CN110887963A

CN110887963A - 一种pcv2病毒样颗粒夹心定量elisa检测法及其应用

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Publication number: CN110887963A
Application number: CN201911162737.2A
Authority: CN
Inventors: 王乃东; 邹亚文; 杨毅; 王东亮; 湛洋; 杨文兵; 董彦鹏; 于浩洋
Original assignee: Procell Biotechnology Co ltd; Jiangsu Nannong Hi Tech Co ltd; Hunan Agricultural University
Current assignee: Procell Biotechnology Co ltd; Jiangsu Nannong Hi Tech Co ltd; Hunan Agricultural University
Priority date: 2019-11-25
Filing date: 2019-11-25
Publication date: 2020-03-17
Anticipated expiration: 2039-11-25
Also published as: CN110887963B

Abstract

本发明涉及一种PCV2病毒样颗粒夹心定量ELISA检测法及其应用。利用猪圆环病毒2型PCV2d VLPs免疫小鼠，筛选杂交瘤细胞，制备的抗体可以特异性识别PCV2(PCV2b、PCV2d均可识别)，可用于WB、IFA等PCV2相关检测；利用该抗体包被ELISA检测时发现不与Cap蛋白发生反应，能够用于区分VLPs和Cap。基于该单克隆抗体经过一系列反应条件的优化建立了夹心ELISA，可用于PCV2 VLPs的特异性定量以及定性，检测最低浓度可达到62.5ng/ml，灵敏度高，相关系数R²为0.992，定量准确性好，适用于PCV2b与PCV2d VLPs的定量，可应用于PCV2不同基因型VLPs的定量、组装效率鉴定以及PCV2病毒侵染鉴定。

Description

一种PCV2病毒样颗粒夹心定量ELISA检测法及其应用

技术领域

本发明涉及一种PCVd病毒样颗粒夹心定量ELISA检测法及其应用，属于动物疾病诊断和生物制品领域。

背景技术

猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2，PCV2)是猪皮炎肾病综合征、断奶仔猪多系统衰竭综合征和繁殖障碍综合征的主要病原体，对养猪行业具有重要的经济效益影响。PCV2基因组约1.7Kb，属于单股正链环状DNA病毒，包含两个主要的开放阅读框，ORF2编码病毒核衣壳蛋白(Cap)，ORF1编码与病毒复制有关的Rep蛋白。病毒核衣壳(Capsid)是由60个Cap蛋白亚基组成的正二十面体，无囊膜，其粒子直径约17nm，

目前采用疫苗作为预防方式进行防控，当前市场疫苗主要包括勃林格殷翰、武汉中博以及扬州优邦等利用杆状病毒系统生产的PCV2病毒样颗粒(virus-like particles,VLPs)亚单位疫苗，南农高科技股份有限公司生产的PCV2 SH株灭活疫苗，普莱柯利用大肠杆菌表达系统生产的PCV2 VLPs亚单位疫苗。其中PCV2 VLPs亚单位疫苗是由PCV2 Cap蛋白组装而形成，不含病毒核酸，不具有感染性，而且能够产生很好的保护效果。

目前PCV2 VLPs的鉴定方式包括透射电子显微镜、分子筛色谱法、细胞间接免疫荧光法等。透射电子显微镜仪器价格昂贵，操作程序过多，需要专业的技术人员才能够进行熟练操作拍到清晰的图像资料，只能观察VLPs的轮廓。但是不能用于VLPs的准确定量。PCV2VLPs是由60个Cap亚基组装形成的正二十面体，其分子量大，在分子筛中对应的紫外吸收峰很早就出现，因此可以通过读取仪器提供的紫外吸收峰图来判定样本中是否含有PCV2VLPs。在PCV2 VLPs的鉴定中也可以利用间接免疫荧光对PCV2 VLPs进行鉴定。当PCV2 Cap未形成VLPs的时候，无法进入细胞内部，在PCV2 Cap组装形成VLPs后，VLPs即可进入细胞内部，随后进行间接免疫荧光等相关操作，如果发现细胞呈现阳性信号，即可判断样本中含有PCV2 VLPs，该方法能够鉴定判定VLPs的存在，但不适合定量分析。

在PCV2 VLPs定量方面，目前还缺乏有效的手段区分VLPs和Cap的含量，检测灵敏度偏低，一般情况下，利用夹心ELISA定量得到的结果是VLPs和Cap两者混合后总体的浓度，也无法同时对PCV2不同基因型的VLPs进行定量，缺乏一种能够分辨VLPs和Cap又能在PCV2不同基因型中对VLPs进行定量的夹心ELISA方法。在现有专利(猪圆环病毒2型双抗体夹心ELISA试剂盒及其应用，申请号201811095919.8)的描述中，利用PCV2 Cap蛋白制备单克隆抗体，该单抗在Western Blot中不识别Cap单个亚基的线性表位，建立双抗夹心ELISA，能对PCV2半成品灭活疫苗进行定量，最低检测值为3μg/ml，但由于VLPs亚单位疫苗是由Cap蛋白在体外组装形成，其中包含的Cap蛋白对定量的影响无法排除，不适用于PCV2 VLPs亚单位疫苗的定量。在另外一个现有专利(识别PCV2病毒样颗粒的单克隆抗体及其在定性及定量检测PCV2病毒样颗粒中的应用，申请号201811261025.1)的描述中，通过制备PCV2 VLPs制备单克隆抗体，该单抗在Western Blot中不识别Cap单个亚基的线性表位，利用间接ELISA证明所含的单克隆抗体仅与组装正确的VLP发生特异性抗原抗体反应，但未采用夹心ELISA确认是否能够区分VLPs和Cap蛋白，利用该单抗建立的双抗夹心ELISA最低检测下限为146.48ng/ml。

发明内容

本发明的目的在于：将PCV2d作为免疫原采用多次免疫方式制备单克隆抗体，该单抗在Western Blot中能识别Cap单个亚基的线性表位，在建立的双抗夹心ELISA体系中，能够区分VLPs和Cap，且对于PCV2b与PCV2d不同基因型的均能适用，最低检测下限为62.5ng/ml，为后续PCV2b和PCV2d VLPs疫苗的准确定量及质量控制提供基础。

本发明的技术方案

1.一种PCV2病毒样颗粒夹心定量ELISA检测法，其特征在于该检测法包括以下步骤：

(1)用pH 9.6的碳酸盐将能够有效识别PCV2b和PCV2d的Cap蛋白氨基酸序列，反应呈强阳性的单抗1A6按1:8000稀释，按每孔100μl加入96孔板中包被12h，弃去板中液体，用300μl PBST洗涤5次，拍干剩余液体；

(2)分别加入100μl BSA封闭3h，弃去板中液体，用300μl PBST洗涤5次，拍干剩余液体；

(3)PCV2d VLPs按100ng/孔加入后，于37℃反应60min，弃去板中液体，用300μlPBST洗涤5次，拍干剩余液体；

(4)将兔多抗按1:2000进行稀释后，分别加入孔中于37℃反应60min，弃去板中液体，用300μl PBST洗涤5次，拍干剩余液体；

(5)羊抗兔的酶标二抗按1:7000稀释后于37℃反应30min，弃去板中液体，用300μlPBST洗涤5次，拍干剩余液体；

(6)加入50μl TMB室温显色5min；

(7)加入50μl 2M的H₂SO₄终止反应，OD₄₅₀读数。

2.本发明所述一种PCV2d毒样颗粒夹心定量ELISA检测法，其特征在于所述的单抗1A6来源的阳性单克隆细胞系被命名为小鼠杂交瘤单克隆细胞1A6株：该细胞株已于2019年11月01日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所菌种保藏中心保藏，保藏号为CGMCC No.18844。

3.本发明所述一种PCV2病毒样颗粒夹心定量ELISA检测法，其特征在于所述的PCV2d VLPs是利用上述两个专利的Cap表达和VLPs构建体系，分别表达PCV2 Cap，通过镍柱亲和层析技术将PCV2 Cap进行纯化，通过SDS-PAGE进行电泳鉴定后，体外组装成相应的VLPs。

4.本发明所述一种PCV2病毒样颗粒夹心定量ELISA检测法，其特征在于其中的兔多抗是将纯化后得到的PCV2d VLPs与弗氏佐剂按1:1混合，免疫家兔获得的血清，并对血清中的IgG进行纯化而成。

5.本发明所述一种PCV2病毒样颗粒夹心定量ELISA检测法，其特征在于其中的羊抗兔的酶标二抗是商品化的产品。

6.本发明所述一种PCV2病毒样颗粒夹心定量ELISA检测法，其特征在于该检测法可用于PCV2 VLPs的特异性定量以及定性，检测最低浓度可达到62.5ng/ml，灵敏度高，相关系数R²为0.992，定量准确性好，

7.本发明所述一种PCV2病毒样颗粒夹心定量ELISA检测法，其特征在于该检测法可适用于PCV2b与PCV2d VLPs的定量，可应用于PCV2不同基因型VLPs的定量、组装效率鉴定以及PCV2病毒侵染鉴定。

8.本发明所述一种PCV2病毒样颗粒夹心定量ELISA检测法，其特征在于该检测法可应用于PCV2不同基因型VLPs的定量、组装效率鉴定以及PCV2病毒侵染鉴定。

本发明的有益效果

本发明涉及的生物资源信息

本发明所涉及的单抗1A6来源的阳性单克隆细胞系被命名为小鼠杂交瘤单克隆细胞1A6株：该细胞系已于2019年11月01日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所菌种保藏中心保藏，保藏号为CGMCC No.18844。

附图说明

图1 PCV 2d Cap蛋白纯化结果图中M：Marker，T：上清总蛋白，FT：流穿液,W：杂质洗脱液，E1-E5：目的蛋白洗脱液，其结果显示按照亲和层析的纯化方法，SDS-PAGE分析成功纯化了PCV2d cap蛋白，纯化蛋白大小与预期蛋白分子量大小一致。

图2 FPLC的洗脱峰图如图所示，对应单一洗脱峰收集的流穿液为100％纯度的VLPs。

图3 PCV 2d病毒样颗粒电镜结果图中显示病毒样颗粒的形态、大小及浓度基本一致。

图4 PCV2不同基因型WB结果图中M：Marker，1：大肠杆菌总蛋白阴性对照，2：PCV2dVLPs，2：PCV2b VLPs。

图5 PCV2不同基因型IFA结果其中，A：PCV2b,B：PCV2d，C：阴性对照。

图6夹心ELISA检测PCV2 VLPs与Cap的情况图中，1：PCV2b Cap,2：PCV2b VLP,3：PCV2d Cap，4：PCV2d VLP，5：阴性对照。

发明具体实施方式

一、PCV2 Cap蛋白与VLPs的制备

通过常规方法构建pET-PCV2b-1B-Cap和pET-PCV2d-Cap重组质粒，PCV2b-1B和PCV2d Cap的序列和构建方法具体请参见发明人的另外两个专利(一种PCV2病毒样颗粒及其制备方法和裂解及VLP组装缓冲液，申请号201410145870.8以及猪圆环病毒2d型病毒样颗粒疫苗及其制备方法，申请号201810144099.0)。利用上述两个专利的Cap表达和VLPs构建体系，分别表达PCV2 Cap，通过镍柱亲和层析技术将PCV2 Cap进行纯化，通过SDS-PAGE进行电泳鉴定后(如图1所示)，体外组装成相应的VLPs。将制备好的VLPs用GE公司的FPLC系统进行进一步鉴定，收集单一峰图(如图2所示)对应的流穿液，得到纯度为100％的VLPs，同时将样本进行负染后用电镜进行鉴定，如图3所示，均为大小均一完整的VLPs，作为后续单克隆抗体制备和夹心ELISA的标准样本。

二、多克隆抗体及单克隆抗体的制备

1.多克隆抗体制备

选用健康的新西兰兔，将纯化后得到的PCV2d VLPs与弗氏佐剂按1:1混合，采用多点免疫方式，皮下注射PCV2d VLPs 500μg/只，三次免疫后，收集全血于4℃放置4h后，1000g离心10min，收集上层的血清，按GE公司的Protein A柱说明书要求对血清中的IgG进行纯化。

2.单克隆抗体细胞系建立

(1)PCV2d VLPs免疫选用5只SPF级5-6周龄BALB/c小鼠，将纯化后得到的PCV2dVLPs与弗氏佐剂按1：1混合，采用腹腔注射方式，免疫剂量为100μg/只，进行五次免疫后，每次进行小鼠尾尖静脉采血测定效价。

(2)间接ELISA评价BALB/c小鼠血清效价将PCV2d VLPs用pH 7.4的PBS稀释至1μg/ml,按50μl/孔加至96孔板中，4℃包被过夜后用PBST洗去包被液，并加入100μl 1％BSA于37℃封闭1h。将小鼠血清用PBST按300倍、900倍、2700倍、8100倍、24300倍、72900倍、218700倍分别进行梯度稀释，按50μl/孔的量加到封闭好的96孔板中于37℃反应45min，用PBST洗去孔内的液体，用PBST将HRP标记的羊抗鼠酶标二抗(购自KPL公司)按1:5000倍稀释，按50μl/孔的量加入后于37℃反应30min，用PBST洗去孔内的液体，加入50μl TMB显色液于37℃显色5min后，立即加入50μl 2M H₂SO₄终止反应，在酶标仪中于OD₄₅₀处进行读数。

(3)小鼠血清效价评价如表1所示，对5只五次免疫后的小鼠血清进行评价，发现5只小鼠血清的效价大于218700，血清效价均合格，可以进行后融合。

表1小鼠血清效价评价

(4)杂交瘤细胞筛选将血清效价符合要求的小鼠脾脏在无菌的条件下取出，研磨后制备成脾淋巴细胞悬液，在PEG的作用下将小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)与淋巴细胞进行融合。均匀铺至96孔板中，并逐步将培养基由HAT更换成HT，将不同孔中培养的细胞上清用间接ELISA进行检测，筛选出阳性孔，同时设置对照组排除对his标签的识别。将阳性孔中的细胞通过有限稀释法进行亚克隆，在亚克隆后的细胞生长后，分别对不同的细胞上清用间接ELISA进行检测，检测结果如表2所示，有22个96孔板中的细胞上清均为阳性，表明本次杂交瘤细胞融合成功，产生的抗体不与his标签蛋白发生反应，在三次亚克隆后筛选收集阳性单克隆细胞系，筛选得到了阳性单克隆细胞系，扩增后冻存于液氮罐中。该阳性单克隆细胞系1A6被命名为：小鼠杂交瘤单克隆细胞1A6株，该株细胞已于2019年11月01日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所菌种保藏中心保藏，保藏号为CGMCCNo.18844。

表2细胞上清阴阳性鉴定

(5)Western blot鉴定将PCV2b、PCV2d VLPs与大肠杆菌总蛋白阴性对照进行SDS-PAGE后转印到PVDF膜上，用3％BSA封闭过夜后，将阳性单克隆细胞系培养的上清用1％BSA稀释后于室温孵育3h，加入HRP标记的羊抗鼠酶标二抗室温孵育1h，加入显色液后于凝胶成像分析仪中获取结果。结果表明大肠杆菌细胞表达的PCV2b Cap与PCV2d Cap组装成VLPs后，在Western Blot系统中，制备的单抗能够有效识别PCV2b和PCV2d的Cap蛋白氨基酸序列，如图4所示，反应呈强阳性。

(6)IFA鉴定将PK15细胞铺至96孔板中，待细胞长至60％～70％时，加入PCV2b与PCV2d病毒孵育1h后用PBS冲洗，更换成新鲜培养培养基，置于37℃、5％CO₂的细胞培养箱中培养约72h，用PBS洗去培养基，加入100μl 4％多聚甲醛进行固定，加入100μl 0.1％Triton100对细胞膜进行穿孔，并用3％BSA封闭30min，加入稀释后的阳性单克隆细胞系培养的上清孵育1h，加入FITC标记的驴抗鼠荧光二抗(购自Thermo Fisher公司)避光孵育1h后，在荧光显微镜下观察结果。结果表明：PCV2b与PCV2d病毒感染PK15细胞后，通过IFA鉴定，如图5所示，该单抗1A6能够分别与PCV2病毒的PCV2b和PCV2d基因型同时发生反应。

3.单克隆抗体制备与纯化

将冻存后的细胞从液氮罐中拿出后，放在37℃水浴锅中快速解冻约1min，在冻存管中残余部分冰块时，立即将管中的液体转移到含5ml培养基的15ml离心管中，1500r/min，离心5min，弃去离心管中的培养基，加入1ml新鲜培养基重悬细胞，将细胞悬液转移至25cm细胞培养瓶中，补加4ml新鲜培养基，置于37℃、5％CO₂的细胞培养箱中培养。收集扩增后的杂交瘤单克隆细胞，调整细胞密度至1×10⁶个/ml,将细胞悬液注射至BALB/c小鼠腹腔，10～14d左右收集腹水。将收集的腹水于4℃离心去除杂质后收集上清，按1ml样本加入0.04ml的10％的硫酸右旋葡糖酐和1ml 1M的CaCl₂，去除脂蛋白等杂质，用GE公司的Protein G预装纯化柱纯化系统纯化得到单克隆抗体。

三、区分PCV2 VLPs和Cap的定量夹心ELISA检测法的建立

1.夹心ELISA具体操作步骤

(1)用pH 9.6的碳酸盐将单抗1A6按1:8000稀释，按每孔100μl加入96孔板中包被12h，弃去板中液体，用300μl PBST洗涤5次，拍干剩余液体；

(6)加入50μl TMB室温显色5min；

(7)加入50μl 2M的H₂SO₄终止反应，OD₄₅₀读数。

2.建立标准曲线

将经过GE公司的FPLC系统流穿得到纯度为100％的PCV2d VLPs作为标准样本，进行BCA定量后，将PCV2d VLPs浓度调整至8μg/ml,随后进行2倍梯度稀释，得到不同浓度的PCV2d VLPs标准品，将梯度稀释的PCV2d VLPs标准品依次加入100μl，即得到800ng/孔，400ng/孔，200ng/孔，100ng/孔，50ng/孔，25ng/孔，12.5ng/孔，6.25ng/孔，0ng/孔，用于建立PCV2的标准曲线进行后续定量。将不同PCV2d VLP浓度对应的OD值输入Excel中进行曲线拟合，得到对应的浓度与OD值换算公式。

结果为：将PCV2d VLPs作为标准样本，依次梯度稀释后作为标准品建立标准曲线，并将去除本底的OD值与对应的浓度进行统计学分析，计算后得到相应的公式，发现VLPs的浓度在0-2μg/ml时具有良好的线性关系，得到的计算公式为y＝0.248x+0.186，相关系数R²为0.992，其检测最低限度为6.25ng/孔，即待检样本中VLPs的浓度的检测下限可达到62.5ng/ml。

3.不同定量方法比对试验

将纯化后不同浓度的PCV2d VLPs，用BCA蛋白浓度测定试剂盒进行测试后，再用夹心ELISA进行检测，以BCA定量后浓度40μg/ml、220μg/ml、540μg/ml三个样本为例，根据得到的样本OD值与浓度对应的标准曲线计算PCV2d VLPs的浓度，分析统计两种浓度定量方法的差异。结果为：将不同浓度PCV2 VLPs样本用BCA定量，以40μg/ml、220μg/ml和540μg/ml样本为例，用夹心ELISA检测后，根据标准曲线计算后得到的样本浓度上下浮动范围均小于5％。

4.分辨VLPs和Cap

按照(1)的操作步骤，分别将梯度稀释得到的浓度为1μg/ml的PCV2b、PCV2d VLPs标准品和PCV2b、PCV2d Cap作为样本进行ELISA反应，作为后续分辨PCV2 VLPs和Cap的依据。结果为：将PCV2b和PCV2d的VLPs标准品和Cap分别稀释至终浓度为1μg/ml，分别加入到96孔板中进行反应，结果如图6所示，夹心ELISA能够明显识别PCV2b与PCV2d的VLPs，但不识别PCV2b与PCV2d的Cap蛋白，说明我们用单抗建立的夹心ELISA方案能够区分样本中的VLPs和Cap，且在后续的蛋白浓度定量应用中，解决了在实际定量应用中不能区分PCV2的VLPs和Cap，从而导致对VLPs的定量被Cap影响的难题，并且能够适用PCV2b与PCV2d不同基因型VLPs的定量。

实施例

以上实施例为进一步说明本发明，不对本发明构成限制。

实施例1——PCV2d Cap蛋白的表达

1)将pET100-PCV 2d-SS-Cap-Pro重组表达质粒转化至BL21(DE3)大肠杆菌(北京全式金公司)感受态细胞(重组大肠杆菌猪圆环病毒2d型Cap基因(pET100-PCV2d-SS-Cap-Pro)株菌，该菌株已于2017年12月28日送交中国科学院微生物研究所菌种保藏中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏号CGMCC No.15135)涂布在浓度为100μg/mL的氨苄抗生素素的LB培养基平板，37℃倒置培养12～14h。

2)分别随机挑取一个单克隆菌落至10mL含有100μg/mL的氨苄抗生素的LB培养基，37℃220r/min振荡培养12h。

3)按照(V/V)1:100的比例，将10mL菌液加至1L已高压灭菌处理的含有100μg/mL的氨苄抗生素的α乳糖发酵培养基(0.01mol/L)，37℃180r/min振荡培养3h至OD600达到0.8～1.0，温度降至25℃，180r/min振荡培养12h后，4℃8,000g离心10min，弃掉上清液，大肠杆菌沉淀置于-80℃保存用于蛋白纯化。

实施例2——亲和层析方法纯化PCV 2d Cap蛋白

1)大肠杆菌沉淀置于冰浴上，取100mL PBS裂解缓冲液(Lysis buffer，其配方为：裂解缓冲液：NaCl 500mM，Na₂HPO₄ 100mM，Imidazole 30mM，KH₂PO₄ 100mM，Triton X-1001％(现加)，pH 8.0)裂解1L培养液离心的沉淀(按1:10倍体积比浓缩)，充分悬浮细菌沉淀。

2)将悬浮的样品利用低温超高压连续流细胞破碎机进行破碎沉淀，1300bar压力，反复破碎6～8遍，破碎产物利用革兰氏染色方法，显微镜下观察大肠杆菌95％以上全部破碎，破碎后样品于4℃16,000g离心20min，离心后收集上清。

3)纯化前先用3～5倍柱子体积蒸馏水清洗Ni-NTA填料，然后再用3～5倍柱体积的PBS缓冲液进行平衡，再将离心收集的上清液与4mL Ni-NTA填料于室温摇床轻微振荡结合1h。

4)将结合上清的填料转移至柱子里面，让上清液自然流出柱子收集，为流穿液(Flow through)，放置4℃保存用于后期样品分析。

5)用3倍柱子体积的低浓度咪唑的洗涤液(wash buffer：NaCl 500mM，Na₂HPO₄100mM，Imidazole 50mM，pH 8.0)将与填料结合的杂蛋白洗脱掉，在洗脱的最后一个柱体积时收集1mL洗脱样品进行分析。

6)先用1个柱子体积的高浓度咪唑洗涤液(Elution buffer：NaCl 500mM，Na₂HPO₄100mM，Imidazole 500mM，pH8.0)将与填料结合的目的蛋白进行洗脱，用1.5mL离心管进行收集，洗脱的蛋白样品放置4℃保存。

7)接着再用2-3个柱子体积的Elution buffer清洗填料，将与填料结合的蛋白洗脱干净，便于填料的可回收重新利用。

8)最后先用5倍柱体积的蒸馏水清洗填料，然后再用3-4倍柱体积20％的酒精清洗填料，最后填料保存至20％酒精中。

9)所有收集的样品加入(5×SDS-PAGE sample buffer：Tris-Hcl 225mM，甘油50％，SDS 5％，溴酚蓝0.05％)，100℃煮沸10min，进行SDS-PAGE分析。

按照亲和层析的纯化方法，SDS-PAGE分析成功纯化了PCV2d cap蛋白，纯化蛋白大小与预期蛋白分子量大小一致，结果见图1，其氨基酸序列见序列1。

序列1：PCV2d-SS-Cap蛋白(234aa，28KD，等电点：10.8)氨基酸序列

实施例3——PCV 2d病毒样颗粒的组装

将实施例2所制备的经亲和层析纯化的蛋白进行SDS-PAGE分析后，选择高浓度及高纯度的蛋白放置7000D大小透析袋中置于4℃冰柜在本发明的组装缓冲液(Ammoniumcitrate 200mM，Na₃PO₄ 100mM，Tris 20mM，Arginine 20mM，pH7.0)中透析48h，透析后收集的样品用1％磷钨酸进行负染，在透射电镜下观察病毒样颗粒的形态、大小及浓度基本一致(见图3)。

实施例4——不同定量方法比对试验

实施例5——分辨VLPs和Cap

按照以下附注的操作步骤，分别将梯度稀释得到的浓度为1μg/ml的PCV2b、PCV2dVLPs标准品和PCV2b、PCV2d Cap作为样本进行ELISA反应，作为后续分辨PCV2 VLPs和Cap的依据。结果为：将PCV2b和PCV2d的VLPs标准品和Cap分别稀释至终浓度为1μg/ml，分别加入到96孔板中进行反应，如图6结果显示夹心ELISA能够明显识别PCV2b与PCV2d的VLPs，但不识别PCV2b与PCV2d的Cap蛋白，说明我们用单抗建立的夹心ELISA方案能够区分样本中的VLPs和Cap，且在后续的蛋白浓度定量应用中，解决了在实际定量应用中不能区分PCV2的VLPs和Cap，从而导致对VLPs的定量被Cap影响的难题，并且能够适用PCV2b与PCV2d不同基因型VLPs的定量。

附注：以上ELISA反应采用的步骤如下：

(6)加入50μl TMB室温显色5min；

(7)加入50μl 2M的H₂SO₄终止反应，OD₄₅₀读数。

序列表

<110> 江苏南农高科技股份有限公司

美国普赛（PROCELL）生物高科技有限责任公司

湖南农业大学

<120> 一种PCV2病毒样颗粒夹心定量ELISA检测法及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 234

<212> PRT

<213> 猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2)

<400> 1

Met Thr Tyr Pro Arg Arg Arg Tyr Arg Arg Arg Arg His Arg Pro Arg

1 5 10 15

Ser His Leu Gly Gln Ile Leu Arg Arg Arg Pro Trp Leu Val His Pro

20 25 30

Arg His Arg Tyr Arg Trp Arg Arg Lys Asn Gly Ile Phe Asn Thr Arg

35 40 45

Leu Ser Arg Thr Ile Gly Tyr Thr Val Lys Ala Thr Thr Val Arg Thr

50 55 60

Pro Ser Trp Asn Val Asp Met Met Arg Phe Asn Ile Asn Asp Phe Leu

65 70 75 80

Pro Pro Gly Gly Gly Ser Asn Pro Leu Thr Val Pro Phe Glu Tyr Tyr

85 90 95

Arg Ile Arg Lys Val Lys Val Glu Phe Trp Pro Cys Ser Pro Ile Thr

100 105 110

Gln Gly Asp Arg Gly Val Gly Ser Thr Ala Val Ile Leu Asp Asp Asn

115 120 125

Phe Val Thr Lys Ala Asn Ala Leu Thr Tyr Asp Pro Tyr Val Asn Tyr

130 135 140

Ser Ser Arg His Thr Ile Thr Gln Pro Phe Ser Tyr His Ser Arg Tyr

145 150 155 160

Phe Thr Pro Lys Pro Val Leu Asp Arg Thr Ile Asp Tyr Phe Gln Pro

165 170 175

Asn Asn Lys Arg Asn Gln Leu Trp Leu Arg Leu Gln Thr Thr Gly Asn

180 185 190

Val Asp His Val Gly Leu Gly Thr Ala Phe Glu Asn Ser Ile Tyr Asp

195 200 205

Gln Asp Tyr Asn Ile Arg Ile Thr Met Tyr Val Gln Phe Arg Glu Phe

210 215 220

Asn Leu Lys Asp Pro Pro Leu Asn Pro Lys

225 230

Claims

(1)用pH 9.6的碳酸盐将能够有效识别PCV2b和PCV2d的Cap蛋白氨基酸序列，反应呈强阳性的单抗1A6按1:8000稀释，按每孔100μl加入96孔板中包被12h，弃去板中液体，用300μlPBST洗涤5次，拍干剩余液体；

(2)分别加入100μlBSA封闭3h，弃去板中液体，用300μlPBST洗涤5次，拍干剩余液体；

(3)PCV2d VLPs按100ng/孔加入后，于37℃反应60min，弃去板中液体，用300μl PBST洗涤5次，拍干剩余液体；

(4)将兔多抗按1:2000进行稀释后，分别加入孔中于37℃反应60min，弃去板中液体，用300μlPBST洗涤5次，拍干剩余液体；

(6)加入50μl TMB室温显色5min；

(7)加入50μl 2M的H₂SO₄终止反应，OD₄₅₀读数。

2.如权利要求1所述一种PCV2d毒样颗粒夹心定量ELISA检测法，其特征在于所述的单抗1A6来源的阳性单克隆细胞系被命名为小鼠杂交瘤单克隆细胞1A6株：该细胞株已于2019年11月01日送交北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所菌种保藏中心保藏，保藏号为CGMCC No.18844。

3.如权利要求1所述一种PCV2病毒样颗粒夹心定量ELISA检测法，其特征在于所述的PCV2d VLPs是利用Cap表达和VLPs构建体系，分别表达PCV2 Cap，通过镍柱亲和层析技术将PCV2 Cap进行纯化，通过SDS-PAGE进行电泳鉴定后，体外组装成相应的VLPs。

4.如权利要求1所述一种PCV2病毒样颗粒夹心定量ELISA检测法，其特征在于其中的兔多抗是将纯化后得到的PCV2d VLPs与弗氏佐剂按1:1混合，免疫家兔获得的血清，并对血清中的IgG进行纯化而成。

5.如权利要求1所述一种PCV2病毒样颗粒夹心定量ELISA检测法，其特征在于其中的羊抗兔的酶标二抗。

6.如权利要求1所述一种PCV2病毒样颗粒夹心定量ELISA检测法，其特征在于该检测法可用于PCV2 VLPs的特异性定量以及定性，检测最低浓度可达到62.5ng/ml，灵敏度高，相关系数R²为0.992，定量准确性好。

7.如权利要求1所述一种PCV2病毒样颗粒夹心定量ELISA检测法，其特征在于该检测法可适用于PCV2b与PCV2d VLPs的定量。

8.如权利要求1所述一种PCV2病毒样颗粒夹心定量ELISA检测法，其特征在于该检测法可应用于PCV2不同基因型VLPs的定量或/和组装效率鉴定或/和PCV2病毒侵染鉴定。