CN117903300A - 一种a型口蹄疫病毒中和抗体hy1及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种A型口蹄疫病毒中和抗体HY1及其制备方法与应用。所述中和抗体HY1重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明提供了一种A型口蹄疫病毒广谱中和抗体HY1，所述中和抗体HY1能够结合并且中和目前我国流行的血清A型口蹄疫病毒，并且与O型口蹄疫病毒无交叉反应，既能够用于A型口蹄疫病毒的检测与诊断，又可以阻止A型口蹄疫病毒入侵，抑制A型口蹄疫病毒的感染，可用于制备预防或治疗A型口蹄疫病毒感染的药物。同时也能应用到快速血清O/A分型试剂盒的开发方面。

Description

一种A型口蹄疫病毒中和抗体HY1及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及一种A型口蹄疫病毒中和抗体HY1及其制备方法与应用，属于生物技术技术领域。

背景技术

口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的一种急性、热性和高度传染性疾病，主要感染猪、牛与羊等偶蹄动物，其的传播与流行给我国畜牧养殖业造成了巨大损失，被世界动物卫生组织和联合国粮农组织列为A类烈性传染病。

目前世界上主要存在七种不同血清型的口蹄疫病毒，它们分别是O型、A型、C型、亚洲I型、南非I型、南非II型和南非III型，其中每种血清型又可以分为许多不同的血清亚型。口蹄疫病毒颗粒在形态上近似于球形，直径约25～30nm，没有囊膜，衣壳呈二十面体结构，由十二个五聚体组成，每个五聚体由五个原聚体组成，每个原聚体由VP1、VP2、VP3和VP4四个结构蛋白组成。其中VP1、VP2和VP3暴露于衣壳表面，而VP4完全内化在衣壳内部。目前我国主要存在O和A这两种血清型，其中血清A型具有最广泛的抗原变异，血清A型型内不同亚型之间往往不能交叉保护。到现在为止，我国关于口蹄疫病毒血清A型广谱中和抗体及其识别的广谱中和抗原表位的研究报道很少。

过去二十年，科学家们主要使用鼠源杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体进行口蹄疫病毒抗原特性的研究工作。对于A型口蹄疫病毒，利用抗体耐受突变株分析得出口蹄疫病毒逃逸突变的关键位点，确认了五个功能相互独立的抗原位点(图1)。位点1和位点3是口蹄疫病毒的主要抗原位点，由VP1蛋白的G-H环和C端组成，其中影响抗体结合的关键氨基酸残基位点主要包括144、148、154和208。位点2由VP2蛋白的B-C环或者E-F环组成，其主要的氨基酸残基位点位于70-73、75、77和131。位点4主要由VP2蛋白β-B“球形扭结”结构组成，其主要的氨基酸残基位点位于58和60。位点5包含至少一个功能依赖的中和表位，其位于VP1蛋白G-H环的第149位。尽管位点5属于位点1的一部分，但是其明显不同于位点1。此外，位点1是线性表位并且对胰蛋白酶非常敏感，而位点2～5是构象表位且对胰蛋白酶不敏感。但是，到目前为止来源于天然宿主的中和抗体及其识别的抗原表位，以及中和抗体介导的中和机制的研究非常有限。

单链抗体(single chain antibody fragment，scFv)是由抗体重链可变区和轻链可变区通过一个10-25个氨基酸组成的柔性短肽连接而成，具有亲代抗体全部抗原结合特异性的最小功能结构单位，该抗体保留了天然抗体的特异性和主要生物学活性，并且去除了无关结构，具有更广泛的应用前景。作为一种新型抗体分子，单链抗体具有分子质量小、组织穿透力强、血中半衰期短，无交叉反应、容易基因操作、能在原核细胞中表达和易于大量生产等优点，并且可以用化学偶联或基因工程方法与其他靶标分子构建融合蛋白。同时单链抗体作为抗体药物也引起了广泛的关注，例如Beovu是在美国获批的一款新一代眼科药物，其活性药物成分brolucizumab就是一种人源化单链抗体片段，靶向所有类型的血管内皮生长因子-A(VEGF-A)。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供一种A型口蹄疫病毒中和抗体HY1及其制备方法与应用。

本发明的技术方案如下：

第一方面，本发明提供一种A型口蹄疫病毒中和抗体HY1，所述中和抗体HY1重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

根据本发明优选的，所述中和抗体HY1为重链可变区和轻链可变区融合的单链抗体，所述重链可变区和轻链可变区之间连接有柔性多肽接头，且所述重链可变区位于N端，所述轻链可变区位于C端。

进一步优选的，所述柔性多肽接头的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示。

根据本发明优选的，所述中和抗体HY1的N端和/或C端连接有纯化标签。

进一步优选的，所述纯化标签为Flag-tag标签和His标签中的至少一种；所述Flag-tag标签和His标签的氨基酸序列均如SEQ ID No.4所示。

第二方面，本发明提供了一种编码上述中和抗体HY1的基因片段，其中，编码所述中和抗体HY1重链可变区的基因序列如SEQ ID NO.6所示，编码所述中和抗体HY1轻链可变区的基因序列如SEQ ID NO.7所示。

第三方面，本发明提供了一种含有上述第二方面所述的基因片段的表达载体。

第四方面，本发明提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有上述第三方面所述的表达载体，或其基因组中整合有上述第二方面所述的基因片段。

为了便于表达的所述中和抗体HY1从细胞内分泌到细胞外，可以在编码本发明中和抗体HY1的核酸的5’端或3’端融合编码信号肽的核酸，所述信号肽的氨基酸序列如SEQID No.5所示。不过，当融合有信号肽的单链抗体在表达后，信号肽会被切割下来，获得不含信号肽的单链抗体。

第五方面，本发明提供了上述中和抗体HY1的制备方法，包括步骤如下：

(1)采用A型口蹄疫病毒对牛进行第一次免疫，第一次免疫后25～30天内，进行第二次免疫；

(2)第二次免疫后，分离外周血单个核细胞，然后利用诱饵抗原和荧光抗体进行筛选和标记，得到口蹄疫病毒血清A型特异性B细胞；

(3)以步骤(2)所得口蹄疫病毒血清A型特异性B细胞的cDNA为模板，扩增得到牛单个B细胞IgG抗体的重链可变区基因和轻链可变区基因；

(4)将步骤(3)所得重链和轻链的可变区基因通过柔性多肽接头连接，再于两端分别引入信号肽和纯化标签，然后插入到pcDNA3.4表达载体中，得到pcDNA3.4-scFv质粒；

(5)将步骤(4)所得pcDNA3.4-scFv质粒转染至CHO-S细胞，取转染细胞培养后取上清，经纯化后，得到A型口蹄疫病毒中和抗体HY1。

根据本发明优选的，步骤(1)中，所述第一次免疫的A型口蹄疫病毒为FMDV A/AF/72，第二次免疫的A型口蹄疫病毒为FMDV A/WH/CHA/09。

第六方面，本发明提供了一种免疫偶联物，所述免疫偶联物包括：

a、上述第一方面所述的中和抗体HY1；

b、和选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、金纳米颗粒/纳米棒、纳米磁粒、病毒外壳蛋白或VLP、或其组合。

第七方面，本发明提供了上述第一方面所述的中和抗体HY1在制备A型口蹄疫病毒检测试剂或试剂盒中的应用。

第八方面，本发明提供了一种A型口蹄疫病毒检测试剂盒，所述检测试剂盒包括上述第一方面所述的中和抗体HY1。

优选地，所述检测试剂盒还包括酶标板、抗体稀释液、浓缩洗涤液、显色剂、终止液。

第九方面，本发明提供了一种上述第一方面所述的中和抗体HY1在制备预防或治疗A型口蹄疫病毒感染药物中的应用。

第十方面，本发明提供了一种预防或治疗A型口蹄疫病毒感染的药物组合物，所述药物组合物包括：上述第一方面所述的中和抗体HY1、或上述第六方面所述的免疫偶联物，以及药学上可接受的载体。

本发明的有益效果如下：

1、本发明提供了一种A型口蹄疫病毒广谱中和抗体HY1，所述中和抗体HY1能够结合、中和目前我国流行的血清A型口蹄疫病毒，并且与O型口蹄疫病毒无交叉反应，既能够用于A型口蹄疫病毒的检测与诊断，又可以阻止A型口蹄疫病毒入侵，抑制A型口蹄疫病毒的感染，可用于制备预防或治疗A型口蹄疫病毒感染的药物。同时也能应用到快速血清O/A分型试剂盒的开发方面。

2、基于本发明的A型口蹄疫病毒广谱中和抗体HY1，本申请发明人进一步发现了新型的、同时横跨抗原位点1和位点2的广谱中和表位，可以为广谱中和疫苗提供重要的表位信息。

3、本发明提供了一种A型口蹄疫病毒中和抗体HY1的制备方法，利用巢式PCR，从单个B淋巴细胞扩增出抗体可变区基因，进而制备筛选出具有中和抗体活性的HY1，相较于传统的抗体制备技术具有效率高的优点，为研究牛的抗体免疫应答和分离治疗性抗体提供了一种新的技术手段。

附图说明

图1为现有技术报道的口蹄疫病毒的中和表位图。

图2为单链抗体HY1通过聚丙烯酰胺凝胶电泳图。

图3为间接酶联免疫吸附实验(ELISA)检测中和单链抗体HY1的反应性结果。

图4为FMDV A/WH/CHA/09病毒颗粒与单链抗体HY1复合物的冷冻电镜图。

图5为FMDV A/WH/CHA/09病毒颗粒与单链抗体HY1复合物的三维分类与总体密度图；

图中，左图为FMDV-AWH-HY1三维分类截面图；右图为FMDV-AWH-HY1三维重构密度图。

图6为FMDV A/WH/CHA/09病毒颗粒与单链抗体HY1的相互作用界面图。

图中，A为FMDV-AWH-HY1复合物整体结构图；B为单链抗体HY1与FMDV-AWH VP2BC环作用细节图；C为单链抗体HY1与FMDV-AWH VP2 HI环作用细节图；D为单链抗体HY1与FMDV-AWH VP1GH环作用细节图。

图7为单链抗体HY1的中和表位图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步描述，但是本发明的保护范围并不仅限于此。实施例中涉及的试剂与材料，若无特殊说明，均为普通市售产品。

口蹄疫病毒株FMDV A/AF/72属于血清A型A22谱系；

口蹄疫病毒株FMDV A/WH/CHA/09属于血清A型Asia拓扑型SEA-97/G1；

口蹄疫病毒株FMDV A/GDMM/CHA/2013属于血清A型Asia拓扑型SEA-97/G2。

口蹄疫病毒FMDV A/AF/72，FMDV A/WH/CHA/09和FMDV A/GDMM/CHA/2013灭活疫苗均购于中农威特生物科技股份有限公司。

pcDNA3.4表达载体购自赛默飞(Thermo scientific)，美国。

CHO-S细胞购自Gibco公司。

Pacific Blue^TM Protein labeling kit标记试剂盒购自赛默飞(ThermoScientific)，美国。

金属载网(GIG,Au 1.2/1.3,200mesh)购自江苏蓝拓生物科技有限公司。

SYT09核酸染料购自赛默飞(Thermo scientific)，美国。

实施例1、单链抗体HY1的制备

一种A型口蹄疫病毒单链抗体HY1的制备方法，包括步骤如下：

(1)采用口蹄疫病毒FMDV A/AF/72对牛进行第一次免疫，第一次免疫后28内，采用口蹄疫病毒FMDVA/WH/CHA/09灭活疫苗进行第二次免疫；

(2)第二次免疫后从牛颈静脉处采集外周血，使用淋巴细胞分离液分离外周血中的单个核细胞(PBMCs)；然后取10⁷个富集的PBMCs重悬于200μL细胞分选液中，依次加入0.5μg使用Pacific Blue^TM Protein labeling kit标记试剂盒标记的FMDV A/WH/CHA/09 146S抗原、2μg鼠抗牛CD21-RPE荧光抗体和1μg鼠抗牛IgM-FITC荧光抗体，冰上静置25min，然后在400×g、4℃下离心10min；将离心收集的细胞重悬于500μL细胞分选液中，同时加入5μL的7-AAD核酸染料对死细胞进行标记，室温静置5min，准备上机分选细胞；

将染色标记的PBMCs细胞使用BD FACSAria IIu流式细胞分选仪进行分选，其中CD21⁺IgM^-A-FMDV⁺细胞为口蹄疫病毒血清A型特异性B细胞；

所述分选时设门圈出淋巴与单核细胞，同时根据FSC-H和FSC-A设置排除粘连细胞；

(3)分选完成后，向含有口蹄疫病毒血清A型特异性B细胞的细胞分选液中加入1μL终止液终止反应，每孔再加入4μL的SuperScriopt VILO预混液和6μL的DNase/RNase-freewater，混匀，在1500rpm、4℃下离心5min，提取得到总RNA；

然后以此总RNA为模板进行反转录扩增，获得cDNA；再以扩增获得的cDNA为模板采用巢式PCR的方法对牛单个B细胞IgG抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因进行扩增，扩增得到牛单个B细胞IgG抗体的重链可变区基因和轻链可变区基因；

其中，反转录扩增的反应条件为：25℃10分钟，42℃120分钟，85℃5分钟；反应体系为：SuperScript^TMVILO^TMMasterMix4μL，RNA10μL，DEPC水补足至20μL。

巢式PCR法进行两轮扩增，第一轮扩增以cDNA分子为模板，使用表1中所示L/H-outer引物，第二轮扩增则以第一轮扩增产物为模板，使用表1中所示L/H-inner引物进行扩增，两轮扩增后获得牛IgG抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因的PCR产物。

第一轮使用25μL扩增体系，具体如下：12.5μLHotStar Taq Master(2x)，0.5μL引物F(25μM)；0.5μL引物R(25μM)；2.5μL cDNA模板；9μLDEPC水。第二轮使用50μL扩增体系，按第一轮组分进行两倍添加。根据重链和轻链引物设置不同的退火温度，第一轮轻链退火温度为56℃，重链退火温度为60℃，循环数设置为32；第二轮轻链、重链的退火温度同为55℃，循环数设置为35。

表1：扩增牛IgG轻链与重链可变区基因的引物

简并碱基注释：S＝C或G，Y＝C或T，R＝A或G。

(4)将步骤(3)所得重链可变区基因和轻链可变区基因通过柔性多肽接头连接，得到融合基因，并在融合基因N端引入牛源IgG重链抗体分泌信号肽序列，在C端引入以利于检测和纯化的Flag标签和6×His标签，然后合成的基因通过Not I和Nhe I酶切位点插入到pcDNA3.4表达载体中，构建完成的表达质粒命名为pcDNA3.4-scFv质粒；

(5)于温度37℃、相对湿度≥80％、二氧化碳浓度8％的条件下，在恒温摇床中培养CHO-S细胞；当细胞密度达到6×10⁶个/mL时进行pcDNA3.4-scFv质粒转染，即将30μg的pcDNA3.4-scFv质粒加入250μL的OptiPRO^TMSFM培养基中进行稀释，然后与250μL的OptiPRO^TMSFM培养基稀释的ExpiFectamine^TMCHO-S转染试剂混合(80μL转染试剂使用920微升培养基稀释)，得到质粒-转染试剂混合物，室温静置5min；将质粒-转染试剂混合物缓慢加入至CHO-S细胞中；将转染后CHO-S细胞置于37℃恒温悬浮培养箱，悬浮培养18h后，补加150μL转染增强剂(Expi CHO-S^TMEnhancer)和6mL培养物补料(EXPI CHO-S^TMFeed)；在37℃下继续培养10天后，按10000×g离心30分钟，收取细胞培养上清，经0.22微摩滤器过滤，得到粗单链抗体HY1；

使用HiTrap TALON柱(用于纯化重组His-tag蛋白)在AKAT蛋白纯化仪上对粗单链抗体HY1进行抗体纯化，具体是：使用含有250mM咪唑的PBS缓冲液(pH7.4)洗脱抗体，进一步利用分子筛(Superdex 200increase 10/300柱子)进行二次纯化，得到A型口蹄疫病毒单链抗体HY1。

本实施例中，步骤(3)所述重链可变区基因的序列如SEQ ID NO.6所示，轻链可变区基因的序列如SEQ ID NO.7所示，重链可变区基因编码的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，轻链可变区基因编码的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

步骤(4)中，所述柔性多肽接头的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示，编码该柔性多肽接头的基因序列如SEQ ID NO.8所示；所述Flag-tag标签和His标签的氨基酸序列均如SEQ IDNo.4所示，编码该柔性多肽接头的基因序列如SEQ ID NO.9所示；所述信号肽的氨基酸序列如SEQ ID No.5所示，编码该柔性多肽接头的基因序列如SEQ ID NO.10所示。以上柔性多肽接头、Flag-tag标签、His标签和信号肽序列合成与载体构建均委托金唯智生物技术公司进行合成与构建。

将本实施例制备的A型口蹄疫病毒单链抗体HY1通过聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行验证，结果如图2所示。

由图2可知，本发明成功制备得到了单链抗体HY1，并将纯化得到的单链抗体HY1在PBS溶液冻存于-80℃冰箱中保存备用。

实施例2、单链抗体HY1的间接酶联免疫吸附实验(ELISA)

将纯化好的FMDV A/AF/72、FMDV A/WH/CHA/09或者FMDV A/GDMM/CHA/2013病毒颗粒使用PBS缓冲液稀释至浓度为1μg/mL，按照100μL/孔在4℃条件下过夜包被在ELISA酶标板上。用洗液反复清洗酶标板5次，然后在酶标板的每个孔中加入1wt％明胶200μL，37℃封闭1小时。再将实施例1制备的单链抗体HY1的PBS溶液以与明胶按照1：5的体积比加入到酶标板中，然后以2倍倍比稀释按照100μL/孔加入酶标板中，37℃孵育1小时，同时使用PBS缓冲液作为阴性对照组。用洗液反复清洗酶标板5次，然后在酶标板的每个孔中加入100μL以1：10000稀释HRP标记的抗HIS标签的抗体，37℃孵育1小时。用洗液反复清洗酶标板6次，然后按照100μL/孔加入TMB显色液，37℃显色10分钟。终止液终止显色，酶标仪按照吸光度值450nm测定OD值，结果如图3所示。

由图3可知，本发明制备的单链抗体HY1可以与血清A型三种不同的病毒株(FMDVA/AF/72,FMDV A/WH/CHA/09和FMDV A/GDMM/CHA/2013)相结合，能够用于A型口蹄疫病毒的检测与诊断。

实施例3、单链抗体HY1的病毒微量中和实验

在96孔板的第一个孔中加入50μL实施例1制备的单链抗体HY1的PBS溶液，在96孔板内进行倍比稀释，然后每孔分别加入100μL含100TCID₅₀的FMDV病毒(A/AF/72、A/WH/WHA/09和A/GDMM/CHA/2013)，37℃作用1小时，同时设置含有10、100以及1000个TCID₅₀的不加单链抗体HY1的对照孔。然后每孔加入100μL含5×10⁴个BHK21细胞的完全培养基，放入37℃含5％ CO₂的培养箱作用72小时。弃去上清液，加入预冷的固定液(体积比为1:1甲醇与丙酮的混合液)，-20℃固定20min。最后弃去固定液，每孔加入100μL结晶紫溶液进行染色，30min后，冲洗96孔板，观察50％细胞未病变的稀释孔抗体最大稀释度，结果如表2所示。

表2、HY1的中和作用

由表2可知，本发明制备的单链抗体HY1可以有效中和FMDV A/AF/72、A/WH/WHA/09和A/GDMM/CHA/2013的感染，表明单链抗体HY1具有血清A型广谱中和活性，又可称为中和抗体HY1。该中和抗体HY1既能够用于A型口蹄疫病毒的检测与诊断，又可以阻止A型口蹄疫病毒入侵，抑制A型口蹄疫病毒的感染，可用于制备预防或治疗A型口蹄疫病毒感染的药物。

实施例4、FMDV A/WH/CHA/09病毒颗粒与单链抗体HY1复合物(FMDV-AWH-HY1)的冷冻样品制备与数据收集

1、将纯化后的、状态良好的FMDV A/WH/CHA/09病毒颗粒与单链抗体HY1按照摩尔比1：240在4℃条件下孵育10min，得到FMDV A/WH/CHA/09病毒颗粒与单链抗体HY1复合物的PBS缓冲液悬液，进行冷冻样品的制备。

2、FMDV A/WH/CHA/09病毒颗粒与单链抗体HY1复合物(FMDV-AWH-HY1)冷冻样品制备在冷冻制样仪(FEI Vitrobot Mark IV)上进行，具体操作步骤如下：

首先准备冷冻样品制备所需的实验用品如移液枪、镊子、玻璃皿、金属载网(GIG，Au1.2/1.3，200mesh；Lan tuo)、滤纸、保温杯、液氮、铜碗、金属传感器、液态乙烷皿、计时器，50mL离心管。然后打开冷冻制样仪的开关，加入吸水滤纸，调整仪器制样参数：温度8℃；湿度：100％。用吹风机吹干所有冷冻样品制备所需的物品，将铜碗，金属传感器，液态乙烷皿组装，加入液氮冷却，冷却平衡10～15分钟，在铜碗中小心加入液态乙烷(注意刚加入时气流要小，防止产生过多的雾气)，加至金属传感器和铜碗的分界面。然后金属载网放电进行亲水化处理：抽真空3min，辉光放电40s。放电时应特别注意保证金属载网的正面朝上。使用冷冻样品制备专用镊夹住金属载网的边缘，置于冷冻制样仪Vitrobot悬架上，然后使用10μL移液枪吸取4μL的FMDV-AWH-HY1复合物悬液加到金属载网正面，吸附1min。设置做样参数：Blottime设为5秒，Blotforce设为0。待程序完成后，金属载网自动随镊子投入液态乙烷。待悬架缓缓下降后，将液态乙烷中的金属载网迅速转移至液氮中的提前做好标记的样品盒中。制样完成后将存放金属载网的样品盒转移到提前在装满液氮保温杯中预冷好的50mL离心管中，最后将装有样品盒的50mL离心管转移至大的液氮罐中，保存备用。使用200kV场发射投射电子显微镜(Arctina,Falcon II相机)进行冷冻样品的数据收集，数据收集条件为：1)Search模式下放大倍数为3800X，Exposure模式下放大倍数为110kX；2)Spotsize：Search模式下为7，Exposure模式下为4；注意Spot size值越小，电子剂量越大，对样品的损坏越大。3)收集图片的帧数为19帧，欠焦值为-2.4至-1.4μm。4)像素尺寸为/像素，结果如图4所示。

由图4可知，FMDV-AWH-HY1复合物分布比较均一，颗粒形态和完整度较好，适合进一步的大量冷冻数据收集以及后续的FMDV-AWH-HY1复合物结构的解析工作。

实施例5、FMDV A/WH/CHA/09病毒颗粒与单链抗体HY1复合物(FMDV-AWH-HY1)的结构分析

1、按照实施例4所述的方法收集FMDV-AWH-HY1复合物冷冻样品的数据，总共收集了200张FMDV-AWH-HY1复合物的冷冻电镜图片。然后运用MotionCorr2软件进行图像漂移校正和CTFFIND 4.0软件进行图像衬度传递函数(CTF)校正，将校正完成的图片导入Relion3.05软件进行颗粒的挑选和筛选，二维重构，反复优化和三维重构等.首先手动挑选了385个病毒颗粒进行二维分类得到颗粒挑选的参考，然后以此参考进行颗粒的自动挑选，总共挑选了12315个病毒颗粒。这些病毒颗粒经过反复的二维分类筛选，排除一些没有结合或者含有杂质的病毒颗粒，得到形态完整并且收敛良好的8513个病毒颗粒。将二维分类提取出来的颗粒进行三维分类，总共分为三类。分类完成后选择第一类4788个颗粒进行三维结构的重构得到FMDV-AWH-HY1复合物密度图，结果如图5所示。

由图5可知，单链抗体HY1与FMDVA/WH/CHA/09病毒颗粒结合在一起，并且单链抗体HY1结合在病毒颗粒的三次轴附近。

2、利用UCSF Chimera软件将FMDV O1BFS(PDB:1BBT)和BOV-7(PDB:6e9u)的X射线晶体结构手动放到FMDV-AWH-HY1复合物结构密度图中，然后利用Coot软件进行手动建模，主要包括以下几个方面：1)将氨基酸残基突变成FMDV-AWH-HY1复合物对应的氨基酸残基；2)将每个氨基酸手动调整到对应的结构电子密度图中；3)利用Ramachandran Plot调整每个氨基酸残基的二面角处于合理区域，Ramachandran Plot用于反映蛋白质构象的合理性。手动建模完成后利用Phenix软件进行自动正义空间修正，建模结果如图6所示。

其中，所述FMDV O1BFS属于EURO拓扑型O1病毒株，曾流行于英国地区。其X射线晶体结构(病毒结构)已经得到解析并上传至开放获取的PDB蛋白数据库，其PDB ID号：1BBT，已在文献中公开，相关文献DOI：10.2210/pdb1BBT/pdb。所述BOV-7是一种已解析的牛源抗体的X射线晶体结构，其结构也已经上传至开放获取的PDB蛋白数据库，其PDB ID号：6e9u，已在文献中公开，DOI：10.2210/pdb16e9u/pdb。

由图6可知，FMDV-AWH-HY1复合物结构显示HY1与VP2的B-C环(_VP2D68、_VP2T71、_VP2D72和_VP2K73)、H-I环(_VP2S195和_VP2Q196)和VP1 G-H环(_VP1G143、_VP1D144和_VP1G147)相结合。这是首次发现的同时横跨抗原位点1(VP1 G-H环)和抗原位点2(VP2的B-C环和H-I环)的中和抗体。并且，HY1中与FMDVA/WH/CHA/09病毒衣壳发生相互作用的氨基酸主要位于HCDR3(_VHD102,_VHY103,_VHN113,_VHG114和_VHR117)和LCDR3(_VLK99)。

具体来说，图6A中，FMDVA/WH/CHA/09病毒衣壳VP2 B-C环上的第68位天冬氨酸(_VP2D68)、第72位天冬氨酸(_VP2D72)和第73位的赖氨酸(_VP2K73)与HY1重链第三互补决定区的第102位天冬氨酸(_VHD102)、第117位精氨酸(_VHR117)和第103位酪氨酸(_VHY103)存在氢键相互作用(图6A)。FMDVA/WH/CHA/09病毒衣壳VP2 B-C环上的第71位苏氨酸(_VP2T71)与HY1轻链第三互补决定区的第99位赖氨酸(_VLK99)存在氢键相互作用。

图6B中，FMDVA/WH/CHA/09病毒衣壳VP2 H-I环上的第195位丝氨酸(_VP2S195)和第196位谷氨酰胺(_VP2Q196)与HY1重链第三互补决定区的第113位天冬酰胺(_VHN113)、第114位甘氨酸(_VHG114)存在氢键相互作用。

图6C中，FMDVA/WH/CHA/09病毒衣壳VP1 G-H环上第143位的甘氨酸(_VP1G143)、第144位的天冬氨酸(_VP1D144)和第147位的甘氨酸(_VP1G147)与HY1重链第77位的谷氨酰胺(_VHQ77)、第21位的苏酰胺(_VHT21)和第72位的天冬氨酸(_VHD72)也存在氢键相互作用。

根据以上收集的数据和分析总结单链抗体HY1的中和表位，具体如图7所示。

由图7可知，HY1与VP2的B-C环(_VP2D68、_VP2T71、_VP2D72和_VP2K73)、H-I环(_VP2S195和_VP2Q196)和VP1 G-H环(_VP1G143、_VP1D144和_VP1G147)相结合。这是首次发现的同时横跨抗原位点1(VP1 G-H环)和抗原位点2(VP2的B-C环和H-I环)的中和抗体。

Claims (10)

1.一种A型口蹄疫病毒中和抗体HY1，其特征在于，所述中和抗体HY1重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

2.如权利要求1所述的A型口蹄疫病毒中和抗体HY1，其特征在于，所述中和抗体HY1为重链可变区和轻链可变区融合的单链抗体，所述重链可变区和轻链可变区之间连接有柔性多肽接头，且所述重链可变区位于N端，所述轻链可变区位于C端；所述中和抗体HY1的N端和/或C端连接有纯化标签；

进一步优选的，所述柔性多肽接头的氨基酸序列如SEQ ID No.3所示；所述纯化标签为Flag-tag标签和His标签中的至少一种；所述Flag-tag标签和His标签的氨基酸序列均如SEQ ID No.4所示。

3.一种编码权利要求1所述中和抗体HY1的基因片段，其特征在于，编码所述中和抗体HY1重链可变区的基因序列如SEQ ID NO.6所示，编码所述中和抗体HY1轻链可变区的基因序列如SEQ ID NO.7所示。

4.一种含有权利要求2所述中和抗体HY1的基因片段的表达载体。

5.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求4所述的表达载体，或其基因组中整合有权利要求3所述中和抗体HY1的基因片段。

6.权利要求1所述中和抗体HY1的制备方法，其特征在于，包括步骤如下：

(1)采用A型口蹄疫病毒对牛进行第一次免疫，第一次免疫后25～30天内，进行第二次免疫；

其中，所述第一次免疫的A型口蹄疫病毒为FMDV A/AF/72，第二次免疫的A型口蹄疫病毒为FMDV A/WH/CHA/09

(2)第二次免疫后，分离外周血单个核细胞，然后利用诱饵抗原和荧光抗体进行筛选和标记，得到口蹄疫病毒血清A型特异性B细胞；

(3)以步骤(2)所得口蹄疫病毒血清A型特异性B细胞的cDNA为模板，扩增得到牛单个B细胞IgG抗体的重链可变区基因和轻链可变区基因；

(4)将步骤(3)所得重链和轻链的可变区基因通过柔性多肽接头连接，再于两端分别引入信号肽和纯化标签，然后插入到pcDNA3.4表达载体中，得到pcDNA3.4-scFv质粒；

(5)将步骤(4)所得pcDNA3.4-scFv质粒转染至CHO-S细胞，取转染细胞培养后取上清，经纯化后，得到A型口蹄疫病毒中和抗体HY1。

7.一种免疫偶联物，其特征在于，所述免疫偶联物包括：

a、权利要求1所述的中和抗体HY1；

b、和选自下组的偶联部分：可检测标记物、药物、金纳米颗粒/纳米棒、纳米磁粒、病毒外壳蛋白或VLP、或其组合。

8.权利要求1所述的中和抗体HY1在制备A型口蹄疫病毒检测试剂或试剂盒中的应用。

9.权利要求1所述的中和抗体HY1在制备预防或治疗A型口蹄疫病毒感染药物中的应用。

10.一种预防或治疗A型口蹄疫病毒感染的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括：权利要求1所述的中和抗体HY1、或权利要求7所述的免疫偶联物，以及药学上可接受的载体。