法，其特征在于该方法所述优化的反应条件为利用PCV2 VLPs作为标准品建立了用于定量的标准曲线，检测最低浓度约62.5 ng/mL，相关系数R2为0.998。
4. 本发明所述一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒夹心定量ELISA检测法，其特征在于该方法用于PCV2 VLPs的夹心ELISA快速定量及组装效率评价。
本发明的目的是通过以下方式实现的：
1. PCV2 VLPs的制备
基于构建好的pET-PCV2b-1B-cap_RCFP重组质粒，具体请参见发明人的另外一个专利（一种 PCV2 病毒样颗粒及其制备方法和裂解及 VLP 组装缓冲液，申请号201410145870.8）。利用上述专利的PCV2 Cap表达和VLPs组装体系，将PCV2 Cap蛋白通过大肠杆菌原核表达系统表达后再进行纯化，在经过SDS-PAGE进行电泳鉴定后（如图1所示），按上述专利中描述的方法在体外组装形成PCV2 VLPs（见文后附注）。将制备好的VLPs用GE公司的FPLC系统中的分子筛进行进一步纯化后将样本进行用透射电镜进行鉴定，结果如图2所示，将PCV2 VLPs作为后续夹心ELISA的标准样本。
2. 多克隆抗体的制备及鉴定
首次免疫时，将纯化后得到的 PCV2 VLPs与完全弗氏佐剂按1:1混合，作为抗原免疫健康的新西兰兔，每两周进行一次加强免疫，在后续加强免疫过程中，则是将PCV2 VLPs与不完全弗氏佐剂混匀后进行免疫，在总共完成三次免疫后，收集全血并分离收集上层的血清，利用Protein A柱纯化方案将血清中的兔多克隆抗体进行纯化，经IFA鉴定抗体特异性。
3. 夹心ELISA定量方法（PCV2 VLPs HS-ELISA）的建立
经HS特异性反应及HS反应时间确定、包被液及其浓度的确定、建立PCV2 VLPs定量的标准曲线建立起本发明所述的夹心ELISA定量方法（PCV2 VLPs HS-ELISA）的实施步骤：
（1）用pH 7.4的PBS将HS稀释至1 μg/mL，按每孔100 μl加入96孔板中包被12 h，弃去板中液体，用300 μL PBST洗涤5次，拍干剩余液体；
（2）加入100 μl BSA封闭液封闭3 h，弃去板中液体，用300 μL PBST洗涤5次，拍干剩余液体；
（3）PCV2 VLPs按不同倍数稀释后加入孔中，分别于37 ℃反应60 min，弃去板中液体，用300 μL PBST洗涤5次，拍干剩余液体；
（4）将兔多抗按1:2000进行稀释后，分别加入孔中于37 ℃反应60 min，弃去板中液体，用300 μL PBST洗涤5次，拍干剩余液体；
（5）羊抗兔的酶标二抗按1: 7000稀释后于37 ℃反应30 min，弃去板中液体，用300 μL PBST洗涤5次，拍干剩余液体；
（6）加入50 μLTMB室温显色5 min；
（7）加入50 μL 2 M的H2SO4终止反应，OD450读数。P/N=（阳性实验孔OD值-空白孔OD值）/（阴性对照孔OD值-空白孔OD值），P/N的比值越大表明结果为最优，阴性孔OD450＜0.2且P/N>2时成立。
本发明将HS包被到96孔板，建立PCV2 VLPs夹心ELISA方法，缩短了新型夹心ELISA方法的研发周期，此法适用于PCV2 VLPs夹心ELISA快速定量及组装效率评价。
本发明的技术效果
本发明涉及一种猪圆环病毒2型病毒样颗粒夹心定量ELISA检测法及其应用。本发明基于硫酸乙酰肝素（heparan sulfate，HS）包被板，通过反应条件的优化，建立了猪圆环病毒2型（porcine type 2，PCV2）病毒样颗粒（VLPs）定量的夹心ELISA方法（PCV2 VLPs HS-ELISA）。该方法利用PCV2 VLPs作为标准品建立了用于定量的标准曲线，检测最低浓度约62.5 ng/mL，相关系数R2为0.998，具有操作简单、定量准确性好、灵敏度高等特点，可用于PCV2 VLPs的夹心ELISA快速定量及组装效率评价。
附图说明
图1 PCV2 Cap蛋白亲和层析纯化图中M：Marker，S：上清总蛋白，F：流穿液，W：杂质洗脱液，E1-E6：目的蛋白洗脱液。
图2 PCV2 VLPs电镜结果。
图3 IFA鉴定图中A：PCV2 VLPs，B：阴性对照。
图4 PCV2 VLPs标准曲线。
具体实施方式
以下结合具体例证实验旨在进一步说明本发明，而非限制本发明。
1. PCV2 VLPs的制备
基于构建好的pET-PCV2b-1B-cap_RCFP重组质粒，具体请参见发明人的另外一个专利（一种 PCV2 病毒样颗粒及其制备方法和裂解及 VLP 组装缓冲液，申请号201410145870.8）。利用上述专利的PCV2 Cap表达和VLPs组装体系，将PCV2 Cap蛋白通过大肠杆菌原核表达系统表达后再进行纯化，在经过SDS-PAGE进行电泳鉴定后（如图1所示），按上述专利中描述的方法在体外组装形成PCV2 VLPs（见文后附注）。将制备好的VLPs用GE公司的FPLC系统中的分子筛进行进一步纯化后将样本进行用透射电镜进行鉴定，如图2所示，将PCV2 VLPs作为后续夹心ELISA的标准样本。
2. 多克隆抗体的制备
首次免疫时，将纯化后得到的 PCV2 VLPs与完全弗氏佐剂按1:1混合，采用多点皮下注射方式将PCV2 VLPs 作为抗原免疫健康的新西兰兔，剂量按500μg/只计算。每两周进行一次加强免疫，在后续加强免疫过程中，则是将PCV2 VLPs与不完全弗氏佐剂混匀后进行免疫，在总共完成三次免疫后，收集全血并分离收集上层的血清，利用Protein A柱纯化方案将血清中的兔多克隆抗体进行纯化，经IFA鉴定抗体特异性。
（2）IFA鉴定抗体特异性
将PK15细胞铺至48孔板中，待细胞长至60%～70%时，加入PCV2 VLPs孵育1 h后弃去上清，并用PBS润洗两遍，更换成新鲜的完全培养基，置于37 ℃、5% CO2的恒温培养箱中约24 h，吸走上清后用PBS润洗2遍，加入100 μl 4 %多聚甲醛进行固定约20 min，吸走上清后用PBS润洗2遍，加入100 μl 0.1% Triton 100，吸走上清后用PBS润洗两遍，并用3% BSA于室温封闭30 min，加入稀释后的兔多抗孵育1 h，吸走上清后用PBST洗五遍，每次5 min，加入FITC标记的驴抗兔荧光二抗避光孵育1 h后，吸走上清后用PBST洗5遍，每次3～5 min，在荧光显微镜下观察，结果如图3所示。
3. 夹心ELISA定量方法（PCV2 VLPs HS-ELISA）的建立
（1）HS特异性反应确定
1）用pH 7.4的PBS将HS稀释成1 μg/mL，并将BSA与PBS作为对照组，分别按每孔100μL加入96孔板中包被12 h，弃去板中液体，用300 μL PBST洗涤5次，拍干剩余液体；
2）分别加入100 μL BSA封闭液封闭3 h，弃去板中液体，用300 μL PBST洗涤5次，拍干剩余液体；
3）PCV2 VLPs按100 ng/孔加入后，于37 ℃反应30 min，弃去板中液体，用300 μLPBST洗涤5次，拍干剩余液体；
4）将兔多抗按1:2000进行稀释后，分别加入孔中于37 ℃反应60 min，弃去板中液体，用300 μL PBST洗涤5次，拍干剩余液体；
5）羊抗兔的酶标二抗按1: 7000稀释后于37 ℃反应30 min，弃去板中液体，用300μL PBST洗涤5次，拍干剩余液体；
6）加入50 μL TMB室温显色5 min；
7）加入50 μL 2M的H2SO4终止反应，OD450读数。
（2）包被液确定
1）用pH 9.6的碳酸盐和pH 7.4的PBS将HS稀释成1 μg/mL，按每孔100 μL加入96孔板中包被12 h，弃去板中液体，用300 μL PBST洗涤5次，拍干剩余液体；
2）分别加入100 μL BSA封闭液封闭3 h，弃去板中液体，用300 μL PBST洗涤5次，拍干剩余液体；
3）PCV2 VLPs按100 ng/孔加入后，于37℃反应30 min，弃去板中液体，用300 μLPBST洗涤5次，拍干剩余液体；
4）将兔多抗按1:2000进行稀释后，分别加入孔中于37 ℃反应60 min，弃去板中液体，用300 μL PBST洗涤5次，拍干剩余液体；
5）羊抗兔的酶标二抗按1: 7000稀释后于37 ℃反应30 min，弃去板中液体，用300μL PBST洗涤5次，拍干剩余液体；
6）加入50 μL TMB室温显色5 min；
7）加入50 μL 2 M的H2SO4终止反应，OD450读数。P/N=（阳性实验孔OD值-空白孔OD值）/（阴性对照孔OD值-空白孔OD值），P/N的比值越大表明结果为最优，阴性孔OD450＜0.2且P/N>2时成立。
（3）HS包被浓度确定
1）用pH7.4的PBS将HS稀释，分别按每孔0 ng、100 ng、200 ng、400 ng、600 ng加入96孔板中包被12 h，弃去板中液体，用300 μL PBST洗涤5次，拍干剩余液体；
2）.加入100μL BSA封闭液封闭3 h，弃去板中液体，用300 μL PBST洗涤5次，拍干剩余液体；
3）PCV2 VLPs按100 ng/孔加入后，于37 ℃反应30 min，弃去板中液体，用300 μLPBST洗涤5次，拍干剩余液体；
4）将兔多抗按1:2000进行稀释后，分别加入孔中于37 ℃反应60 min，弃去板中液体，用300 μL PBST洗涤5次，拍干剩余液体；
5）羊抗兔的酶标二抗按1: 7000稀释后于37 ℃反应30 min，弃去板中液体，用300μL PBST洗涤5次，拍干剩余液体；
6）加入50 μL TMB室温显色5 min；
7）加入50 μL 2 M的H2SO4终止反应，OD450读数。P/N=（阳性实验孔OD值-空白孔OD值）/（阴性对照孔OD值-空白孔OD值），P/N的比值越大表明结果为最优，阴性孔OD450＜0.2且P/N>2时成立。
（4）HS反应时间确定
1）用pH 7.4的PBS将HS稀释至1 μg/mL，按每孔100 μL加入96孔板中包被12 h，弃去板中液体，用300 μL PBST洗涤5次，拍干剩余液体；
2）加入100 μL BSA封闭液封闭3 h，弃去板中液体，用300 μL PBST洗涤5次，拍干剩余液体；
3）PCV2 VLPs按100 ng/孔加入后，分别于37 ℃反应30 min、45 min、60 min，弃去板中液体，用300 μL PBST洗涤5次，拍干剩余液体；
4）将兔多抗按1:2000进行稀释后，分别加入孔中于37 ℃反应60 min，弃去板中液体，用300 μL PBST洗涤5次，拍干剩余液体；
5）羊抗兔的酶标二抗按1: 7000稀释后于37 ℃反应30 min，弃去板中液体，用300μL PBST洗涤5次，拍干剩余液体；
6）加入50 μL TMB室温显色5 min；
7）加入50 μL 2 M的H2SO4终止反应，OD450读数。P/N=（阳性实验孔OD值-空白孔OD值）/（阴性对照孔OD值-空白孔OD值），P/N的比值越大表明结果为最优，阴性孔OD450＜0.2且P/N>2时成立。
（5）建立PCV2 VLPs定量的标准曲线
将PCV2 VLPs浓度调整至4μg/mL，随后进行2倍梯度稀释，得到不同浓度的PCV2VLPs标准品，用于建立PCV2的标准曲线进行后续定量。
1）用pH 7.4的PBS将HS稀释至1 μg/mL，按每孔100 μL加入96孔板中包被12 h，弃去板中液体，用300 μL PBST洗涤5次，拍干剩余液体；
2）加入100 μL BSA封闭液封闭3 h，弃去板中液体，用300 μL PBST洗涤5次，拍干剩余液体；
3）将梯度稀释的PCV2 VLPs加入后，分别于37 ℃反应60 min，弃去板中液体，用300 μL PBST洗涤5次，拍干剩余液体；
4）将兔多抗按1:2000进行稀释后，分别加入孔中于37 ℃反应60 min，弃去板中液体，用300 μL PBST洗涤5次，拍干剩余液体；
5）羊抗兔的酶标二抗按1: 7000稀释后于37 ℃反应30 min，弃去板中液体，用300μL PBST洗涤5次，拍干剩余液体；
6）加入50 μL TMB室温显色5 min；
7）加入50 μL 2 M的H2SO4终止反应，OD450读数。
8）将不同PCV2 VLPs浓度对应的OD值输入Excel中进行曲线拟合，得到对应的浓度与OD值换算公式。
（6）不同批次PCV2 VLPs的定量检测应用
将不同批次纯化后组装的PCV2 VLPs，用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定PCV2 VLPs浓度，再将PCV2 VLPs浓度稀释至线性范围内，用HS-ELISA法进行检测，将HS-ELISA法测定得到的OD值按拟合得到的标准曲线计算对应样本的浓度，与BCA蛋白浓度试剂盒检测得到的结果进行分析，统计两种浓度定量方法的差异。
4. 实验结果
（1）蛋白纯化
通过镍柱亲和层析纯化得到纯化后的PCV2 Cap，结果如图1所示，经过亲和层析纯化后，用SDS-PAGE进行分析后，成功纯化了PCV2 Cap蛋白，纯化蛋白大小与预期蛋白分子量大小一致。
（2）VLPs鉴定
在组装成VLPs后，将样本用钨磷酸进行负染后，利用透射电镜进行鉴定，电镜鉴定结果显示PCV2 VLPs的形态大小均一，直径约17 nm（见图2）。
（3）IFA鉴定抗体特异性
将PCV2 VLPs与PK15细胞孵育后，通过IFA实证明制备的兔源多克隆抗体与制备的PCV2 VLPs能发生特异性反应（见图3A），并且阴性对照无明显信号（见图3B），说明我们制备的兔源多克隆抗体是有效的，且能够特异性识别。
（4）HS特异性反应确定
通过将BSA与PBS作为对照组与HS分别包被到96孔板上，加入PCV2 VLPs进行特异性反应测试，结果如表1所示，发现HS能够特异性的与PCV2 VLPs发生反应，可以用于后续建立PCV2夹心ELISA定量方法的建立。
表1 特异性反应的确定
| 包被类型 | HS | BSA | PBS |
| 阳性OD值 | 1.189 | 0.264 | 0.212 |
| 阴性OD值 | 0.068 | 0.068 | 0.062 |
| P/N值 | 17.485 | 3.882 | 3.459 |
（5）包被液确定
用PBS和pH9.6的碳酸盐分别将HS稀释后进行包被后，进行后续反应，确定最优反应条件，通过计算最终反应的阳性对照OD值与阴性对照OD值，即P/N值，发现用PBS稀释HS后进行包被，结果如表2所示，反应后计算得到的P/N值较高，确定最佳包被液为PBS。
表2 不同包被液的效果比较
| 包被液 | PBS | 碳酸盐 |
| 阳性OD值 | 1.834 | 1.721 |
| 阴性OD值 | 0.077 | 0.076 |
| P/N值 | 23.818 | 22.644 |
（6）HS包被浓度确定
将HS用PBS稀释后，按每孔0 ng、100 ng、200 ng、400 ng、600 ng加入到96孔板中包被12 h后，进行后续反应，通过计算最终反应的阳性对照OD值与阴性对照OD值，即P/N值，结果如表3所示，发现HS包被量为每孔200 μg时得到的P/N相对较高，考虑到包被量为每孔100 ng与200 ng成倍增加，但100 ng与200 ng的包被量得到的反应结果差异不显著，综合考虑，因此后续依然采用的包被量为每孔100 μg。
表3 HS包被浓度确定
（7）HS反应时间确定
在包被了HS的96孔板上，将PCV2 VLPs按100 ng/孔加入后，分别于37 ℃反应30min、45 min、60 min，再进行后续反应，通过计算最终反应的阳性对照OD值与阴性对照OD值，即P/N值，结果如表4所示发现PCV2 VLPs与HS的反应时间为60 min时得到的P/N值相对较高，因此确定PCV2 VLPs与HS的反应时间为60 min。
表4 HS反应时间确定
| 反应时间 | 30 min | 45 min | 60 min |
| 阳性OD值 | 0.416 | 0.709 | 1.324 |
| 阴性OD值 | 0.058 | 0.059 | 0.058 |
| P/N值 | 7.172 | 12.017 | 22.828 |
（8）PCV2 VLPs标准曲线的建立
将PCV2 VLPs分别作为标准样本，依次梯度稀释后加入到包被了HS的96孔中进行反应，建立标准曲线，并将应浓度的OD值与对应的浓度进行统计学分析，用Excel拟合趋势线，计算后得到相应的公式，发现浓度在0～2 μg/mL时具有良好的统计学关系，如图4得到的VLPs定量计算公式为y=稀释倍数×0.043e0.444x，相关系数R2为0.998，待检样本中浓度的检测下限约62.5 ng/mL。
（9）不同批次PCV2 VLPs的定量检测应用
以三个不同批次的PCV2 VLPs样本为例，BCA定量后浓度分别为180μg/mL、230μg/mL、500 μg/mL，用HS-ELISA检测后，根据得到的OD值与相应的标准曲线计算不同批次样本的浓度，进行统计学分析其上下浮动范围均小于5%。
PCV2 VLPs的制备（CN104073473, 2016.03.23）：
1．PCV2b-1B-cap的合成和重组质粒构建
因为野生型全长Cap蛋白很难表达，所以我们先通过对所有的PCV2基因型序列比对，找出最具代表型的全长Cap基因序列，然后根据大肠杆菌密码子的偏好性，优化并合成了一条PCV2核衣壳蛋白基因典型序列PCV2b-1B-cap。将PCV2b-1B-cap与表达质粒pET100_D/TOPO（美国Invitrogen公司）载体重组构成pET-PCV2b-1B-cap_RCFP重组质粒，插入位点在工程质粒的TOPO区，酶切位点N端为Nde I，C端为BamH I。
2．pET-PCV2b-1B-cap_RCFP重组质粒转化大肠杆菌BL21
1）取100μL BL21（DE3）感受态置于冰上解冻，加入lμL（约l0ng）重组质粒，并用枪头轻轻搅拌混匀。混匀后的感受态置于冰上30分钟。
2）静置于42℃水浴锅中热激60s。快速转到冰浴中，冷却1-2分钟。加入900 μL的SOC培养基，混匀。37℃，230rpm震荡培养45分钟。
3）取50μL转化液涂于含有100μg/mL Amp+的LB培养板中，37℃倒置培养12-16h。
3．IPTG诱导PCV2核衣壳蛋白表达的条件探索
1）随机挑取单克隆接种于l0mL含有100μg/mL Amp+的LB培养液中，37℃，230rpm震荡过夜扩增培养。
2）按1:100吸取100μL过夜培养的菌液至l0mL含有100μg/mL Amp+的LB培养液中，37℃，250rpm震荡培养至OD600达到1.0。
3）吸取1mL菌液，10,000g离心1分钟，去除上清，加入200μL2xSDS-PAGE samplebuffer充分悬浮细胞沉淀，细菌沉淀立即-20℃保存（为阴性对照样品）。
4）温度调整为30℃，加入IPTG使得体系中IPTG浓度为1mM，诱导表达后在3h、6h分别吸取2mL菌液，分装至4个1.5mL离心管（3h-l，3h-2，6h-l，6h-2），10,000r/分钟离心2分钟，去除上清，细菌沉淀（蛋白样品）-20℃保存。
4．PCV2核衣壳蛋白可溶性分析
1）将上述第3点诱导表达3h、6h时获取的细菌沉淀（3h-l，6h-l）用500μL本发明的裂解及组装缓冲液中重悬，（3h-2，6h-2）用400μL本发明的裂解及组装缓冲液中重悬，冰上静置反应10分钟，然后样品进行超声裂解，超声5s，停5s，15%振幅共超声10分钟（冰上操作）。
2）将超声后的3h-2，6h-2裂解样品加100μL5×SDS-PAGE sample buffer，将沉淀吹打数次以充分溶解。煮沸5分钟。此样品为表达的总蛋白样品，用于SDS-PAGE分析。
3）样品3h-l，6h-l，4℃离心18,000g，10分钟。将上清液450 μL转移至新的无菌离心管，置于冰上保存。取50μL上清液样品进行电镜观察；400 μL样品加100μL5×SDS-PAGEsample buffer煮沸5分钟，此样品为可溶性上清样品，用作后续SDS-PAGE电泳分析。
4）将步骤3）中，样品3h-l，6h-l离心后的细胞沉淀部分用1mL PBS缓冲液重悬，18,000g4℃离心5分钟，去除上清液（目的：去掉沉淀中的可溶性蛋白质组分）。加500μL1×SDS-PAGE sample buffer，将沉淀吹打数次以充分溶解。煮沸5分钟。沉淀重悬液进行超声裂解，超声5s，停5s，15%振幅共超声10分钟，确保样品不粘稠。此样品为不可溶性蛋白样品，用做后续SDS-PAGE电泳分析。
5）将上述步骤中保存的样品进行SDS-PAGE电泳分析，检查目标蛋白的表达及可溶性情况。
5．PCV2核衣壳蛋白大规模诱导表达
1）随机挑取单克隆接种于l0mL含有100μg/mL Amp+的LB培养液中，37℃，230rpm震荡过夜扩增培养。
2）按1:1000吸取1mL过夜培养的菌液至1L含有100 μg/mL Amp+的LB培养液中，37℃，250rpm震荡培养至OD600达到1.0。
3）加入IPTG使得体系中IPTG浓度为1mM，30℃，250rpm诱导表达6h，8,000g离心10分钟，去除上清，细菌沉淀-20℃保存。
6．PCV2核衣壳蛋白的镍柱纯化
1）取20mL本发明裂解及组装缓冲液重悬细菌沉淀（200mL培养物）静置冰上反应10分钟。
2）将样品进行超声裂解，30%幅度，超声5s，停5s，共超声10分钟，确保样品不粘稠。18,000 g、4℃离心20分钟，吸取上清液转移至新的无菌离心管，置于冰上保存。
3）将上清液加入到2mL Ni-NTA His·Bind树脂中，4℃轻微震荡结合60分钟。
4）将含有填料的上清转移至柱子中，将流穿液（flow though）再过柱子一次，收集流穿液保存用于SDS-PAGE电泳分析。
5）以5倍柱体积洗涤液（wash buffer）漂洗。
6）按填料体积的10倍加入洗脱液（elution buffer）洗脱目的蛋白，用2mL离心管进行收集每管收集2mL，4℃或冰上保存。
7）用大量PBS冲洗填料，最后等体积加入20%乙醇保存，保存树脂填料。
8）将上述步骤收集的样品取少部分加入SDS sample buffer，煮沸，进行蛋白变性处理然后SDS-PAGE分析蛋白纯化情况。
7．PCV2病毒样颗粒组装
1）将步骤6纯化的蛋白进行蛋白浓度测定，BCA法或紫外分光光度法。
2）将浓度大于0.5mg/mL的蛋白样品转移至透析袋中，放入裂解及组装缓冲液中进行隔夜透析，第二天进行电镜观察。
Claims (3)
1.一种非诊断目的的猪圆环病毒2型病毒样颗粒夹心定量ELISA检测法，其特征在于该方法是基于硫酸乙酰肝素（heparan sulfate，HS）包被板，纯化的猪圆环病毒多克隆抗体，羊抗兔的酶标抗体，通过反应条件的优化，建立了猪圆环病毒2型（porcine type 2，PCV2）病毒样颗粒定量的夹心ELISA方法；
所述反应条件的优化是利用PCV2 VLPs作为标准品建立了用于定量的标准曲线，检测最低浓度62.5 ng/mL，相关系数R2为0.998。
2.如权利要求1所述一种非诊断目的的猪圆环病毒2型病毒样颗粒夹心定量ELISA检测法，其特征在于该方法包括以下步骤：
（1）用pH 7.4的PBS将HS稀释至1 μg/mL，按每孔100 μL加入96孔板中包被12 h，弃去板中液体，用300 μL PBST洗涤5次，拍干剩余液体；
（2）加入100 μL BSA封闭液封闭3 h，弃去板中液体，用300 μL PBST洗涤5次，拍干剩余液体；
（3）PCV2 VLPs进行不同倍数稀释后，分别加入孔中，于37 ℃反应60 min，弃去板中液体，用300 μL PBST洗涤5次，拍干剩余液体；
（4）将猪圆环病毒多克隆抗体按1:2000进行稀释后，分别加入孔中于37 ℃反应60min，弃去板中液体，用300 μL PBST洗涤5次，拍干剩余液体；
（5）羊抗兔的酶标二抗按1: 7000稀释后于37 ℃反应30 min，弃去板中液体，用300 μLPBST洗涤5次，拍干剩余液体；
（6）加入50 μL TMB室温显色5 min；
（7）加入50 μL 2 M的H2SO4终止反应，OD450读数；P/N=（阳性实验孔OD值-空白孔OD值）/（阴性对照孔OD值-空白孔OD值），P/N的比值越大表明结果为最优，阴性孔OD450＜0.2且P/N>2时成立。
3.如权利要求1所述一种非诊断目的的猪圆环病毒2型病毒样颗粒夹心定量ELISA检测法，其特征在于该方法用于PCV2 VLPs的夹心ELISA快速定量及组装效率评价。
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