CN110551212A - 抗gii.4型诺如病毒衣壳蛋白vp1和病毒样颗粒vlp单克隆抗体的制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种抗GII.4型诺如病毒衣壳蛋白VP1和病毒样颗粒VLP单克隆抗体的制备方法和应用，通过将目的序列插入原核表达载体中构建重组质粒pGEX‑5X‑1‑VP1，利用大肠杆菌表达系统表达并纯化得GII.4型诺如病毒重组蛋白GST‑VP1，以其为免疫原进行动物免疫并结合杂交瘤技术，通过细胞融合和克隆化筛选阳性杂交瘤细胞株。本发明经过间接ELISA双筛制备的单克隆抗体不仅能够特异性检测GII.4型诺如病毒重组蛋白GST‑VP1，对于GII.4型诺如病毒病毒样颗粒VLP和天然诺如病毒主要衣壳蛋白都表现出显著的识别效果，易于推广应用。

Description

抗GII.4型诺如病毒衣壳蛋白VP1和病毒样颗粒VLP单克隆抗 体的制备方法和应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及抗GII.4型诺如病毒衣壳蛋白VP1和病毒样颗粒VLP单克隆抗体的制备方法和应用。
背景技术
诺如病毒（Norovirus, NoV）是引发非细菌性急性胃肠炎的重要病原体，可造成全球范围内的暴发性流行。诺如病毒具有高度传染性，各个年龄段人群普遍易感。诺如病毒感染一般主要表现为自限性疾病，但在老人和儿童中有些病例仍会发展成重症，甚至死亡。自1995年我国报道了首例诺如病毒感染以来，全国各地相继暴发多起群体性诺如病毒感染性腹泻事件。在发展中国家每年因诺如病毒感染引起腹泻而丧生的儿童病例高达20万例。可见，诺如病毒感染已成为危害人类日常健康的重要的公共卫生问题。
诺如病毒是无包膜单股正链RNA病毒，衣壳呈二十面体对称结构，属杯状病毒科、诺如病毒属。其基因组编码3个开放阅读框（Open reading frames，ORFs），其中ORF2是诺如病毒基因组中唯一编码结构蛋白的基因，结构蛋白VP1作为诺如病毒抗原主要决定簇并负责识别宿主受体，且具有良好的免疫原性和反应原性，所以一直都作为诺如病毒免疫学研究的主要表达对象。研究表明 VP1蛋白与病毒自我组装、衣壳形成、受体识别、宿主特异性、病毒多样性以及病毒免疫原性均相关。诺如病毒的基因和抗原性具有丰富多样性，VP1基因是诺如病毒属成员基因分型的依据，根据VP1的基因序列特征可分为7个基因组（GI-GVII）和40个以上的基因型。研究表明，GII型是全球多数国家暴发人类病毒性急性肠胃炎最主要的病原体，其中GII.4型毒株则一直占据全球主导流行株的地位。诺如病毒变异速度快，每隔几年GII.4型诺如病毒就会进化形成新的基因簇，并成为广泛传播的优势新流行株。因此，防控GII.4 型诺如病毒暴发和流行的工作面临着极大的困难和挑战。
迄今为止，尚无特效的抗病毒药物和预防性疫苗上市。一方面，诺如病毒的体外培养问题一直是疫苗开发的一个重要制约因素。尽管目前有报道利用人类肠道上皮细胞成功培养诺如病毒的研究，但是限于型别、操作和产量而无法进行有效推广和应用。另一方面，合适的动物模型的缺乏、病毒基因型别的复杂和快速变异性也都严重阻碍了诺如病毒传统疫苗研发的进程。酶联免疫吸附试验(ELISA)作为目前诊断诺如病毒的常用方法，该法利用单克隆抗体捕获样品中的病毒抗原，具有交叉反应小，灵敏度高，特异性强的特点，在许多其他疾病的诊断中都已得到广泛应用。
一种GII.4型诺如病毒广谱单克隆抗体的制备方法及用途(201910199457.2)公开了利用大肠杆菌表达系统表达诺如病毒GII.4型P蛋白形成P颗粒，结合杂交瘤技术制备诺如病毒单克隆抗体的方法，虽然最终获得效价达10-4-10-6的抗诺如病毒单克隆抗体。但是该方法制备P颗粒的关键步骤其实需要进行体外凝血酶酶切以除去融合蛋白的标签蛋白，该过程耗时、费力又增加成本，而且当不能有效地将目的蛋白和标签蛋白进行分离时，就会有引入外源蛋白污染的风险。另外，该发明采用将四种GII.4型诺如病毒不同的基因簇进行混合后免疫，虽然简化了免疫步骤，但是从筛选得到的抗体效价就可以反映出这种免疫方式的不足之处。
鉴于近年来我国频繁暴发由GII.4型诺如病毒引起的感染性腹泻事件，由于诺如病毒抗原高度变异，目前商业化的诺如病毒免疫诊断试剂由于敏感性和特异性的不足而无法满足临床诊断需求。因此我们致力于制备抗GII.4型诺如病毒单克隆抗体以建立该型诺如病毒的快速检测方法，特别是筛选具有中和活性的特异性抗体以促进疫苗研发的进展。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一种抗GII.4型诺如病毒衣壳蛋白VP1和病毒样颗粒VLP单克隆抗体的制备方法和应用，该制备方法简单可靠，制得的单克隆抗体具有效价高、特异性好、与天然抗原亲和力强的优势，为GII.4型诺如病毒快速诊断、检测试剂盒及防治疫苗的研究提供了一定的科学依据。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
抗GII.4型诺如病毒衣壳蛋白VP1和病毒样颗粒VLP单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备方法，包括如下步骤：
步骤（1），免疫原的制备：通过PCR扩增获取诺如病毒衣壳蛋白VP1基因序列，扩增产物与pGEX-5X-1表达载体分别酶切后连接，从而构建重组质粒pGEX-5X-1-VP1，IPTG诱导表达并通过亲和层析纯化得重组蛋白GST-VP1；
步骤（2），动物免疫：取6～8周龄Balb/c小鼠，以3周间隔进行四次免疫，程序为：首次免疫，弗氏完全佐剂与等量重组蛋白GST-VP1充分混合乳化后，背部皮下多点注射；第二次免疫和第三次免疫，佐剂换为弗氏不完全佐剂，方法和计量同首次免疫；第四次采用腹腔注射未加佐剂的重组蛋白GST-VP1，注射量同首次免疫；3天后，取免疫小鼠脾脏细胞用于制备杂交瘤细胞；
步骤（3），杂交瘤细胞株的制备和筛选：将步骤（2）得到的小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞通过PEG4000的作用下进行细胞融合，利用1×HAT选择性培养基培养融合后的杂交瘤细胞，细胞融合后12-14天，通过酶联免疫吸附试验检测细胞上清以筛选能特异性分泌抗诺如病毒衣壳蛋白VP1单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
进一步，优选的是，所述的诺如病毒衣壳蛋白VP1序列是根据GII.4型诺如病毒Sydney株基因序列进行体外合成。
进一步，优选的是，还包括杂交瘤细胞的克隆化，具体是：通过有限稀释法对特异性分泌抗诺如病毒衣壳蛋白VP1单克隆抗体的杂交瘤细胞株进行亚克隆培养，连续培养多次，直至克隆孔内抗体检测100％阳性为止，然后扩大培养并冻存。
进一步，优选的是，其特征在于，步骤（2）中，注射量为50μg/只。
本发明同时提供上述杂交瘤细胞株分泌的抗GII.4型诺如病毒衣壳蛋白VP1和病毒样颗粒VLP单克隆抗体。
本发明还提供上述抗GII.4型诺如病毒衣壳蛋白VP1和病毒样颗粒VLP单克隆抗体在制备GII.4型诺如病毒衣壳蛋白VP1和病毒样颗粒VLP检测试剂或试剂盒中的应用。
本发明另外提供一种GII.4型诺如病毒衣壳蛋白VP1和病毒样颗粒VLP检测试剂盒，所述的试剂盒包括抗GII.4型诺如病毒衣壳蛋白VP1和病毒样颗粒VLP单克隆抗体。
本发明再提供一种GII.4型诺如病毒衣壳蛋白VP1和病毒样颗粒VLP检测试剂，其特征在于，所述的试剂包括抗GII.4型诺如病毒衣壳蛋白VP1和病毒样颗粒VLP单克隆抗体。
本发明的杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体具有效价高、特异性好的优势，能很好地识别GII.4型诺如病毒衣壳蛋白VP1、识别GII.4型诺如病毒病毒样颗粒VLP和天然诺如病毒粪便样本。
本发明通过间接ELISA双筛筛选得到的阳性杂交瘤细胞能够分泌制备得特异性强、敏感性高、稳定的抗GII.4型诺如病毒衣壳蛋白VP1和病毒样颗粒VLP单克隆抗体，且可用于建立一种诺如病毒的检测试剂盒。
本发明与现有技术相比，其有益效果为：
本发明提供的单克隆抗体制备方法快速，纯化步骤简单，成本低，蛋白表达量大等优点。相比于其他表达系统比如杆状病毒表达系统，存在不可避免引入昆虫细胞宿主蛋白和DNA、杆状病毒结构、非结构蛋白和DNA的风险。大肠杆菌是人体的正常共生菌，不会对人体带来潜在的风险，不会引入过多的外源因子。本发明利用大肠杆菌原核表达系统制备重组免疫原，操作简单，在疫苗开发等领域有着明显的优势。另外，相比于公开的发明（一种GII.4型诺如病毒广谱单克隆抗体的制备方法及用途（201910199457.2）），本发明的GII.4型诺如病毒衣壳蛋白VP1和病毒样颗粒VLP单克隆抗体的制备方法易于操作，反应条件温和，避免了外源蛋白的污染，可控性强，能够制备出针对大肠杆菌原核表达系统表达的GST-VP1重组蛋白、杆状病毒表达系统获得的诺如病毒病毒样颗粒VLP和天然诺如病毒粪便样本都具有明显的特异性和检测效果的单克隆抗体，效价可达1:107。
附图说明
图1为鉴定重组蛋白的纯化分析结果图，其中M为蛋白分子量标准，1为纯化前沉淀组分，2为穿流液，3～14为洗脱的纯化重组蛋白；
图2为鉴定单克隆抗体的纯化分析结果图，其中M为蛋白分子量标准，1～3分别为纯化的单克隆抗体Mab C1、Mab D9和Mab H6；
图3为单克隆抗体的Western Blot鉴定分析结果图，A为纯化的单克隆抗体对GST蛋白对照和GST-VP1 重组蛋白的识别效果对比，其中1为GST蛋白对照，2～4分别为纯化的单克隆抗体Mab C1、Mab D9和Mab H6；
B为纯化的单克隆抗体对天然诺如病毒粪便样本的识别效果，其中M为蛋白分子量标准，1为GST蛋白对照，2～4分别为纯化的单克隆抗体Mab C1、Mab D9和Mab H6；
图4为GII.4型诺如病毒病毒样颗粒VLP的透射电镜图片；
图5为单克隆抗体检测病毒样颗粒VLP的Western Blot分析结果图，其中M为蛋白分子量标准，1为细胞上清对照，2～4分别为纯化的单克隆抗体Mab C1、Mab D9和Mab H6；
图6为鉴定单克隆抗体的效价测定图；
图7为鉴定单克隆抗体的亲和力检测图，其中A、B、C拟合曲线分别代表单克隆抗体MabC1、Mab D9和Mab H6的亲和力指征。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
本发明除非另有说明，否则百分号代表体积百分数，比例代表体积比。
一、杂交瘤细胞株的建立
（1.1）免疫原的制备，具体是：
根据NCBI上发表的诺如病毒GII.4_Sydney2012株基因组全长序列（GenBankKJ196293.1）进行体外合成，根据表达载体pGEX-5X-1的多克隆位点，设计合成包含EcoR I和Xho I酶切位点的不同引物（GII.4VP1-F-EcoRI、GII.4VP1-R-XhoI）用以扩增GII.4型诺如病毒衣壳蛋白VP1基因序列，并与表达载体pGEX-5X-1经EcoR I/Xho I双酶切后连接，将目的蛋白VP1构建到pGEX-5X-1原核表达载体后，连接产物转化至大肠埃希菌BL21感受态细胞中，次日挑取单菌落进行菌落鉴定，挑取鉴定正确的菌落接种于含有100 μg/mL氨苄西林的LB液体培养基中震荡培养12-16h，菌液送至昆明硕擎生物科技有限公司进行测序鉴定正确，获得重组质粒pGEX-5X-1-VP1。其中GII.4 诺如病毒衣壳蛋白VP1基因序列如SEQ IDNO.1所示。
上述过程中涉及的扩增体系及程序为：用设计合成的GII.4VP1-F-EcoRI、GII.4VP1-R-XhoI为引物，引物序列如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.2所示。
反应体系设计为50uL总体系，具体是2×PCR Buffer( Takara PrimerSTAR MaxDNA) 25uL，浓度为10mM的上、下游引物各1.5uL，GII.4质粒模板1uL，用灭菌水补足50uL体系。
反应条件为：98℃预变性2min，循环内98℃变性10s，55℃退火5s，72℃延伸10s，35个循环；PCR反应循环后72℃继续延伸5min，然后4℃保存；
酶切体系为50uL总体系，具体是10×PCR Buffer( CutSmart™ 缓冲液) 5uL，EcoRI、XhoI各2uL，GII.4VP1质粒模板41uL。置于37℃水浴中进行6h双酶切反应，酶切产物分别用DNA纯化回收试剂盒(TIANGEN)进行琼脂糖凝胶回收纯化；
连接体系为20uL总体系，GII.4VP1片段0.45uL，pGEX-5X-1片段3.5uL，10× T4 Buffer2uL，T4 DNA Ligase 1uL，用灭菌水补足20uL体系，反应条件为16℃静置过夜。
将鉴定正确的pGEX-5X-1-VP1菌液以1:50的稀释度接种于新鲜LB液体培养基中，于37℃ 220rpm/min震荡培养2-3h，直到菌液OD600达0.4-0.6。然后加入IPTG至终浓度1mmol/L，从而诱导目的基因的表达，经过多次条件摸索，确定蛋白表达条件为20℃ 220rpm/min诱导表达6h。诱导表达后的菌液经4℃、8000rmp/min离心弃上清，收集菌体，用30ml PBS重悬菌体后离心收集菌体，再用亲和纯化的结合缓冲液（亲和纯化的结合缓冲液配方如下：NaCl 8.2g，KCl 0.2g，Na2HPO4-12H2O 3.58g，KH2PO4 0.25g，DTT 1.54g，pH 7.3，蒸馏水定容至1L，0.45µm滤膜过滤，4℃保存，DTT购自sigma，其余试剂为国产分析纯试剂）重悬菌体并于冰浴中进行超声破碎，超声破碎后4℃ 12000rpm/min离心20分钟，含有重组蛋白GST-VP1的上清液经Glutathione Sepharose 4 Fast Flow（购自GE）进行亲和层析柱纯化，目的蛋白因为GST标签可以结合于柱子上，需要通过洗脱而获得，其他杂蛋白则直接穿流而过。SDS-PAGE分析蛋白纯化效果，如图1，纯化重组蛋白GST-VP1在约85kDa 处有一明显条带。空载体pGEX-5X-1转化BL21感受态细胞后按同样方法进行表达和纯化，得到纯化的GST标签蛋白。
（1.2）动物免疫，具体是：取6～8周龄Balb/c小鼠，以3 周间隔进行四次免疫，程序为：首次免疫，弗氏完全佐剂与等量GST-VP1重组蛋白充分混合乳化后，背部皮下多点注射，50μg/只。第二次免疫和第三次免疫，佐剂换为弗氏不完全佐剂（所用佐剂均购买自sigma），方法和计量同首次免疫。第四次加强免疫采用腹腔注射未加佐剂的GST-VP1重组蛋白，注射量同前三次免疫。加强免疫后3天，取免疫小鼠脾脏细胞用于制备杂交瘤细胞；
（1.3）小鼠脾细胞和SP2/0细胞的融合，具体是：细胞融合前2天，取免疫小鼠脾脏细胞用于制备杂交瘤细胞。选择6～8周龄Balb/c小鼠，取其腹腔巨噬细胞制备饲养层细胞，使细胞浓度为105个/mL，加入96孔板，每孔100μL，置于37℃、5％CO2条件下培养备用。取处于对数生长期的SP2/0细胞（购自ATCC）与步骤（1.2）免疫后的小鼠脾细胞按照1∶10的细胞数量比例进行混和，将45% 聚乙二醇4000（PEG）（购买自sigma）细胞融合后获得的杂交瘤细胞加入已含有饲养层细胞的96孔板中，使用含有1×HAT选择性培养基[50×HAT(购买自sigma)、20%(V/V)胎牛血清、1640培养基(购买自Corning)]，在37℃、5％CO2条件下培养。
（1.4）杂交瘤细胞株的筛选，具体是：将步骤（1.3）获得的杂交瘤细胞在含有1×HAT选择性培养基的条件下培养10-14天，每隔4天更换一半量的1×HAT的完全培养基。培养12天后取杂交瘤细胞上清进行间接ELISA以初次筛选能特异性分泌抗GII.4型诺如病毒衣壳蛋白VP1的杂交瘤细胞。具体步骤如下：纯化后的重组蛋白GST-VP1包被酶标板，设置空白对照，取培养上清为一抗，SP2/0细胞培养上清为阴性对照，二抗为HRP标记山羊抗小鼠IgG（1:6000）（购自Thermo），显色终止后，酶标仪检测450nm吸光度值（A450值），以高于阴性对照A450值2.1倍以上的孔为阳性细胞孔，并进行下一步的亚克隆。
（1.5）杂交瘤细胞的克隆化，具体是：选取步骤（1.4）中筛选得到的阳性细胞孔，采用有限稀释法对阳性孔的细胞进行克隆，将每孔200μL细胞吸取至加样槽，用1×HT完全培养基 [(50×HT(购买自sigma)、20%(V/V)胎牛血清、1640培养基(购买自Corning)]稀释至20mL后，均匀加至一个新的96孔板，每孔200μL，37℃、5％CO2条件下培养5天后再次进行间接ELISA检测，再次选取高于阴性对照A450值2.1倍以上且细胞生长状态良好的细胞孔，分克隆至另一个96孔板，并换1×HAT选择性培养基培养，如此重复三至四轮，直至克隆孔内抗体检测100％阳性为止。选取生长状态好的细胞，用普通完全培养基[20%(V/V)胎牛血清、1640培养基(购买自Corning)]逐步扩大培养，并液氮冻存。
在亚克隆培养筛选的过程中，用GST-VP1重组蛋白和GST蛋白分别包被酶标板，封闭后取杂交瘤细培养上清进行间接ELISA，设置空白对照，SP2/0细胞培养上清为阴性对照，HRP标记山羊抗小鼠IgG（1:6000）为二抗，根据两块酶标板A450值读数，筛选去除仅针对GST蛋白包被酶标板A450值高的杂交瘤细胞株，仅保留针对GST-VP1重组蛋白包被酶标板A450值高，且同时针对GST 蛋白包被酶标板A450值低的杂交瘤细胞株，这些杂交瘤细胞株进行进一步的亚克隆和扩增培养。
结果连续4次亚克隆阳性杂交瘤细胞得到3株稳定分泌抗体的细胞株，编号为NoVC1、NoV D9和NoV H6，分泌得到的单克隆抗体分别编号为Mab C1、Mab D9和Mab H6。
二、单克隆抗体腹水的大量制备及抗体的纯化
取8～10周龄健康的Balb/c小鼠腹腔注射500ul液体石蜡油，两周后，经小鼠腹腔注射步骤（1.5）扩大培养得到的阳性克隆细胞，每只小鼠细胞注射量为106-107个，10-14天后收取腹水样品分装冻存或进行纯化。将上述小鼠腹水8000rpm/min离心30分钟，除去细胞成分和其他的沉淀物，收集的上清经Protein A柱（购买自全式金）纯化，用12％的SDS-PAGE进行抗体纯度和完整性分析，图2显示了3株单克隆抗体的重链和轻链分别为55KD和28KD左右，最终得到的小鼠抗GII.4型诺如病毒衣壳蛋白主要衣壳蛋白VP1的单克隆抗体用超滤离心管浓缩至1mg/mL，分装冻存备用。
三、单克隆抗体的生物特性分析与鉴定
（3.1）单克隆抗体特异性鉴定，具体是：分别取纯化的GST、GST-VP1及天然诺如病毒粪便样本，按4:1比例加入5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液[250Mm Tris-HCl(pH6.8)，10％(W/V)SDS，0.5％(W/V)BPB，50％(V/V)甘油，5％(W/V)β-巯基乙醇]，加入样品后缓冲液终浓度为1×，95℃加热10分钟，以充分变性蛋白。冷却到室温后，把蛋白样品直接上样到SDS-PAGE胶加样孔内即可。80V 30分钟，150V 50分钟电泳。使用半干转膜装置(BIO-RAD)，设定转膜电流为100mA，转膜时间为45分钟，按照转膜仪的说明书，将电泳后的蛋白转印至PVDF膜（购买自Millipore）上。转膜完毕后，立即把转膜完成的PVDF膜放置到预先准备好的5%（W/V）脱脂奶粉的TBS [20mM Tris-HCl，500 mM NaCl(pH7.5)]中，在摇床上缓慢摇动，室温封闭60分钟。纯化的单克隆抗体作为一抗，用TBST[20mM Tris-HCl，500 mM NaCl(pH7.5) 0.01%Tween-20(V/V)]将其稀释成1∶1000，加入至封闭完成后的PVDF膜中孵育过夜。弃一抗稀释液。加入TBST洗膜液5ml。在侧摆摇床上摇动，重复5次。随后以HRP标记的山羊抗小鼠IgG为二抗（用TBST稀释1:10000）进行室温孵育1h。弃二抗稀释液，TBST洗膜重复5次，加入ECL（购买自Millipore）试剂，在暗室压片，经显影液定影液进行洗片或者进行机器曝光，检测单克隆抗体的识别效果。结果如图3，间接ELISA双筛筛选到的3株单克隆抗体能特异性识别GST-VP1重组蛋白，但不识别GST标签蛋白，对于天然病毒粪便样本同样具有很好的识别作用。
（3.2）单克隆抗体检测GII.4病毒样颗粒VLP，具体是：
根据（1.1）免疫原的制备中涉及的扩增体系及条件，从诺如病毒全长质粒中扩增GII.4型诺如病毒衣壳蛋白VP1基因片段。根据Bac-to-Bac® TOPO® 克隆试剂盒说明书，参照平末端TOPO克隆反应体系及条件将GII.4型VP1基因扩增产物与pFastBac™/NT-TOPO®vector载体（购买自Invitrogen）进行连接，连接产物转化进One Shot® Mach1™ T1RChemically Competent E. coli.并筛选正确插入的重组转座载体pFastBac-VP1。其中涉及的连接体系为6uL总体系，包括GII.4型VP1基因扩增产物 2uL，pFastBac™/NT-TOPO®vector载体1uL，盐溶液1uL（1.2M NaCl，0.06M MgCl2），无菌水补足至6uL，将体系混匀后室温反应5min即可。
根据Bac-to-Bac TOPO®杆状病毒表达系统，以上述产物为供体质粒转化至DH10Bac感受态细胞，通过X-gal和IPTG的抗性筛选获得重组杆状病毒Bacmid。利用Cellfectin 转染试剂将鉴定正确的Bacmid DNA转染至sf9 细胞，置 27℃悬浮培养，72h后收获转染病变细胞上清，分装至无菌冻存管中，置4℃或-80℃保存，并将原代病毒感染sf9细胞进行扩增传代。待sf9细胞生长至70％～80％丰度时接种重组杆状病毒（MOI＝5），置于27℃控温摇床中140rpm/min悬浮培养，用于GII.4型诺如病毒衣壳蛋白VP1的表达，3-5天后收集细胞，反复冻融 5 次以破碎细胞，4℃ 5000g离心30 min，去除细胞碎片，上清进行14100×g 超速离心3h以收获诺如病毒病毒样颗粒VLP，PBS重悬，利用不连续蔗糖密度梯度超速离心，纯化得VLP并经负染电镜得到证实，如图4可见，电镜照片下的诺如病毒颗粒形态单一，为典型的空心病毒样颗粒，其直径约为20-30nm，与以往文献报道一致，说明重组衣壳蛋白在体外形成了诺如病毒病毒样颗粒VLP。
诺如病毒病毒样颗粒VLP样品作为实验组，sf9 细胞培养上清作为对照组，分别与5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液按4:1比例混合后，95℃加热处理10分钟，以充分变性蛋白，经12％聚丙烯酰胺凝胶80V 30分钟，150V 50分钟电泳分离蛋白样品，使用半干转膜装置(BIO-RAD)，设定转膜电流为100mA，转膜时间为45分钟，将电泳后的蛋白转移到PVDF膜（购买自Millipore）上。用5%（W/V）脱脂奶粉的TBS溶液室温封闭60分钟，纯化的单克隆抗体作为一抗，用TBST稀释1∶1000，加入至封闭完成后的PVDF膜中孵育过夜。弃一抗稀释液，加入5ml TBST洗膜液，重复5次，随后以HRP标记的山羊抗小鼠IgG为二抗（用TBST稀释1:10000）进行室温孵育1 h。弃二抗稀释液，加入5ml TBST洗膜液，重复5次，加入ECL（购买自Millipore）试剂，在暗室压片，经显影液定影液进行洗片或者进行机器曝光，检测单克隆抗体的识别效果。结果如图5，间接ELISA双筛筛选到的3株单克隆抗体能很好的识别诺如病毒病毒样颗粒VLP，可用于检测样品中GII .4型诺如病毒病毒样颗粒VLP的存在以及试剂盒的研发。
（3.3）ELISA法测定单克隆抗体效价，具体是：将目的检测蛋白GST-VP1用PBS缓冲液稀释至1μg/ml，每孔100μl的量包被于96孔酶标板，4℃孵育过夜；弃去孔内溶液，0.05％PBST洗板3次，5％脱脂奶粉的PBST以每孔200μl的量加入酶标孔中，于37℃孵育2h，对其进行封闭；弃去孔内溶液，用0.05％PBST洗板3次，将步骤二得到的纯化的腹水单克隆抗体。用PBS缓冲液按10倍稀释度进行倍比稀释，分别取100μl加入已包被的反应孔（被目的检测蛋白GST-VP1包被的）中，37℃孵育1h，同时做空白孔和阴性对照孔，空白孔为不包被的孔，阴性对照孔用PBS溶液替代腹水单克隆抗体作为一抗。弃去孔内溶液，用0.05％PBST洗板3次，于各反应孔中，加入新鲜稀释HPR-羊抗鼠IgG （1∶6000），每孔100μL，于37℃孵育1h；弃去孔内溶液，用0.05％PBST洗板3次，每孔加入TMB底物显色溶液100μl，于37℃避光显色10min后加入100μl 2M硫酸终止反应，测定波长为450nm的吸光值（A450值）。以将A450值大于对照组A450值2.1倍的检测孔的最大抗体稀释度即为抗体效价。结果如图6，倍比稀释测得纯化后的GII.4型诺如病毒单克隆抗体Mab C1、Mab D9和Mab H6的效价均可达1:107。
（3.4）单克隆抗体的亲和力测定，具体是：采用Biacore方法对单克隆抗体亲和力进行测定，试验由Biacore T200分子互作分析系统完成，利用蛋白间相互作用机制分别将筛选到的3株单克隆抗体结合到Series S Sensor Chip Protein A芯片上，控制蛋白结合信号在200 RU以下。HBS-EP作为工作缓冲液，将GST-VP1重组蛋白用HBS-EP缓冲液稀释至不同浓度（33.33、22.22、14.81、9.88、6.58、4.39、2.93、1.95、1.30、0.87、0.58 μg/ml）。采用10 mM Glycine-HCl溶液作为再生液。通过Biacore T200分析软件拟合得到亲和力曲线，横坐标为稀释的抗原浓度，纵坐标为响应值，最终得出亲和力常数KD(M)，从而评估筛选的单克隆抗体的亲和力效果。拟合曲线图7表明，该实验可信度较高，3株GII.4型诺如病毒单克隆抗体Mab C1、Mab D9和Mab H6的亲和力常数KD(M)值分别为4.422×10-7、4.303×10-8、7.54×10-7 mol/L。
诺如病毒是世界范围内引起急性病毒性胃肠炎的主要病原体。诺如病毒感染造成的社会和经济负担已经成为严重的全球公共卫生问题，WHO也将防治诺如病毒感染提到重要的地位，特别是在临床检测诺如病毒、预防病毒感染以及开发疫苗方面给予了高度重视。GII.4型诺如病毒Sydney株作为近几年来优势的流行病毒株，其强传染性多次引起暴发流行，给国家带来了沉重的疾病负担。由于诺如病毒的体外培养问题、合适的动物模型的缺乏、病毒基因型别的复杂和快速变异性也都严重阻碍了诺如病毒传统疫苗研发的进程。
本发明提供了一种原核表达系统构建的pGEX-5X-1-VP1重组蛋白作为免疫原，用于刺激机体产生对抗诺如病毒的特异性抗体，联合杂交瘤技术，通过细胞融合和克隆化成功筛选获得3株能稳定分泌抗GII.4型诺如病毒衣壳蛋白VP1和病毒样颗粒VLP单克隆抗体的杂交瘤细胞株。Western Blot及间接ELISA分析表明，筛选到的单克隆抗体对于大肠埃希菌中重组表达的GST-VP1重组蛋白、杆状病毒表达系统制备的诺如病毒病毒样颗粒VLP和临床诺如病毒样品都具有明显的抗体特异性和检测效果，这为将这些单克隆抗体开发成诺如病毒检测试剂盒提供了有利的理论依据。本发明筛选的杂交瘤细胞株对于后期建立临床样本中GII.4型诺如病毒快速检测的方法以及研制开发诺如病毒疫苗等领域都有着明显的优势和可适用性潜力。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
序列表
SEQ ID NO .1
atgaagatgg cgtcgagtga cgccaaccca tctgatgggt ccgcagccaa cctcgtccca 60
gaggtcaaca atgaggttat ggctctggag cccgttgttg gtgccgccat tgcggcacct 120
gtagcgggcc aacaaaatgt aattgacccc tggattagaa ataattttgt acaagcccct 180
ggtggagagt ttacagtatc ccctagaaac gctccaggtg aaatactatg gagcgcgccc 240
ttgggccctg atctaaatcc ctacctatcc catttggcca gaatgtacaa tggttatgca 300
ggtggttttg aagtgcaggt aattctcgcg gggaacgcgt tcaccgccgg gaaggtcata 360
tttgcagcag tcccaccaaa ttttccaact gaaggcttga gccccagcca ggtcactatg 420
ttcccccata tagtagtaga tgttaggcaa ctagaacctg tgttgattcc cttacccgat 480
gttaggaata atttctatca ttacaatcaa tcaaatgacc ccaccattaa gttgatagca 540
atgttgtata caccacttag ggctaataat gctggggatg atgtcttcac agtctcttgc 600
cgagttctca cgagaccatc ccccgatttt gatttcatat ttctagtgcc acccacagtt 660
gagtcaagaa ctaaaccatt ctctgtccca gttttaactg ttgaggagat gaccaattca 720
agattcccca ttcctttgga aaagttgttc acgggtccca gcagtgcctt tgttgtccaa 780
ccacaaaacg gtaggtgcac gactgatggc gtgctcctag gcaccaccca actgtctcct 840
gtcaacatct gcaccttcag aggagatgtc acccatatca caggtagtcg taactacaca 900
atgaatttgg cttctcaaaa ttggagcaat tatgacccaa cagaagaaat cccagcccct 960
ctaggaactc cagattttgt ggggaagatt caaggcgtgc tcacccaaac cacaaggaca 1020
gatggctcaa cacgcggcca caaagccaca gtgtacactg ggagcgccga ctttgctcca 1080
aaactgggta gagttcaatt tgaaactgac acagaccgtg attttgaagc taaccaaaac 1140
acaaagttca ccccagttgg tgtcatccaa gatggtagca ccacccaccg aaatgaaccc 1200
caacagtggg tgctcccaag ttactcaggc agaaatactc ctaatgtgca tctggccccc 1260
gctgtagccc ccacttttcc gggtgagcaa cttctcttct tcagatccac catgcccgga 1320
tgcagcgggt accccaacat ggatttggac tgtctgctcc cccaggaatg ggtgcagtac 1380
ttctaccaag aggcagcccc agcacaatct gatgtggctc tgctaagatt tgtgaatcca 1440
gacacaggta gggttttgtt tgagtgtaag cttcataaat caggctatgt tacagtggct 1500
cacactggcc aacatgattt ggttatcccc cccaatggtt attttaggtt tgattcctgg 1560
gtcaaccagt tttacacgct tgcccccatg ggaaatggaa cggggcgtag acgtgcacta 1620
taa 1623
SEQ ID NO.2
gaattcatga agatggcgtc ga 22
SEQ ID NO.3
ctcgagttat agtgcacgtc ta 22
序列表
<110> 中国医学科学院医学生物学研究所
<120> 抗GII.4型诺如病毒衣壳蛋白VP1和病毒样颗粒VLP单克隆抗体的制备方法和应用
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1623
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 1
atgaagatgg cgtcgagtga cgccaaccca tctgatgggt ccgcagccaa cctcgtccca 60
gaggtcaaca atgaggttat ggctctggag cccgttgttg gtgccgccat tgcggcacct 120
gtagcgggcc aacaaaatgt aattgacccc tggattagaa ataattttgt acaagcccct 180
ggtggagagt ttacagtatc ccctagaaac gctccaggtg aaatactatg gagcgcgccc 240
ttgggccctg atctaaatcc ctacctatcc catttggcca gaatgtacaa tggttatgca 300
ggtggttttg aagtgcaggt aattctcgcg gggaacgcgt tcaccgccgg gaaggtcata 360
tttgcagcag tcccaccaaa ttttccaact gaaggcttga gccccagcca ggtcactatg 420
ttcccccata tagtagtaga tgttaggcaa ctagaacctg tgttgattcc cttacccgat 480
gttaggaata atttctatca ttacaatcaa tcaaatgacc ccaccattaa gttgatagca 540
atgttgtata caccacttag ggctaataat gctggggatg atgtcttcac agtctcttgc 600
cgagttctca cgagaccatc ccccgatttt gatttcatat ttctagtgcc acccacagtt 660
gagtcaagaa ctaaaccatt ctctgtccca gttttaactg ttgaggagat gaccaattca 720
agattcccca ttcctttgga aaagttgttc acgggtccca gcagtgcctt tgttgtccaa 780
ccacaaaacg gtaggtgcac gactgatggc gtgctcctag gcaccaccca actgtctcct 840
gtcaacatct gcaccttcag aggagatgtc acccatatca caggtagtcg taactacaca 900
atgaatttgg cttctcaaaa ttggagcaat tatgacccaa cagaagaaat cccagcccct 960
ctaggaactc cagattttgt ggggaagatt caaggcgtgc tcacccaaac cacaaggaca 1020
gatggctcaa cacgcggcca caaagccaca gtgtacactg ggagcgccga ctttgctcca 1080
aaactgggta gagttcaatt tgaaactgac acagaccgtg attttgaagc taaccaaaac 1140
acaaagttca ccccagttgg tgtcatccaa gatggtagca ccacccaccg aaatgaaccc 1200
caacagtggg tgctcccaag ttactcaggc agaaatactc ctaatgtgca tctggccccc 1260
gctgtagccc ccacttttcc gggtgagcaa cttctcttct tcagatccac catgcccgga 1320
tgcagcgggt accccaacat ggatttggac tgtctgctcc cccaggaatg ggtgcagtac 1380
ttctaccaag aggcagcccc agcacaatct gatgtggctc tgctaagatt tgtgaatcca 1440
gacacaggta gggttttgtt tgagtgtaag cttcataaat caggctatgt tacagtggct 1500
cacactggcc aacatgattt ggttatcccc cccaatggtt attttaggtt tgattcctgg 1560
gtcaaccagt tttacacgct tgcccccatg ggaaatggaa cggggcgtag acgtgcacta 1620
taa 1623
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
gaattcatga agatggcgtc ga 22
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 3
ctcgagttat agtgcacgtc ta 22

Claims (8)

1.抗GII.4型诺如病毒衣壳蛋白VP1和病毒样颗粒VLP单克隆抗体杂交瘤细胞株的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤（1），免疫原的制备：通过PCR扩增获取诺如病毒衣壳蛋白VP1基因序列，扩增产物与pGEX-5X-1表达载体分别酶切后连接，从而构建重组质粒pGEX-5X-1-VP1，IPTG诱导表达并通过亲和层析纯化得重组蛋白GST-VP1；
步骤（2），动物免疫：取6～8周龄Balb/c小鼠，以3周间隔进行四次免疫，程序为：首次免疫，弗氏完全佐剂与等量重组蛋白GST-VP1充分混合乳化后，背部皮下多点注射；第二次免疫和第三次免疫，佐剂换为弗氏不完全佐剂，方法和计量同首次免疫；第四次采用腹腔注射未加佐剂的重组蛋白GST-VP1，注射量同首次免疫；3天后，取免疫小鼠脾脏细胞用于制备杂交瘤细胞；
步骤（3），杂交瘤细胞株的制备和筛选：将步骤（2）得到的小鼠脾脏细胞与骨髓瘤细胞通过PEG4000的作用下进行细胞融合，利用1×HAT选择性培养基培养融合后的杂交瘤细胞，细胞融合后12-14天，通过酶联免疫吸附试验检测细胞上清以筛选能特异性分泌抗诺如病毒衣壳蛋白VP1单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
2.根据权利要求1所述的抗GII.4型诺如病毒衣壳蛋白VP1和病毒样颗粒VLP单克隆抗体的制备方法，其特征在于，所述的诺如病毒衣壳蛋白VP1序列是根据GII.4型诺如病毒Sydney株基因序列进行体外合成。
3.根据权利要求1所述的抗GII.4型诺如病毒衣壳蛋白VP1和病毒样颗粒VLP单克隆抗体的制备方法，其特征在于，还包括杂交瘤细胞的克隆化，具体是：通过有限稀释法对特异性分泌抗诺如病毒衣壳蛋白VP1单克隆抗体的杂交瘤细胞株进行亚克隆培养，连续培养多次，直至克隆孔内抗体检测100％阳性为止，扩大培养并冻存。
4.根据权利要求1所述的抗GII.4型诺如病毒衣壳蛋白VP1和病毒样颗粒VLP单克隆抗体的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，注射量为50μg/只。
5.一种由权利要求1~4任意一项所述的杂交瘤细胞株分泌的抗GII.4型诺如病毒衣壳蛋白VP1和病毒样颗粒VLP单克隆抗体。
6.权利要求5所述的抗GII.4型诺如病毒衣壳蛋白VP1和病毒样颗粒VLP单克隆抗体在制备GII.4型诺如病毒衣壳蛋白VP1和病毒样颗粒VLP检测试剂或试剂盒中的应用。
7.一种GII.4型诺如病毒衣壳蛋白VP1和病毒样颗粒VLP检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括权利要求5所述的抗GII.4型诺如病毒衣壳蛋白VP1和病毒样颗粒VLP单克隆抗体。
8.一种GII.4型诺如病毒衣壳蛋白VP1和病毒样颗粒VLP检测试剂，其特征在于，所述的试剂包括权利要求5所述的抗GII.4型诺如病毒衣壳蛋白VP1和病毒样颗粒VLP单克隆抗体。
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