CN115894672A - 一种针对诺如病毒gⅱ基因型vp1蛋白的单克隆抗体及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种抗诺如病毒GⅡ基因型VP1抗原单克隆抗体及其应用，所述抗诺如病毒GⅡ基因型VP1抗原单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括SEQ ID NO.3所示的重链CDR3，所述轻链可变区包括SEQ ID NO.6所示的轻链CDR3。所述单克隆抗体为兔源单克隆抗体，所述单克隆抗体的特异性好、亲和力高，解决了鼠源单克隆抗体在实际应用方面的问题，所述抗诺如病毒GⅡ基因型VP1抗原单克隆抗体在制备诺如病毒检测的产品中具有重要应用价值。

Description

一种针对诺如病毒GⅡ基因型VP1蛋白的单克隆抗体及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种针对诺如病毒GⅡ基因型VP1蛋白原的单克隆抗体及其应用。

背景技术

诺如病毒感染性腹泻在全世界范围内均有流行，全年均可发生感染，感染对象主要是成人和学龄儿童，寒冷季节呈现高发。美国每年在所有的非细菌性腹泻爆发中，60%-90%是由诺如病毒引起。荷兰、英国、日本、澳大利亚等发达国家也都有类似结果。在中国5岁以下腹泻儿童中，诺如病毒检出率为15%左右，血清抗体水平调查表明中国人群中诺如病毒的感染亦十分普遍。

诺如病毒属于嵌杯病毒科诺如病毒属，直径约为26～35纳米，无包膜，表面粗糙，球形，呈对称的二十面体，是单股正链RNA的病毒。电镜显示，病毒具有典型的羽状外缘，为表面有凹痕的小圆状结构。诺如病毒基因组全长约7.7kb，根据衣壳蛋白1核苷酸序列的不同，将该病毒分为GⅠ～GⅦ共7组。严格来讲，仅有GⅠ、GⅡ和GⅣ可以感染人类，被通称为人源诺如病毒。自1995-1996年诺如病毒首次导致世界性大流行以来，GⅡ群中的第4基因型（GⅡ.4），在世界范围内的流行中占据主导地位，且几乎每隔两、三年，GⅡ.4便会引发一次大范围流行，同时出现一种新的变异株。诺如病毒的遗传物质基因组的5’端与病毒蛋白VPg连接，3’端存在多聚腺苷化，含有三个开放读码框（ORF），编码8个病毒蛋白。ORF-2和ORF-3分别编码病毒结构蛋白，病毒蛋白1 (VP1)和VP2。成熟的病毒颗粒包含90个VP1二聚体，组成二十面体对称结构，并在病毒表面形成空洞或杯状结构。VP1蛋白目前已被证明是诺如病毒的主要免疫原性蛋白。

单克隆抗体是由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体，称为单克隆抗体。通常采用杂交瘤技术来制备，杂交瘤（hybridoma）抗体技术是在细胞融合技术的基础上，将具有分泌特异性抗体能力的致敏B细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合为B细胞杂交瘤。用具备这种特性的单个杂交瘤细胞培养成细胞群，可制备针对一种抗原表位的特异性抗体即单克隆抗体。目前，使用最广泛的单克隆抗体是鼠源单克隆抗体，但鼠源单克隆抗体存在亲和力弱、特异性差的问题。近些年兔单克隆抗体技术发展迅速，与鼠单克隆抗体相比，兔单克隆抗体具有识别更多位点、更强的亲和性和特异性等优点。

性能优良的抗体是免疫检测技术的基础，只有具有好的抗体，才能研发出性能优良的免疫检测试剂盒。因此，提供一种亲和能力高的抗诺如病毒GⅡ基因型VP1蛋白单克隆抗体对于检测诺如病毒具有重要意义。

发明内容

本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种针对诺如病毒GⅡ基因型VP1的单克隆抗体，所述单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区；

所述重链可变区包括SEQ ID NO.3所示的重链CDR3；

所述轻链可变区包括SEQ ID NO.6所示的轻链CDR3。

优选地，所述重链可变区还包括SEQ ID NO.1所示的重链CDR1和SEQ ID NO.2所示的重链CDR2。

优选地，所述轻链可变区还包括SEQ ID NO.4所示的轻链CDR1和SEQ ID NO.5所示的轻链CDR2。

SEQ ID NO.1：EYGMS。

SEQ ID NO.2：GINWNGGTTGYSESVKG。

SEQ ID NO.3：SRYFDFRGYFDY。

SEQ ID NO.4：RTSQSLGSNYFA。

SEQ ID NO.5：EASRRAT。

SEQ ID NO.6：QQYWHSPLT。

本发明中所述单克隆抗体抗的原识别位点多、特异性好、亲和力高；所述单克隆抗体为兔源单克隆抗体，抗原识别位点多；所述单克隆抗体不与其他基因型VP1（包括GⅠ、GⅢ、GⅣ、GⅤ、GⅥ、GⅦ）产生交叉反应，特异性强；筛选的单克隆抗体对GXM抗原具有较强的结合能力，亲和力高，对GXM抗原的效价达到1:1280000（OD值＞0.5）。

优选地，所述重链可变区的氨基酸序列包括SEQ ID NO.7所示的序列。

优选地，所述轻链可变区的氨基酸序列包括SEQ ID NO.8所示的序列。

SEQ ID NO.7：

METGLRWLLLVAVLKGVQCEQLTESGGGLSMPRLSLKLSCKASGFTLSEYGMSWVRQAPGKGLEWNGGINWNGGTTGYSESVKGRFTVSRFNIESGPDLQMSSLTKTDTSLYYGARSRYFDFRGYFDYWGQGTLVTVSS

SEQ ID NO.8：

MDTRAPTQLLGLLLLWLPGATFAVTTHTPSPVSAAVGDTVTINCRTSQSLGSNYFAWYQQNPGQPPKLLIYEASRRATGVPSRFRGSGSGTQFTLTISGMKAEDVATYYCQQYWHSPLTFGGGTKVEIK

优选地，所述抗诺如病毒VP1抗原单克隆抗体还包括兔源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恒定区中的任意一种或至少两种的组合，优选为兔源IgG1恒定区。

本发明选择新西兰大耳兔为实验动物，制备单克隆抗体，克服了小鼠源抗体亲和力弱的缺陷；本发明以诺如病毒VP1抗原作为抗原进行免疫，得到的脾脏细胞通过与骨髓瘤细胞进行细胞融合得到兔源单克隆抗体，稳定性好，对诺如病毒VP1抗原具有很强的亲和性。

第二方面，本发明提供一种核酸分子，所述核酸分子编码第一方面所述抗诺如病毒VP1抗原单克隆抗体。

优选地，编码所述抗诺如病毒VP1抗原单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列包括SEQ ID NO.9所示的序列；编码所述抗诺如病毒VP1抗原单克隆抗体的轻链可变区的核苷酸序列包括SEQ ID NO.10所示的序列。

SEQ ID NO.9：

ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCGCTGTGCTCAAAGGTGTCCAGTGTGAGCAGCTGACCGAGTCCGGGGGAGGCCTGAGCATGCCTCGCCTGTCCCTGAAACTCTCCTGCAAAGCCTCTGGATTCACCCTCAGTGAGTATGGCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGAATGGAGGTATTAATTGGAATGGTGGTACCACAGGTTATTCAGAGTCTGTGAAGGGCCGATTCACCGTCTCCAGATTCAACATCGAGAGCGGCCCGGATCTGCAAATGAGCAGTCTGACAAAGACGGACACGTCCCTCTATTACGGTGCAAGGTCCCGATATTTTGACTTCAGGGGTTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA。

SEQ ID NO.10：

ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCACATTTGCCGTGACGACCCATACTCCATCCCCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAGACACTGTCACCATCAATTGCAGGACCAGTCAGAGTCTTGGGAGCAACTATTTTGCCTGGTACCAGCAGAATCCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTATGAAGCGTCCAGGAGGGCCACTGGGGTGCCTTCGCGATTCCGTGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTTACCATCAGCGGCATGAAGGCTGAAGATGTTGCCACCTATTACTGTCAGCAGTATTGGCACTCACCTCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA。

附图说明

图1为实施例6中单克隆抗体的亲和活性的检测结果。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例1 抗原制备

抗原的制备方法如下所示：

（1）诺如病毒GⅡ基因型VP1蛋白序列如下：

[GeneID=39105315]MKMASSDANPSDGSAANLVPEVNNEVMALEPVVGAAIAAPVAGQQNVIDPWIRNNFVQAPGGEFTVSPRNAPGEILWSAPLGPDLNPYLSHLARMYNGYAGGFEVQVILAGNAFTAGKIIFAAVPPNFPTEGLSPSQVTMFPHIIVDVRQLEPVLIPLPDVRNNFYHYNQSNDSTIKLIAMLYTPLRANNAGDDVFTVSCRVLTRPSPDFDFIFLVPPTVESRTKPFSVPVLTVEEMTNSRFPIPLEKLFTGPSSAFVVQPQNGRCTTDGVLLGTTQLSPVNICTFRGDVTHITGSRNYTMNLASQNWNNYDPTEEIPAPLGTPDFVGKIQGMLTQTTRTDGSTRGHKATVYTGSADFAPKLGRVQFETDTDHDFEANQNTKFTPVGVIQDGSTTHRNEPQQWVLPSYSGRNTHNVHLAPAVAPTFPGEQLLFFRSTMPGCSGYPNMDLDCLLPQEWVQYFYQEAAPAQSDVALLRFVNPDTGRVLFECKLHKSGYVTVAHTGQHDLVIPPNGYFRFDSWVNQFYTLAPMGNGTGRRRVV

（2）构建蛋白的表达载体

根据查到的序列结果，设定合适的酶切位点，分别对重链和轻链进行基因合成；将基因合成产物分别连接到pcDNA3.4表达载体。

（3）蛋白的表达与纯化

蛋白的表达：

（a）转染前的准备：细胞计数及传代处理，保证细胞具备转染条件；

（b）细胞转染：摇匀细胞液后，用移液管无菌吸取50 μL细胞悬液，加950 μL培养基稀释20倍，用细胞计数板进行细胞计数，活细胞密度约为（4.5-5.5）×106 cells/mL，细胞活率应为95-99%；

（c）配制转染试剂和质粒混合物，室温孵育20 min；

（d）将转染试剂缓慢加入待转染细胞培养液中，摇瓶置37.0±0.2℃，120 rpm和8%CO2的细胞培养摇床中培养；

（e）转染后的第2天（转染后第18至22小时，第1天），将补料添加到摇瓶中，并在添加过程中轻轻摇动摇瓶。将摇瓶置37.0±0.2℃，120 rpm和8% CO2的细胞培养摇床中培养，继续培养3-5天。

（3）蛋白的纯化

（a）细胞培养液收获：离心收集细胞培养液上清，使用Protein A Beads 进行抗体纯化；

（b）纯化完成后进行抗体浓度测定。

实施例2 动物免疫

将诺如病毒GⅡ基因型VP1蛋白与弗氏完全佐剂等体积混合至合适体积。充分乳化后对新西兰大耳兔进行皮下多点注射，每只兔的免疫剂量控制在0.1-0.8 mg。免疫前3天取新西兰大耳兔的耳血，分离血清做阴性对照。初次免疫后每2周免疫1次，方法与第1次相同。共免疫6次。

挑选适龄，重量在1.5公斤左右的新西兰大耳白兔，在标准动物房中饲养3天，如无异常情况则开始进行免疫。取上述制备的诺如病毒GⅡ基因型VP1蛋白30 μg，加入到0.5 mL高压灭菌后的生理盐水中，用微型漩涡震荡器充分混匀。然后将其与0.5 mL弗氏完全佐剂用注射器相互推拉，充分乳化，对新西兰大耳兔进行背部皮下多点注射免疫。

两周后取诺如病毒GⅡ基因型VP1蛋白30 μg，加入到0.5 mL灭菌后的生理盐水中，用微型漩涡震荡器充分混匀，然后与0.5 mL弗氏不完全佐剂用注射器相互推拉，充分乳化，进行加强免疫。此后每隔一周进行一次加强免疫，共免疫六次。并且从第三次免疫开始，免疫一周后取新西兰大耳兔耳缘静脉血200-500 μL，测定其效价及亲和性。在最后一次免疫之后取脾。

具体免疫步骤如下所示：

（1）第一周：初次免疫，将诺如病毒GⅡ基因型VP1蛋白使用生理盐水稀释为1 mg/mL，与弗氏完全佐剂1:l充分乳化，将两种溶液分别装入两个注射器中，不要产生气泡，将两个注射器对接，由慢到快逐渐混合抗原稀释液与佐剂，最终将混合液制成乳白色油包水乳浊液，然后进行背部皮下多点免疫，剂量为每只l mL。

（2）第三周：加强免疫，将诺如病毒GⅡ基因型VP1蛋白使用生理盐水稀释为0.5mg/mL与弗氏不完全佐剂1:1充分乳化，免疫剂量为每只1 mL。

（3）第五周：加强免疫，免疫方式与第三周相同，免疫剂量为每只1 mL。

（4）第六周：第一次血清效价检测；取免疫后的新西兰大耳兔的耳缘静脉血200-500 μL，静置30 min后离心分离血清，测定抗血清效价。

（5）第七周：加强免疫，免疫方式同步骤（3）。

（6）第八周：第二次血清效价检测，同步骤（4）。

（7）第九周：加强免疫，免疫方式同步骤（3）。

（8）第十周：第三次血清效价检测，同步骤（4）。

（9）第十一周：加强免疫，免疫方式同步骤（3）。

抗血清效价测定方法如下所示：

以诺如病毒GⅡ基因型VP1蛋白作为包被抗原，包被浓度为100 ng/well，37℃包被2 h，然后加入3% BSA配制的封闭液，在37℃温育1 h，甩掉液体，烘干备用。然后把制备的抗体血清进行梯度稀释，加入到酶标板中，每孔加入100 μL，37℃温育1 h，然后用PBST洗涤三次，每次静置3 min，然后以HRP标记的羊抗兔IgG作为酶标抗体，1:5000稀释，每孔加入100μL，37℃温育1 h，然后用PBST洗涤三次，每次静置40 s。每孔加入100 μL TMB静置，37℃温育显色15 min，然后每孔加入50 μL终止液结束反应，于酶标仪检测OD450值。

实施例3 兔单抗制备

对制备的兔抗血清进行效价检测，效价合格的情况下，使用合格的新西兰大耳兔的脾脏分别进行细胞融合，制备单克隆杂交瘤细胞株，具体制备方法如下所示：

（1）制备免疫脾细胞

将免疫完成的新西兰大耳兔处死，无菌条件下取脾脏。用细胞培养液洗1次后研碎，过不锈钢筛网，用细胞培养液洗2次，离心得到细胞。

（2）细胞融合

取对数期的SP2/0骨髓瘤细胞，与得到的脾细胞混合，用不含胎牛血清的细胞培养液洗一次后离心、弃上清，加入聚乙二醇溶液后37℃恒温90 s左右，用不含胎牛血清的细胞培养液终止反应后离心，用含20%胎牛血清的HAT选择培养液重悬，将细胞加到96孔板内，放入细胞培养箱内培养，培养温度为37℃，CO2含量为5.0%。

（3）细胞单克隆化与筛选

将96孔板内生长状态良好的细胞用细胞培养液稀释至1-3个细胞/mL，加入到96孔板内，放入细胞培养箱内培养，培养温度为37℃，CO2含量为5.0%。对每个细胞株分别编号，选取培养液上清呈阳性的细胞株扩大培养。最终得到杂交瘤细胞株。

（4）筛选杂交瘤细胞

对所获得的杂交瘤细胞采用ELISA方法使用进行筛选，寻找到最多10孔针对诺如病毒GⅡ基因型VP1蛋白的多克隆抗体细胞株，细胞株能产生针对各自抗原高亲和力的特异性单克隆抗体。

细胞融合步骤之后，培养基里存在两种亲本细胞和三种随机融合的细胞，要想得到能分泌目的抗体的杂交瘤细胞株，就必须把成功融合的杂交瘤细胞从众多细胞中分离出来。B淋巴细胞不能在体外长期生存，需要除去的只有骨髓瘤细胞和其自身融合细胞，因此需要将融合后的细胞通过HAT培养基培养，选择性的保留杂交瘤细胞。

融合后第5天可观察细胞的生长情况，第10-14天，即可采用间接ELISA法检测细胞培养上清并筛选阳性杂交瘤细胞株，进行克隆化培养。采用有限稀释法对阳性杂交瘤细胞进行克隆化培养。将检测结果效价最强的阳性杂交瘤细胞扩大化至细胞阳性率达100%时定株。用ELISA测量定株的杂交瘤细胞株培养上清的效价，将扩大化培养的单克隆杂交瘤细胞株冻存于液氮中。

对杂交瘤细胞上清液进行特异性和亲和力测试，并从中挑选适合配对的杂交瘤细胞；对挑选出的四孔多克隆杂交瘤细胞株进行重组表达得到单克隆抗体；对使用得到的纯化抗体进行夹心法配对，建立诺如病毒GⅡ基因型VP1蛋白的夹心法检测体系，最终分别得到配对最好的单克隆抗体。

实施例4 兔单克隆抗体序列测定

（1）从杂交瘤细胞中分离总RNA

将杂交瘤细胞匀浆化后，加入TRIzol，匀浆物可分成透明的上层水相层（含有RNA）、相界面和红色的下层有机层（含有DNA和蛋白质）。然后用异丙醇从水相层中沉淀出RNA。用乙醇从有机层中沉淀出DNA。利用异丙醇沉淀从酚-乙醇上清液中沉淀出蛋白质。洗涤沉淀的RNA，去除杂质，重悬浮后备用。

（2）将总RNA逆转录成cDNA

以dNTP为底物，以RNA为模板，tRNA为引物，在tRNA3’-末端上，按5’→3’方向，合成一条与RNA模板互补的cDNA单链，它与RNA模板形成RNA-cDNA杂交体。随后又在反转录酶的作用下，水解掉RNA链，再以cDNA为模板合成第二条DNA链。至此，将总RNA逆转录成cDNA。

（3）cDNA末端快速扩增（RACE）

根据cDNA末端快速扩增（RACE）的标准操作程序扩增重链和轻链的抗体片段。将扩增的抗体片段分别克隆到标准克隆载体中。进行菌落PCR以筛选具有正确大小的插入物的克隆。就得到了抗体序列。抗体的核苷酸序列如下所示：

编码所述抗诺如病毒GⅡ基因型VP1蛋白单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列包括SEQ ID NO.9所示的序列；编码所述抗诺如病毒GⅡ基因型VP1蛋白单克隆抗体的轻链可变区的核苷酸序列包括SEQ ID NO.10所示的序列。

SEQ ID NO.9：

ATGGAGACTGGGCTGCGCTGGCTTCTCCTGGTCGCTGTGCTCAAAGGTGTCCAGTGTGAGCAGCTGACCGAGTCCGGGGGAGGCCTGAGCATGCCTCGCCTGTCCCTGAAACTCTCCTGCAAAGCCTCTGGATTCACCCTCAGTGAGTATGGCATGAGCTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGGAAGGGGCTGGAGTGGAATGGAGGTATTAATTGGAATGGTGGTACCACAGGTTATTCAGAGTCTGTGAAGGGCCGATTCACCGTCTCCAGATTCAACATCGAGAGCGGCCCGGATCTGCAAATGAGCAGTCTGACAAAGACGGACACGTCCCTCTATTACGGTGCAAGGTCCCGATATTTTGACTTCAGGGGTTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCA。

SEQ ID NO.10：

ATGGACACGAGGGCCCCCACTCAGCTGCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGCTCCCAGGTGCCACATTTGCCGTGACGACCCATACTCCATCCCCCGTGTCTGCAGCTGTGGGAGACACTGTCACCATCAATTGCAGGACCAGTCAGAGTCTTGGGAGCAACTATTTTGCCTGGTACCAGCAGAATCCAGGGCAGCCTCCCAAGCTCCTGATCTATGAAGCGTCCAGGAGGGCCACTGGGGTGCCTTCGCGATTCCGTGGCAGTGGATCTGGGACACAGTTCACTCTTACCATCAGCGGCATGAAGGCTGAAGATGTTGCCACCTATTACTGTCAGCAGTATTGGCACTCACCTCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAA。

实施例5 构建单克隆抗体表达载体并进行纯化表达

（1）构建单克隆抗体的表达载体

根据兔单抗序列测定结果，设定合适的酶切位点，分别对重链和轻链进行基因合成；将基因合成产物分别连接到pcDNA3.4表达载体。

（2）单克隆抗体的表达与纯化

单克隆抗体的表达：

（a）转染前的准备：细胞计数及传代处理，保证细胞具备转染条件；

（b）细胞转染：摇匀细胞液后，用移液管无菌吸取50 μL细胞悬液，加950 μL培养基稀释20倍，用细胞计数板进行细胞计数，活细胞密度约为（4.5-5.5）×106 cells/mL，细胞活率应为95-99%；

（c）配制转染试剂和质粒混合物，室温孵育20 min；

（d）将转染试剂缓慢加入待转染细胞培养液中，摇瓶置37.0±0.2℃，120 rpm和8%CO2的细胞培养摇床中培养；

（e）转染后的第2天（转染后第18至22小时，第1天），将补料添加到摇瓶中，并在添加过程中轻轻摇动摇瓶。将摇瓶置37.0±0.2℃，120 rpm和8% CO2的细胞培养摇床中培养，继续培养3-5天。

（3）单克隆抗体的纯化

（a）细胞培养液收获：离心收集细胞培养液上清，使用Protein A Beads 进行抗体纯化；

（b）纯化完成后进行抗体浓度测定。

实施例6采用ELISA方法检测单克隆抗体对诺如病毒GⅡ基因型VP1蛋白的亲和活性（效价）

亲和活性检测，亲和活性的检测步骤如下所示：

将诺如病毒GⅡ基因型VP1蛋白用PBS稀释成1 μg/mL，以每孔100 μL加入到96孔酶标板中，4℃包被过夜；弃上清，用0.01 M的PBST洗板3次，用PBST配制含3% BSA的封闭液，每孔加入100 μL，37℃封闭1 h；弃上清，用PBST清洗5次，将纯化浓缩后的抗体进行梯度稀释，浓度从1:1000倍比稀释至1:2560000，加入各孔，每孔加入100 μL，37℃温育1 h；弃抗体稀释液，用PBST清洗6遍，用1:5000封闭液稀释HRP标记的羊抗兔IgG（二抗），每孔加入100 μL二抗，37℃温育1 h；弃二抗稀释液，用PBST清洗6遍，每孔加入100 μL TMB，避光37℃放置15min；每孔加入50 μL 1 M稀硫酸终止反应，在450 nm处测定吸光度。

单克隆抗体的亲和活性的检测结果如表1和图1所示，在OD值保持不变的情况下，单克隆抗体的稀释倍数越大，说明抗原抗体的结合能力越强，筛选的单克隆抗体对诺如病毒GⅡ基因型VP1蛋白具有较强的结合能力，对GXM抗原的效价达到1:1280000（OD值＞0.5）。

表1

抗体浓度（ng/mL） OD值

10000           4.332

1000            4.253

100             3.998

10              2.796

1               1.878

0.1             1.044

0.01            0.278

综上，本发明提供一种了抗诺如病毒GⅡ基因型VP1蛋白单克隆抗体，所述单克隆抗体为兔源单克隆抗体，抗原识别位点多、特异性好、亲和力高，解决了鼠源单克隆抗体在实际应用方面的问题，所述抗诺如病毒GⅡ基因型VP1蛋白单克隆抗体在制备诺如病毒检测的产品中具有重要应用价值。

申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (7)

1.一种抗诺如病毒GⅡ基因型VP1蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述抗诺如病毒GⅡ基因型VP1蛋白单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区；

所述重链可变区包括SEQ ID NO.3所示的重链CDR3；

所述轻链可变区包括SEQ ID NO.6所示的轻链CDR3。

2.根据权利要求1所述的抗诺如病毒GⅡ基因型VP1蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述重链可变区还包括SEQ ID NO.1所示的重链CDR1和SEQ ID NO.2所示的重链CDR2；

优选地，所述轻链可变区还包括SEQ ID NO.4所示的轻链CDR1和SEQ ID NO.5所示的轻链CDR2。

3.根据权利要求1或2所述的抗诺如病毒GⅡ基因型VP1蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述重链可变区的氨基酸序列包括SEQ ID NO.7所示的序列；

优选地，所述轻链可变区的氨基酸序列包括SEQ ID NO.8所示的序列。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的抗诺如病毒GⅡ基因型VP1蛋白单克隆抗体，其特征在于，所述抗诺如病毒GⅡ基因型VP1蛋白单克隆抗体还包括兔源IgG1、IgG2、IgG3或IgG4恒定区中的任意一种或至少两种的组合，优选为兔源IgG1恒定区。

5.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1-4中任一项所述抗诺如病毒GⅡ基因型VP1蛋白单克隆抗体；

优选地，编码所述抗诺如病毒GⅡ基因型VP1蛋白单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列包括SEQ ID NO.9所示的序列；编码所述抗诺如病毒GⅡ基因型VP1蛋白单克隆抗体的轻链可变区的核苷酸序列包括SEQ ID NO.10所示的序列。

6.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包括权利要求5所述的核酸分子。

7.权利要求1-4中任一项所述的抗诺如病毒GⅡ基因型VP1单克隆抗体、权利要求5所述的核酸分子、权利要求6所述的表达载体中任意一种或至少两种的组合在制备诺如病毒感染疾病检测产品中的应用。

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