JPH11506328A - 単離された、プロセシングされていないポリペプチドを使用するプラス鎖ｒｎａウイルスの診断およびプラス鎖ｒｎａウイルスに対するワクチン接種 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 プラス鎖RNAウイルスのゲノムから初期に翻訳されたプロセシングされていないポリタンパク質は、プロセシングされたタンパク質では保持されないエピトープ形状を含む。特に、構造タンパク質領域は、コアタンパク質をコードするゲノム領域と、コアタンパク質に隣接するタンパク質(例えば、HCVにおけるエンベロープタンパク質)をコードするゲノム領域との間の切断部位でのプロセシングに際し、エピトープ形状を失う。サンプル中の、プラス鎖RNAウイルスの存在の診断および検出に関係する組成物、方法およびアッセイ、またはプラス鎖RNAウイルスに対する抗体が記載される。動物における免疫応答の誘導、およびワクチン接種のための組成物および方法が記載される。プロセシングされていないコア領域と、非構造タンパク質(例えば、HCVCのNS5またはプロセシングされていないNS3-NS4融合物)との組み合わせが記載される。

Description

【発明の詳細な説明】 単離された、プロセシングされていないポリペプチドを使用する プラス鎖RNAウイルスの診断およびプラス鎖RNAウイルスに対するワクチン接種技術分野 本発明は、一般に、プラス鎖RNAウイルスの、高度に特異的な高感度診断のた めの方法および組成物に関する。この方法および組成物はまた、プラス鎖RNAウ イルスに対する、動物における免疫応答の誘発および動物のワクチン接種に適切 である。発明の背景 後天性免疫不全症候群(AIDS)は、HIVとして知られる一群のレトロウイルスに より引き起こされる(Barre-Sinoussiら、Science 220:868-871、1983；Galloら 、Science 224:500-503、1984；Coffinら、Science 232:697、1986)。この群の 最初のメンバーは、HIV-1と称されており、世界中のAIDSの大部分の症例の原因 である。それは、WAfから発見された単離株HIV-2から区別されている(Clavelら 、Science 233:343-346、1986)。HIV-2は、HIV-1のように、ヒトにおいて免疫不 全の症状を生じるが、それはまたHIVとは遺伝的に別物である(Guyaderら、Natur e 326:662-669、1987)。 HIV単離株のゲノムは、他のレトロウイルスのゲノムのように、３つの基礎的 な遺伝子: gag、polおよびenvを含む(Weissら、Cold Spring Harbor Laboratory 、Cold Spring Harbor、NY、1985)。さらに、これらのゲノムは、他のいくつか の遺伝子を含み、これら遺伝子の産物は、ウイルス遺伝子発現の調節において重 要な役割を演じている(Daytonら、Cell 44:941-947、1986；Fisherら、Nature 3 20:367-371、1986；Sodroskiら、Nature 321:412-417、1986)。 HIV-1は、代表的には、性的接触により、血液または特定の血液製品に曝され ることにより、または胎児または子供へ感染した母により伝染する(Piotら、Sci ence 239:573-579、1988)。輸血に関連するHIV-2感染の最初の例が記載されてい る(Courouceら、AIDS 2:261-265、1988)。従って、汚染血液または血液製品にお けるHIVを検出する感受性の高いかつ特異的な方法に対する要求が顕著である。 ウイルス全体またはウイルス溶解液に基づくEIAが、HIVの検出のために開発さ れた。しかし、EIAは、自己免疫疾患、多胎妊娠の経歴、抗HLA．EBV感染または 高ガンマグロブリン血症などの非HIV病状を有する個体からの試料と受容し得な い非特異的反応を有することが見出された。 このような非特異的反応を避けるため、およびサンプル中の抗HIV-1および/ま たは抗HIV-2を検出する試みにおいて、ELISAが開発され、そしてHIV-1コアおよ びHIV-1エンベロープおよびHIV-2エンベロープタンパク質を用いる、HIV感染の 血清学的診断用にAbbott Laboratoriesにより市販されている。しかし、このELI SAは、血液供給の優れた防御のため、または患者におけるHIVの早期診断のため に必要とされる、高度に特異的な、高感度の検出を提供しなかった。 従って、血液供給の優れた防御を提供するために、および患者におけるHIVの 優れた診断を提供するために、HIVを高度に特異的で高感度に検出し得る製品お よび方法に対する要求は満たされていない。HIVに対する免疫応答、特にHIVに対 する免疫防御性免疫応答を誘発し得る製品および方法に対する要求もまた、満た されていない。本発明は、これらのおよび他の関連する利点を提供する。 HIVに関連する課題に加えて、他のプラス鎖RNAウイルスもまた、世界中で顕著 な健康リスクを課している。このようなプラス鎖RNAウイルスの１つの例は、Ｃ 型肝炎ウイルス(HCV)である。HCVは、既知の肝炎ウイルス(例えば、Ａ型肝炎ウ イルス(HAV)およびＢ型肝炎ウイルス(HBV))により引き起こされる、他の形態の ウイルス関連肝臓疾患から区別可能である。HIVのように、HCVは、しばしば、輸 血によって伝染する；輸血後肝炎(PTH)は、輸血患者の約10％で発生し、そしてH CV(すなわち、非Ａ非Ｂ肝炎(NANBH))は、これら症例の90％までを占める。この 疾患から生じる主要な問題は、慢性肝障害にしばしば進行することである(25〜5 5％)。従って、汚染血液または血液製品におけるHCV検出のための高感度で特異 的な方法に対する要求が顕著である。 Ｃ型肝炎ウイルス(HCV)は、最初、Chooらにより、分子クローニングおよびそ のRNAゲノムの特徴付けにより同定された(Science 244:359-362、1989)。次いで 、 酵母における組換えDNA法を用いて、C100-3と呼ばれるHCV抗原を用いる特異的ア ッセイが作成された。このアッセイはHCVに対する抗体を検出する(Science 244: 362-364)。HCVゲノムの詳細な開示、および特定のcDNA配列およびそれに由来す るポリペプチド、ならびにこのような主題に関係する方法は、Chiron Corporati onのEP 0 318 216 A1に提供される。特に、この開示は、HCV抗体の１つの型を検 出するために用いられ得る、ウイルスにコードされる363アミノ酸を含む、合成 ポリペプチドC100-3を提供する。現在では、C100-3抗原を基礎とする、HCV抗体 を検出するためのキットが、Abbott Laboratoriesにより市販されている。 EP 0 318 216 A1で示唆されるように、HCVは、フラビウイルスまたはフラビ様 ウイルスであり得る。一般的形態に関して、フラビウイルスは、脂質二重層に取 り囲まれた中心ヌクレオキャプシドを含む。Ｃ型肝炎ウイルスタンパク質は、ヌ クレオキャプシド(コア)タンパク質(Ｃ)、２つのグリコシル化エンベロープタン パク質(E1、E2)を含む構造タンパク質およびいくつかの非構造タンパク質(NS １ 〜５)から構成されると考えられている。Chooらにより開示されたC100-3は、HCV ゲノムの非構造的領域３〜４の一部によりコードされるタンパク質であることが 確認されている。抗C100-3抗体は、すべての輸血後NANBH症例で検出されるわけ ではないことが見出された。抗C100-3抗体を検出できないことは、おそらく、C1 00-3領域におけるヌクレオチド配列の高変異に起因する。 非構造的C100-3抗原を用いる研究に加えて、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA )が、HCVコアタンパク質(p22)を用いるＣ型肝炎ウイルス(HCV)感染の血清学的診 断のために開発された。このコアタンパク質は、Chibaらに報告されているよう に、組換えバキュロウイルスにより合成された(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88:464 1〜4645、1991)。従って、Chibaらのアッセイは、HCV感染を診断するための、抗 体を基礎とした特異的で高感度の方法を確立するための努力において、非グリコ シル化22-kDaヌクレオキャプシド(コア)タンパク質を用いた。しかし、このコア タンパク質を基礎としたアッセイは、比較的大きなサンプル容量が入手可能であ ったときでさえ、顕著な数のHCV感染症例を検出できなかった。 従って、他のプラス鎖RNAウイルスと同様に、高度に特異的で高感度のHCV検出 を行い得る製品および方法に対する必要性が満たされていない。また、他のプラ ス鎖RNAウイルスと同様に、HCVに対する免疫応答、特にHCVに対する免疫防御性 免疫応答を誘発し得る製品および方法に対する必要性が満たされないままである 。本発明は、これらのおよび他の関連する利点を提供する。発明の要旨 本発明は、プラス鎖((＋)鎖)RNAウイルスの構造領域中のプロセシングされて いない全体ポリペプチド(例えば、ポリタンパク質)またはプロセシングされてい ない部分ポリペプチド、および非構造領域由来のタンパク質が優れた抗原性を提 供し得、従って、サンプル中のプラス鎖RNAウイルスの改良された検出および診 断を提供し得るという思想に関する。本発明はまた、動物からの改良された免疫 防御性応答を含む、改良された免疫活性化を提供する。 従って、第１の局面では、本発明は、プラス鎖RNAウイルスからの単離された 、実質的に完全な、プロセシングされていないポリタンパク質を含む、プラス鎖 RNAウイルス由来の組成物を提供する。別の局面では、本発明は、以下を含むプ ラス鎖RNAウイルス由来組成物を提供する：a）プラス鎖RNAウイルスの隣接する 核酸領域のアミノ末端部分に連結されたプラス鎖RNAウイルスコア様抗原タンパ ク質を含む、単離されたポリペプチドであって、この隣接する核酸領域のアミノ 末端部分は、上記ポリペプチドがこのプラス鎖RNAウイルスのプロセシングされ ていないコア様隣接核酸領域に特異的なエピトープ形状を有するようなサイズで ある、ポリペプチド（このポリペプチドは、本明細書では、しばしば、「コア様 抗原−隣接タンパク質」と呼ばれる）；および b）上記プラス鎖RNAウイルスの 単離された非構造タンパク質。以下にさらに論議されるように、コア様抗原−隣 接タンパク質に関係する本出願の全体の開示は、一般に、プラス鎖RNAウイルスe nvタンパク質に等しく適用され、このenvタンパク質は、代表的には、隣接する タンパク質との少なくとも１つのプロセシングされていない連結部を含む。 本発明の各々の局面に関係する好適な実施態様では、プラス鎖RNAウイルスは 、トガウイルス科、コロナウイルス科、レトロウイルス科、ピコルナウイルス科 、カリシウイルス科およびフラビウイルス科からなる群から選択され、さらに好 ましくは、Ｃ型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全症ウイルス(HIV)およびヒトＴ細胞 白 血病ウイルス(HTLV)からなる群から選択される。その他に特に示されていなけれ ば、すべての好ましい実施態様は、本発明の局面の各々に関係する。あるいは、 プラス鎖RNAウイルスは、HCV以外の任意のプラス鎖RNAウイルスである。その他 の好ましい実施態様では、組成物は、適切な原核宿主細胞、代表的には、細菌、 そして好ましくは、E.coli BL21(DE3)により産生される。あるいは、単離された ポリペプチドは、この単離されたポリペプチドをプロセシングし得ない適切な真 核宿主細胞により産生される。 別の局面では、本発明は、プラス鎖RNAウイルスからの単離された、実質的に 完全な、プロセシングされていないポリタンパク質を含む組成物を製造する方法 を提供する。この局面はまた、プラス鎖RNAウイルスから得られる複数のポリペ プチドを製造する方法を提供し、この方法は以下の工程を包含する：a）第１の 適切な宿主細胞に、プラス鎖RNAウイルスの隣接する核酸領域のアミノ末端部分 に連結されたこのプラス鎖RNAウイルスコア様抗原タンパク質を含む単離された ポリペプチドをコードする核酸分子を発現し得る第１の発現ベクターを導入する 工程であって、この隣接する核酸領域のアミノ末端部分は、上記ポリペプチドが 上記プラス鎖RNAウイルスのプロセシングされていないコア様隣接核酸領域に特 異的なエピトープ形状を有するようなサイズである、工程、b）上記発現ベクタ ーが上記ポリペプチドを産生するに適切な条件下で、上記第１の宿主細胞をイン キュベートする工程、c）上記ポリペプチドを精製して、精製されたポリペプチ ドを提供する工程、およびd）第２の適切な宿主細胞に、上記プラス鎖RNAウイル スの単離された非構造タンパク質をコードする核酸分子を発現し得る第２の発現 ベクターを導入する工程、e）上記核酸分子が上記非構造タンパク質を産生する に適切な条件下で、上記第２の宿主細胞をインキュベートする工程、f）上記非 構造タンパク質を精製して、精製された非構造タンパク質を提供する工程、次い で、g）上記精製されたポリペプチドおよび上記精製された非構造タンパク質を 組成物中に組み合わせる工程。 好ましい実施態様では、本発明の方法は、a）適切な宿主細胞に、プラス鎖RNA ウイルスの隣接する核酸領域のアミノ末端部分に連結されたこのプラス鎖RNAウ イルスコア様抗原タンパク質を含む単離されたポリペプチドをコードする第１の 核酸分子を発現し得る発現ベクターを導入する工程であって、この隣接する核酸 領域のアミノ末端部分は、上記ポリペプチドが上記プラス鎖RNAウイルスのプロ セシングされていないコア様隣接核酸領域に特異的なエピトープ形状を有するよ うなサイズである、工程、b）上記発現ベクターが上記ポリペプチドおよび上記 非構造タンパク質を産生するに適切な条件下で、上記宿主細胞をインキュベート する工程、およびc）上記ポリペプチドおよび上記非構造タンパク質を精製して 、精製されたポリペプチドおよび精製された非構造タンパク質を提供する工程を さらに包含する。別の好ましい実施態様では、本発明の方法は、本発明のポリペ プチドを固体基体に結合させる工程をさらに包含する。 さらなる局面では、本発明は、プラス鎖RNAウイルスからの単離された、実質 的に完全な、プロセシングされていないポリタンパク質を含む組成物であって、 このポリタンパク質が固体基体に結合している、組成物を提供する。あるいは、 この組成物は、固体基体に結合したコア様抗原−隣接タンパク質を含み、好まし くは、この固体基体に結合したプラス鎖RNAウイルスの非構造タンパク質をさら に含む。 別の好ましい実施態様では、本発明は、サンプル中のプラス鎖RNAウイルスを 検出するためのアッセイを提供し、このアッセイは、a）プラス鎖RNAウイルスコ ア様抗原−隣接タンパク質を含む、単離されたポリペプチドを提供する工程、b) この単離されたポリペプチドを、上記サンプルと、上記ポリペプチドが、サンプ ル中に存在するプラス鎖RNAウイルスに特異的な１またはそれ以上の抗体に結合 するに適切な条件下および十分な時間で接触させ、抗体結合ポリペプチドを提供 する工程、およびc）この抗体結合ポリペプチドを検出し、そしてそのことから サンプルがプラス鎖RNAウイルスを含むことを決定する工程を包含する。別の実 施態様では、本発明の方法は、a）プラス鎖RNAウイルスからの単離された、実質 的に完全な、プロセシングされていないポリタンパク質を含む、単離されたポリ ペプチドを提供する工程、b）この単離されたポリペプチドを、上記サンプルと 、このポリペプチドが、サンプル中に存在するプラス鎖RNAウイルスに特異的な １またはそれ以上の抗体に結合するに適切な条件下および十分な時間で接触させ 、抗体結合ポリペプチドを提供する工程、および c）この抗体結合ポリペプチド を 検出し、そしてそのことからサンプルがプラス鎖RNAウイルスを含むことを決定 する工程を包含する。 好ましい実施態様では、本発明の方法は、a）上記工程 a)において、上記固体 基体に結合した上記プラス鎖RNAウイルスの非構造タンパク質を提供すること、b ）上記工程 b)において、上記非構造タンパク質を、上記サンプルと、この非構 造タンパク質が、サンプル中に存在する上記プラス鎖RNAウイルスに特異的な１ またはそれ以上の抗体に結合するに適切な条件下および十分な時間で接触させ、 抗体結合プラス鎖RNAウイルス非構造タンパク質を提供すること、および c）上 記工程 c)において、上記抗体結合ポリペプチドまたは上記抗体結合非構造タン パク質の１つまたは両方を検出し、そしてそのことからサンプルがプラス鎖RNA ウイルスを含むことを決定することをさらに包含する。 別の好ましい実施態様では、本発明のアッセイは、上記単離されたポリペプチ ド、上記非構造タンパク質、または上記ポリタンパク質を固体基体に結合させる 工程をさらに包含する。別の好ましい実施態様では、上記サンプルは、代表的に は、動物からの、そして好ましくはヒトからの、精製されていないサンプルであ る。なお別の好ましい実施態様では、本発明のアッセイは、交叉免疫電気泳動(C IEP)アッセイ、ラジオイムノアッセイ、放射免疫沈降法、酵素結合免疫吸着アッ セイ(ELISA)、ドットブロットアッセイ、阻害または競合アッセイ、サンドイッ チアッセイ、イムノスティック(ディップスティック)アッセイ、同時アッセイ、 免疫クロマトグラフィーアッセイ、免疫濾過アッセイ、ラテックスビーズ凝集ア ッセイ、免疫蛍光アッセイ、バイオセンサーアッセイ、および低光検出アッセイ からなる群から選択される。なおさらに、このアッセイは、好ましくは、ウエス タンブロットアッセイではない。 なおさらなる局面では、本発明は、抗体を作製する方法を提供し、この方法は 、a）動物に、プラス鎖RNAウイルスの隣接する核酸領域のアミノ末端部分に連結 されたこのプラス鎖RNAウイルスコア様抗原タンパク質を含む、単離されたポリ ペプチドを投与する工程であって、この隣接する核酸領域のアミノ末端部分は、 このポリペプチドがプラス鎖RNAウイルスのプロセシングされていないコア様隣 接核酸領域に特異的なエピトープ形状を有するようなサイズである、工程、およ び b）このポリペプチドに対する抗体を単離する工程を包含する。あるいは、本発 明は、抗体を作製する方法を提供し、この方法は以下の工程を包含する：a）動 物に、プラス鎖RNAウイルスからの単離された、実質的に完全な、プロセシング されていないポリタンパク質を含む、単離されたポリペプチドを投与する工程、 および b）このポリタンパク質に対する抗体を単離する工程。 本発明はまた、上記の方法のいずれかに従って作製された抗体、および本明細 書で開示されたその他のタンパク質（例えば、非構造タンパク質）に対する抗体 を提供する。好ましくは、これらの抗体は、固体基体に結合している。 なお別の局面では、本発明は、サンプル中のプラス鎖RNAウイルスを検出する ためのアッセイを提供し、このアッセイは、a）サンプルを、１つまたはそれ以 上の上記抗体と、この所定の抗体が、その抗原タンパク質に結合するに適切な条 件下および十分な時間で接触させ、結合抗体を提供する工程、および b）この結 合抗体を検出し、そしてそのことからサンプルがプラス鎖RNAウイルスを含むこ とを決定する工程を包含する。 好ましい実施態様では、上記サンプルは、代表的には、動物からの、そして好 ましくはヒトからの、精製されていないサンプルである。なお別の好ましい実施 態様では、本発明のアッセイは、交叉免疫電気泳動(CIEP)アッセイ、ラジオイム ノアッセイ、放射免疫沈降法、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、ドットブロ ットアッセイ、阻害または競合アッセイ、サンドイッチアッセイ、イムノスティ ック(ディップスティック)アッセイ、同時アッセイ、免疫クロマトグラフィーア ッセイ、免疫濾過アッセイ、ラテックスビーズ凝集アッセイ、免疫蛍光アッセイ 、バイオセンサーアッセイ、および低光検出アッセイからなる群から選択される 。なおさらには、このアッセイは、好ましくは、ウエスタンブロットアッセイで はない。 なおさらなる局面では、本発明は、動物において免疫応答を誘発し得る組成物 を提供し、この組成物は、プラス鎖RNAウイルスコア様抗原−隣接タンパク質を 含む単離されたポリペプチドを、薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤と組 み合わせて含む。好ましくは、この組成物は、上記プラス鎖RNAウイルスからの 非構造タンパク質をさらに含む。別の局面では、動物において免疫応答を誘発し 得る組成物は、プラス鎖RNAウイルスからの単離された、実質的に完全な、プロ セシングされていないポリタンパク質を、薬学的に受容可能なキャリアまたは希 釈剤と組み合わせて含む。 好ましくは、本発明の免疫活性局面（およびその他の局面）の各々について、 上記動物はヒトである。 なお別の局面では、本発明は、プラス鎖RNAウイルスに対するワクチンを提供 し、このワクチンは、プラス鎖RNAウイルスコア様抗原−隣接タンパク質を含む 単離されたポリペプチドを、薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤と組み合 わせて含む。好ましくは、この組成物は、上記プラス鎖RNAウイルスからの非構 造タンパク質をさらに含む。別の局面では、プラス鎖RNAウイルスに対するワク チンは、プラス鎖RNAウイルスからの単離された、実質的に完全な、プロセシン グされていないポリタンパク質を、薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤と 組み合わせて含む。 本発明はまた、動物において免疫応答を誘導する方法を提供し、この方法は、 動物に、プラス鎖RNAウイルスコア様抗原−隣接タンパク質を含む、単離された ポリペプチドを、薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤と組み合わせて投与 する工程を包含する。好ましくは、この方法は、上記プラス鎖RNAウイルスから の非構造タンパク質を投与する工程をさらに包含する。別の局面では、動物にお いて免疫応答を誘導する方法は、動物に、プラス鎖RNAウイルスからの単離され た、実質的に完全な、プロセシングされていないポリタンパク質を、薬学的に受 容可能なキャリアまたは希釈剤と組み合わせて投与する工程を包含する。 本発明はさらに、動物にワクチン接種する方法をさらに提供し、この方法は、 動物に、プラス鎖RNAウイルスコア様抗原−隣接タンパク質を含む、単離された ポリペプチドを、薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤と組み合わせて投与 する工程を包含する。好ましくは、この方法は、上記プラス鎖RNAウイルスから の非構造タンパク質を投与する工程をさらに包含する。別の局面では、動物にワ クチン接種する方法は、動物に、プラス鎖RNAウイルスからの単離された、実質 的に完全な、プロセシングされていないポリタンパク質を、薬学的に受容可能な キャリアまたは希釈剤と組み合わせて投与する工程を包含する。 なお別の局面では、本発明は、プラス鎖RNAウイルスを検出するためのキット を提供し、このキットは、a）プラス鎖RNAウイルスの隣接する核酸領域のアミノ 末端部分に連結されたプラス鎖RNAウイルスコア様抗原タンパク質を含む、単離 されたポリペプチドであって、この隣接する核酸領域のアミノ末端部分は、上記 ポリペプチドが、固体基体に結合した、上記プラス鎖RNAウイルスのプロセシン グされていないコア様隣接核酸領域に特異的なエピトープ形状を有するようなサ イズである、ポリペプチド、および b）上記単離されたポリペプチドを検出する ための手段を含む。好ましくは、このキットは、上記プラス鎖RNAウイルスから の非構造タンパク質およびこの非構造タンパク質を検出するための手段を含む。 あるいは、プラス鎖RNAウイルスを検出するためのキットは、a）固体基体に結合 した、プラス鎖RNAウイルスからの単離された、実質的に完全な、プロセシング されていないポリタンパク質、および b）この単離されたポリタンパク質を検出 するための手段を含む。 別の局面では、本発明は、プラス鎖RNAウイルスを検出するためのキットを提 供し、このキットは、a）１またはそれ以上の上記の抗体、および b）この抗体 を検出するための手段を含む。 このキットはまた、a）免疫応答を誘発し得る組成物、またはワクチン、およ び b）この組成物またはワクチンを動物に投与するための手段を含み得る。 本発明の別の局面では、本発明は、プラス鎖RNAウイルス由来の組成物を提供 し、この組成物は、a）プラス鎖RNAウイルスの隣接する核酸領域に連結されたプ ラス鎖RNAウイルスコア様抗原タンパク質を含む、単離されたポリペプチドであ って、この隣接する核酸領域は、上記ポリペプチドが上記プラス鎖RNAウイルス のプロセシングされていないコア様隣接核酸領域に特異的なエピトープ形状を有 するようなサイズである、ポリペプチド；および b）上記プラス鎖RNAウイルス の上記隣接する核酸領域に連結された上記プラス鎖RNAウイルスコア様抗原タン パク質と協同的に相互作用し、上記プラス鎖RNAウイルスの上記隣接する核酸領 域に連結された上記プラス鎖RNAウイルスコア様抗原タンパク質の抗原性を増大 させ得る第２のタンパク質を含む。本発明はまた、複数のポリペプチド(上記の ポリペプチドの１つまたは両方を含む)を含むこのような組成物を製造する方法 を提供する；これらタンパク質は、同一のまたは異なるプラス鎖RNAウイルスに 由来し得る。 本発明はまた、プラス鎖RNAウイルスからの第１の単離されたタンパク質、お よびプラス鎖RNAウイルスから(好ましくは、同一のプラス鎖RNAウイルスから)の 第２の単離されたタンパク質を含む組成物を提供し、ここで、この第１および第 ２のタンパク質は、本願発明の他の実施態様について以下に示される方法に従っ て、この第１および第２のタンパク質が、プラス鎖RNAウイルスの検出および/ま たはプラス鎖RNAウイルスに対する動物の免疫増強に相乗効果を提供するように 選択される。 本発明はまた、プラス鎖RNAウイルスの隣接する核酸領域に連結されたプラス 鎖RNAウイルスコア様抗原タンパク質を含む単離されたポリペプチドであって、 この隣接する核酸領域は、上記ポリペプチドが、固体基体に結合した、上記プラ ス鎖RNAウイルスのプロセシングされていないコア様隣接核酸領域に特異的なエ ピトープ形状を有するようなサイズであるポリペプチドを、単独または、上記プ ラス鎖RNAウイルスの隣接核酸領域に連結された上記プラス鎖RNAウイルスコア様 抗原タンパク質と協同的に相互作用し、上記固体基体に結合した上記プラス鎖RN Aウイルスの隣接核酸領域に連結されたプラス鎖RNAウイルスコア様抗原タンパク 質の抗原性を増大させ得る第２のタンパク質と組み合わせて提供する。 なお別の局面では、本発明は、サンプル中のプラス鎖RNAウイルスを検出する ためのアッセイを提供し、このアッセイは、a）プラス鎖RNAウイルスの隣接する 核酸領域に連結されたプラス鎖RNAウイルスコア様抗原タンパク質を含む単離さ れたポリペプチドを提供する工程であって、この隣接する核酸領域は、上記ポリ ペプチドが上記プラス鎖RNAウイルスのプロセシングされていないコア様隣接核 酸領域に特異的なエピトープ形状を有するようなサイズである、工程、b）上記 単離されたポリペプチドを、上記サンプルと、上記ポリペプチドが、上記サンプ ル中に存在する上記プラス鎖RNAウイルスに特異的な１またはそれ以上の抗体に 結合するに適切な条件下および十分な時間で接触させ、抗体結合ポリペプチドを 提供する工程、および c）この抗体結合ポリペプチドを検出し、そしてそのこと から上記サンプルがプラス鎖RNAウイルスを含むことを決定する工程を包含する 。 このアッセイはまた、a）上記工程 a)において、上記プラス鎖RNAウイルスの上 記隣接する核酸領域に連結された上記プラス鎖RNAウイルスコア様抗原タンパク 質と協同的に相互作用し、上記固体基体に結合した、上記プラス鎖RNAウイルス の上記隣接する核酸領域に連結された上記プラス鎖RNAウイルスコア様抗原タン パク質の抗原性を増大させ得る第２のタンパク質を提供すること、b）上記工程 b)において、この第２のタンパク質を、上記サンプルと、この第２のタンパク質 が、上記プラス鎖RNAウイルスの上記隣接する核酸領域に連結された上記プラス 鎖RNAウイルスコア様抗原タンパク質と協同的に相互作用するに適切な条件下お よび十分な時間で接触させること、および c）上記工程 c)において、結合抗体 を検出し、そしてそのことから上記サンプルがプラス鎖RNAウイルスを含むこと を決定することをさらに包含し得る。 好ましい実施態様では、このアッセイは、上記単離されたポリペプチドをまた は上記第２のタンパク質を固体基体に結合させる工程をさらに包含する。さらに 好ましくは、このアッセイは、交叉免疫電気泳動(CIEP)アッセイ、ラジオイムノ アッセイ、放射免疫沈降法、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、ドットブロッ トアッセイ、阻害または競合アッセイ、サンドイッチアッセイ、イムノスティッ ク(ディップスティック)アッセイ、同時アッセイ、免疫クロマトグラフィーアッ セイ、免疫濾過アッセイ、ラテックスビーズ凝集アッセイ、免疫蛍光アッセイ、 バイオセンサーアッセイ、および低光検出アッセイからなる群から選択されるが 、ウエスタンブロットアッセイではない。 本発明はまた、抗体を作製する方法を提供し、この方法は、a）動物に、プラ ス鎖RNAウイルスの隣接する核酸領域に連結されたプラス鎖RNAウイルスコア様抗 原タンパク質を含む単離されたポリペプチドを投与する工程であって、この隣接 する核酸領域は、上記ポリペプチドが上記プラス鎖RNAウイルスのプロセシング されていないコア様隣接核酸領域に特異的なエピトープ形状を有するようなサイ ズである、工程、および b）このポリペプチドに対する抗体を単離する工程を包 含する。この方法は、動物に、上記プラス鎖RNAウイルスの上記隣接する核酸領 域に連結された上記プラス鎖RNAウイルスコア様抗原タンパク質と協同的に相互 作用し、上記プラス鎖RNAウイルスの上記隣接する核酸領域に連結された上記プ ラス鎖RNAウイルスコア様抗原タンパク質の抗原性を増大させ得る第２のタンパ ク質を投与する工程をさらに包含し得る。本発明は、上記のように作製された抗 体を特徴とし、この抗体は、固体基体に結合され得る。この抗体はまた、これも また上記されるようなアッセイで用いられ得る。 なお別の局面では、本発明は、動物において免疫応答を誘発し得る組成物を提 供し、この組成物は、プラス鎖RNAウイルスの隣接する核酸領域に連結されたプ ラス鎖RNAウイルスコア様抗原タンパク質を含む、単離されたポリペプチドを、 薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤と組み合わせて含み、ここで上記隣接 する核酸領域は、上記ポリペプチドが上記プラス鎖RNAウイルスのプロセシング されていないコア様隣接核酸領域に特異的なエピトープ形状を有するようなサイ ズである。この組成物は、上記プラス鎖RNAウイルスの上記隣接する核酸領域に 連結された上記プラス鎖RNAウイルスコア様抗原タンパク質と協同的に相互作用 し、上記プラス鎖RNAウイルスの上記隣接する核酸領域に連結された上記プラス 鎖RNAウイルスコア様抗原タンパク質の抗原性を増大させ得る第２のタンパク質 をさらに含み得る。好ましくは、この組成物はワクチンである。 本発明はまた、動物において免疫応答を誘導する方法を提供し、この方法は、 動物に、プラス鎖RNAウイルスの隣接する核酸領域に連結されたプラス鎖RNAウイ ルスコア様抗原タンパク質を含む、単離されたポリペプチドを、薬学的に受容可 能なキャリアまたは希釈剤と組み合わせて投与する工程を包含し、ここで上記隣 接する核酸領域は、上記ポリペプチドが上記プラス鎖RNAウイルスのプロセシン グされていないコア様隣接核酸領域に特異的なエピトープ形状を有するようなサ イズである。好ましくは、この方法は、上記プラス鎖RNAウイルスの上記隣接す る核酸領域に連結された上記プラス鎖RNAウイルスコア様抗原タンパク質と協同 的に相互作用し、上記プラス鎖RNAウイルスの上記隣接する核酸領域に連結され た上記プラス鎖RNAウイルスコア様抗原タンパク質の抗原性を増大させ得る第２ のタンパク質を投与する工程をさらに包含し得る。さらに好ましくは、この方法 はワクチン接種を包含し得る。 別の局面では、本発明は、プラス鎖RNAウイルスを検出するためのキットを提 供し、このキットは：a）プラス鎖RNAウイルスの隣接する核酸領域に連結された プラス鎖RNAウイルスコア様抗原タンパク質を含む、単離されたポリペプチドで あって、この隣接する核酸領域は、上記ポリペプチドが、固体基体に結合した、 上記プラス鎖RNAウイルスのプロセシングされていないコア様隣接核酸領域に特 異的なエピトープ形状を有するようなサイズである、ポリペプチド、および b） この単離されたポリペプチドを検出するため手段を含む。好ましくは、このキッ トは、上記プラス鎖RNAウイルスの上記隣接する核酸領域に連結された上記プラ ス鎖RNAウイルスコア様抗原タンパク質と協同的に相互作用し、上記プラス鎖RNA ウイルスの上記隣接する核酸領域に連結された上記プラス鎖RNAウイルスコア様 抗原タンパク質の抗原性を増大させ得る第２のタンパク質、およびこの第２のタ ンパク質を検出するため手段をさらに含む。 あるいは、プラス鎖RNAウイルスを検出するためのキットは：a）上記のように 作製された抗体、および b）この抗体を検出するための手段を含み得る。 本発明のこれらおよび他の局面は、以下の詳細な説明および添付の図面を参照 すれば明らかになる。さらに、上記のように、本明細書を通じて、特定の手順ま たは組成物(例えば、プラスミドなど)をより詳細に記載する種々の参考文献が示 されている；このような参考文献は、それらの全体が参考として援用される。図面の簡単な説明 図1Aは、HCVエンベロープ領域のアミノ末端部分に連結されたHCVコア抗原タン パク質を含むポリペプチドをコードする核酸分子のヌクレオチド配列を示す。 図1Bは、図1Aに示されるヌクレオチド配列によりコードされるアミノ酸配列を 示す。 図２は、発現ベクターpEN-2の構造を示す。このベクターは、HCVエンベロープ 領域のアミノ末端部分に連結されたHCVコア抗原タンパク質をコードするcDNAを プラスミド中に挿入することにより構築された。この図はまた、ベクターpEN-2 の特定の顕著な特徴を示す制限地図を示す。 図3Aは、NS5非構造領域を含むポリペプチドをコードする核酸分子のヌクレオ チド配列を示す。 図3Bは、図3Aに示されるヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列 を示す。 図４は、発現ベクターpEN-1の構造を示す。このベクターは、NS5非構造領域を コードするcDNAをプラスミド中に挿入することにより構築された。この図はまた 、ベクターpEN-1の特定の顕著な特徴を示す制限地図を示す。発明の詳細な説明 本発明は、プラス鎖RNAウイルスのゲノムから初期に翻訳される、プロセシン グされていないポリタンパク質は、エピトープ形状を含むという発見に基づく。 このエピトープ形状は、プロセシングされたタンパク質には保持されていない。 詳細には、コアタンパク質領域(または、「コア」タンパク質として同等の目的に 使える、ウイルスゲノムによってコードされる他のタンパク質)は、コアタンパ ク質をコードするゲノム領域(例えば、遺伝子)とコアタンパク質のアミノ末端に 隣接するタンパク質(例えば、HCVエンベロープタンパク質)をコードするゲノム 領域との間の切断部位でのプロセシングの際にエピトープ形状を失う。下記の本 開示の実施例の部分で示すように、コア領域のプロセシングされていないエピト ープ形状は、サンプル中のプラス鎖RNAウイルスまたはプラス鎖RNAウイルスに対 する抗体の存在を検出する、驚くほど改良された能力を提供する。サンプルは、 精製されていないサンプルまたは非常に少量のサンプル(テスト用に利用可能な 血液(または他の適切な材料)がきわめて小量である幼児または他のヒト由来のサ ンプルをテストする場合に特に役立ち得る)を包含する。 さらに驚くべきことに、プロセシングされていないコア領域と非構造タンパク 質(例えば、HCV由来のNS5タンパク質またはプロセシングされていないNS3-NS4融 合タンパク質)とを組み合わせると、プロセシングされていないコア領域によっ て提供される既に改良された感受性および特異性を顕著に増強する、相乗効果が もたらされる。 抗原性およびエピトープ形状におけるこれらの重要な利点はまた、動物におけ る免疫応答の誘導のための、驚くほど増強された組成物および方法、ならびにそ のような動物のワクチン接種の増強を提供する。 従って、本発明は、プラス鎖RNAウイルス由来の、単離された、実質的に完全 な、プロセシングされていないポリタンパク質を利用する組成物および方法を特 徴とする。 本発明はまた、プラス鎖RNAウイルスの隣接したタンパク質のアミノ末端部分 に連結されたプラス鎖RNAウイルスコア抗原タンパク質を含む、単離されたポリ ペプチドを利用する組成物および方法を特徴とする。ここで、プラス鎖RNAウイ ルスエンベロープ領域のアミノ末端部分は、このポリペプチドが、プラス鎖RNA ウイルスのプロセシングされていないコア−隣接タンパク質領域に特異的なエピ トープ形状を有するようなサイズである。本発明はさらに、組成物または方法に おけるそのようなプロセシングされていないコア−隣接タンパク質領域と非構造 タンパク質との組み合わせを特徴とし、それによって所定のプラス鎖RNAウイル スとの驚くほどの感度および特異的な相互作用を提供する。 本発明は、完全なポリペプチドが独特な形状を有し、そしてそのような形状が 抗原的に重要な差異をもたらすという第１の発見を提供する。本発明はまた、消 失したエピトープ形状が、コアタンパク質−隣接タンパク質領域に生じるという 第１の発見を提供する。 プラス鎖RNAからの「単離された、実質的に完全なプロセシングされていないポ リタンパク質」は、プラス鎖RNAウイルスのゲノムから初期に翻訳されるポリタン パク質である。このようなポリタンパク質は、プロセシングには供されておらず 、それゆえ、ポリタンパク質のタンパク質間のプロセシング部位は、切断されて いない。ポリタンパク質はまた単離され、このことは、ポリタンパク質がそのコ ードゲノムから分離されることを意味する。ポリタンパク質が、本発明の免疫的 に活性な特徴を提供するに必要なすべての機能的エレメント(特に、このポリタ ンパク質にのみ存在し、このポリタンパク質から得られるプロセシングされたタ ンパク質にもサブユニット中にも存在しないエピトープ形状)を保持する場合、 そのポリタンパク質は実質的に完全である。しかし、このタンパク質および本発 明の他のタンパク質について、タンパク質のアミノ酸配列を変更し得るが、その タンパク質の機能を顕著には変更しない(すなわち、プロセシングされていない エピトープ形状は保持される)、保存的アミノ酸置換または重要ではないアミノ 酸の付加、改変、または欠失を行うことは、当該分野の技術範囲内である。しか し、 このような改変は、所望する場合、タンパク質のプロセシングシグナルおよび/ または部位を欠失し得る。これらの改変については、以下にさらに記載する。ポ リタンパク質の完全性は、例えば、SDS-PAGE、続くアミノ酸配列決定によって決 定され得る。完全性はまた、問題のポリタンパク質を下記の１つ以上のアッセイ において利用し、そしてプロセシングされていない状態に特異的なエピトープ形 状の効果を検出することによって、決定され得る。 「コア様」タンパク質は、HCVのコアタンパク質と同じタイプの機能を提供する 構造タンパク質である。他のウイルス由来の「コア様」タンパク質の例としては、 日本脳炎ウイルスコアタンパク質およびHIV gagタンパク質が挙げられる。「コア 様抗原タンパク質」は、コア様タンパク質の抗原性を提示するコア様タンパク質 の一部分を含む、構造「コア様」タンパク質である。プロセシングの際のエピトー プ形状の変更は、当該分野において公知ではなかったが、コア様タンパク質は一 般的に(そして抗原性に重要であり得るコア様タンパク質の領域は)、当該分野に おいて周知である(例えば、Okamotoら、J．Virol．188:331，1992; Wang、米国 特許第5,106,726号を参照)。コア様抗原タンパク質は、所望のプラス鎖RNAウイ ルスに関して、例えば、ELISAまたはウエスタンブロッティング、あるいはその 両方によって、当該分野において周知のように、従来のコアタイプ抗原反応性に ついて決定され得る。コア様抗原タンパク質はまた、SDS-PAGE、続くアミノ酸配 列決定によって決定され得る。 代表的に、コア様抗原タンパク質は、プラス鎖RNAウイルスの隣接タンパク質 またはペプチド領域のアミノ末端部分に結合され、本発明のプロセシングされて いない「コア様抗原−隣接タンパク質」を提供する。しかし、いくつかの実施態様 (特に、コア様タンパク質が、ポリタンパク質の第１のタンパク質領域でない場 合)において、コア様タンパク質は、プロセシングされていない形態でプラス鎖R NAウイルスの隣接タンパク質のカルボキシル末端部分に結合され、本発明の発明 的なプロセシングされていないコア様抗原−隣接タンパク質を提供する。プロセ シングされていない形態とは、コア様領域および隣接領域が、代表的にそして好 ましくは、それらが天然のプラス鎖RNAウイルスにおいて結合している(すなわち 、コードされている)ように、正確に維持されていることを意味する。本明細書 に 記載のポリタンパク質および他のタンパク質と同様に、コア様抗原タンパク質は 、コア様抗原タンパク質の本発明の機能性を変更することなく無意味に改変され 得る。 コア様抗原タンパクに隣接する「隣接タンパク質」の部分は、融合タンパク質が 、プラス鎖RNAウイルスのプロセシングされていないコア様−隣接タンパク質に 特異的なエピトープ形状を有するようなサイズである。従って、代表的に、隣接 タンパク質領域のアミノ末端部分は、融合タンパク質が、プロセシングされてい ないコア様領域に特異的な一時的なエピトープ形状を提示することを可能にする に十分な長さでなければならない。 従来のコア様タンパク質に加えて、プラス鎖RNAウイルスのenvタンパク質もま た、本明細書に記載のコア様抗原−隣接タンパク質によって示される、驚くほど 増強された抗原形状および相互作用を提供し得る。このことは、envタンパク質 が、第２のタンパク質(これもまた本明細書に記載される)と組み合わせて使用さ れる場合、特に正しい。好ましくは、envタンパク質は、本明細書に開示のコア 様抗原−隣接タンパク質で見出されるものと同様に、隣接タンパク質(それ自体 が隣接envタンパク質(例えば、HIVのgp120およびgp41)であり得る)とのプロセシ ングされていない連結部分を含む。さらに、第２のタンパク質は、HIVのgagタン パク質のようなコア様タンパク質であり得る。env領域は、本発明のコア様抗原 −隣接タンパク質によって示される、同様な増強された検出および免疫誘導を提 供するので、他に断らない限りまたは文脈から明らかでない限り、本明細書中の コア様抗原−隣接タンパク質に対する言及は、envおよび/またはenv−隣接タン パク質に同等に適用され得る。所定のenvまたはenv−隣接タンパク質がそのよう な増強された検出および免疫誘導を提示するかどうかの決定は、以下に記載する ように、コア様抗原−隣接タンパク質と同様にアッセイすることによって達成さ れ得る。 所定のポリペプチドが、本発明のコア様抗原−隣接タンパク質のエピトープ形 状を提示するかどうかの決定は、以下のように実施され得る。問題のコア様抗原 −隣接タンパク質は、EN-80-2のような確立されたコア様抗原−隣接タンパク質 を含むコア様抗原−隣接タンパク質のパネル中に含まれ得る。パネルは、マイク ロタイタープレートの一連のウェル中に置かれる。パネルはまた、異なる長さの 隣接タンパク質を有する他のコア様抗原−隣接タンパク質を含み得る。別のウエ ル中に、コア様抗原−隣接タンパク質と相乗的に協同作用し得る確立された非構 造または他のタンパク質(例えば、EN-80-1)を置く。確立されたコア様抗原−隣 接タンパク質と弱く反応し、そしてまた確立された非構造タンパク質と非反応性 である抗血清が、確立されたコア様抗原−隣接タンパク質について選択される。 選択の根拠は、抗血清が、別々のタンパク質とは予想通りに反応するが、適切な コア様抗原−隣接タンパク質と確立された非構造タンパク質の両方がサンプル中 に存在する場合、抗血清はよりずっと強力に反応することである。そのような抗 血清の多くの例(例えば、G614(８倍希釈)、G614(16倍希釈)、G615(８倍希釈)、G 615(16倍希釈)、および8-5)が、以下の実施例に記載されている。抗血清は、こ の抗血清と所定のタンパク質との間の反応の誘発および検出に適切な条件下で、 サンプルタンパク質に導入され、そしてそのような応答が検出され、そして測定 される。次いで、確立された非構造タンパク質は、コア様抗原−隣接タンパク質 パネルの各メンバーのさらなるサンプルと組み合わせられる。次に、抗血清は、 組み合わせられたタンパク質に、抗血清とタンパク質との間の反応の誘発および 検出に適切な条件下で導入され、そしてそのような応答が検出され、そして測定 される。協同的効果を提供するコア様抗原−隣接タンパク質は、本発明における 使用に適切である。好ましくは、抗血清は、抗血清と各タンパク質単独との加算 的反応と比較した場合、組み合わせられたタンパク質とは少なくとも約1.25倍ま たは1.5倍強く反応する。さらに好ましくは、抗血清は、少なくとも約２倍強く 反応する。上記の各工程は、本明細書を考慮すると、当該分野において定型的な 工程である。 コア様抗原−隣接タンパク質は、好ましく単離され、このことは、コア様抗原 −隣接タンパク質が、プラス鎖RNAウイルスのゲノムから元来翻訳されたポリタ ンパク質の残りのものから分離されることを意味する。コア様抗原−隣接タンパ ク質はまた、好ましくは、そのコード核酸分子から分離される。 好ましい実施態様において、本発明のコア様抗原−隣接タンパク質は、第２の タンパク質と組み合わせて用いられる。第２のタンパク質は、好ましくは、プラ ス鎖RNAウイルス由来であり、さらに好ましくは、コア様抗原−隣接タンパク質 と同一のプラス鎖RNAウイルス由来であり、そして最も好ましくは、プラス鎖RNA ウイルス由来の非構造タンパク質由来(好ましくは、コア様抗原−隣接タンパク 質と同一のプラス鎖RNAウイルス由来)である。 １つの好ましい実施態様において、第２のタンパク質は非構造タンパク質であ る。HCV以外のプラス鎖RNAウイルスにおいて、非構造タンパク質は、当該分野に おいて周知のように、他の名称で呼ばれ得る。本明細書のために、すべてのその ような非構造様タンパク質は、本明細書において「非構造タンパク質」と呼ばれる 。上記のように、プラス鎖RNAウイルスの非構造コード領域は、当該分野におい て周知である。 コア様抗原−隣接タンパク質とともに用いるに適した、適切な第２のタンパク 質(この第２のタンパク質は、１より多い非構造タンパク質を含む非構造コード 領域の部分(またはある非構造タンパク質のすべてではない)を含み得る)の決定 は、以下のように実施され得る。 問題の第２のタンパク質は、EN-80-2のような確立された第２のタンパク質を 含む第２のタンパク質のパネル中に含まれ得る。パネルは、マイクロタイタープ レートの一連のウェル中に置かれる。パネルはまた、異なる長さの隣接タンパク 質を有する他の第２のタンパク質を含み得る。別のウェル中に、EN-80-1のよう な第２のタンパク質と相乗的に協同作用し得る確立されたコア様抗原−隣接タン パク質が置かれる。確立された第２のタンパク質と弱く反応し、そしてまた確立 されたコア様抗原−隣接タンパク質と非反応性である抗血清が、確立された第２ のタンパク質について選択される。選択の根拠は、抗血清が別々のタンパク質と は予想通りに反応するが、適切な第２のタンパク質と確立されたコア様抗原−隣 接タンパク質の両方がサンプル中に存在する場合、抗血清はよりはるかに強力に 反応することである。そのような抗血清の多くの例は、以下の実施例に記載され ている。抗血清は、抗血清と所定のタンパク質との間の反応の誘発および検出に 適切な条件下で、サンプルタンパク質に導入され、そしてそのような応答が検出 され、そして測定される。確立されたコア様抗原−隣接タンパク質は、第２のタ ンパク質パネルの各メンバーと組み合わせられる。次に、抗血清は、組み合わせ られたタンパク質に、抗血清とタンパク質との間の反応の誘発および検出に適切 な条件下で導入され、そしてそのような応答が検出され、そして測定される。協 同的効果を提供する第２のタンパク質は、本発明における使用に適切である。上 記の各工程は、本明細書を考慮すると、当該分野において定型的な工程である。 本発明はまた、本発明の実質的に完全なポリタンパク質、コア様抗原−隣接タ ンパク質、および/または非構造タンパク質、ならびに本発明の他のタンパク質 に対する、抗体、好ましくは、モノクローナル抗体を提供する。抗体は、好まし くは、サンプル中のプラス鎖RNAウイルスの特に高感度で特異的な検出を提供す るために組み合わせて使用される。 さらに、本発明は、動物における免疫応答(液性、細胞性、または両方のいず れか)の誘発のための組成物および方法を提供する。さらに、組成物および方法 は、プラス鎖RNAウイルスに対して動物にワクチン接種し得る。 好ましくは、本発明の方法および組成物(検出、免疫応答の誘発およびワクチ ン接種のための方法および組成物を含む)は、ヒトに適用される。 本発明の１つの例は、Ｃ型肝炎ウイルス(HCV)である。以下の考察は、概ね、H CVについて、さらにHCVエンベロープ領域のアミノ末端部分に結合されたHCVコア 抗原タンパク質に注目している。本考察はまた、HCV非構造タンパク質(特に、HC VのNS5およびNS3-NS4非構造タンパク質)と組み合わせた、または別のプラス鎖RN Aウイルス由来の第２のタンパク質(特に、HIVエンベロープタンパク質およびHTL V-Iエンベロープタンパク質)と組み合わせたそのようなコア抗原−エンベロープ 領域に注目している。上記のように、本考察は、プラス鎖RNAウイルス一般のコ ア様抗原−隣接タンパク質を用いて得られるべき結果の予測である。本考察はま た、プラス鎖RNAウイルス一般の実質的に完全なポリタンパク質、そして特にHCV の実質的に完全なポリタンパク質を用いて得られるべき結果の予測である。 本発明のプロセシングされていないポリペプチド および他のポリペプチドをコードする核酸分子 上記のように、本発明は、実質的に完全なプラス鎖RNAウイルスポリタンパク 質を含むポリペプチドをコードする核酸分子を包含する。本発明はまた、コア様 抗原−隣接タンパク質(例えば、HCVエンベロープ領域のアミノ末端部分に連結さ れたHCVコア抗原タンパク質)を含むポリペプチドをコードする核酸分子を提供す る。本発明はさらに、そのようなプラス鎖RNAウイルスの非構造タンパク質を含 むポリペプチドをコードする核酸分子を提供する。好ましい実施態様において、 核酸分子はDNAである。 好ましい実施態様において、核酸分子は、HCV感染患者の血漿中に存在する核 酸配列から単離された、プロセシングされていないコア抗原−エンベロープタン パク質をコードするDNA分子である。以下でさらに考察するように、この分子の 単離は、患者の血漿からウイルス粒子を単離する工程、ウイルスの核酸配列を抽 出し精製する工程、および、次いでポリメラーゼ連鎖反応(PCR)技術により所望 のDNA分子をクローニングする工程を包含した。クローニングに用いられたプラ イマーは以下の通りであった： その同一性を確認するために、クローニングされたDNA分子を配列決定した。こ のようにして得られた分子を、EN-80-2と名付けた。分子EN-80-2のDNA配列を図1 A(配列番号７)に示す。これは669bpを有する。分子EN-80-2のアミノ酸配列を図1 B(配列番号８)に示す。これは223残基を有する。分子EN-80-2を、E.coli BL21株 (DE3)中において、アメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)(Rockville Maryland 20852)に1993年７月14日に寄託し、そしてこれにATCC登録番号第55451 号が与えられた。培養物をブダベスト条約の条件で寄託した。 別の好ましい実施態様において、核酸分子は、HCV感染患者の血漿中に存在す る核酸配列から単離された、HCV NS5非構造タンパク質をコードするDNA分子であ る。上記のプロセシングされていないコア抗原−エンベロープタンパク質の単離 と同様に(しかし、患者は異なる)、単離は、患者の血漿からウイルス粒子を単離 する工程、ウイルス核酸配列を抽出し精製する工程、および、次いでポリメラー ゼ連鎖反応(PCR)技術により所望のDNA分子をクローニングする工程を包含した。 PCRに用いられたプライマーは以下の通りであった： 単離されたDNA分子を、その同一性を確認するために配列分析に供した。この ようにして得られた分子を、EN-80-1と名付けた。分子EN-80-1のDNA配列を図3A( 配列番号９)に示す。これは803bpを有する。分子EN-80-1のアミノ酸配列を図3B( 配列番号10)に示す。これは267残基を有する。分子EN-80-1を、E.coli BL21株(D E3)中において、アメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)(Rockville Ma ryland 20852)に1993年７月14日に寄託し、そしてこれにATCC登録番号第55450号 を与えられた。培養物をブダベスト条約の条件で寄託した。 図２は、発現プラスミドpEN-2を示す。このプラスミドは、上記のプライマー( 配列番号１および２)を用いて単離された、プロセシングされていないコア抗原 −エンベロープタンパク質をコードするDNA分子を含む。図４は、発現プラスミ ドpEN-1を示す。このプラスミドは、上記のプライマー(配列番号１および２)を 用いて単離された、NS5非構造タンパク質をコードするDNA分子を含む。 この一般的な手順はまた、HCVのNS3-NS4非構造領域から代表的な核酸分子を単 離するために使用されている。また、Simmonds、Lancet 336: 1469-1472，1990 を参照。クローニングのために用いられたプライマーは、以下の通りであった： このようにして得られた分子を、EN-80-4と名付けた。単離された分子によっ てコードされるポリペプチドは、SDS-PAGEによる電気泳動によって測定されるよ うに、約20,000ダルトンの分子量を有する。 第２のタンパク質として有用なポリペプチドのさらなる例として、HIVエンベ ロープタンパク質(分子量約18,000ダルトン)およびHTLVエンベロープタンパク質 (分子量約18,000ダルトン)が挙げられる。 本発明は、上記の遺伝子を発現し得る構築物を含む宿主細胞を培養することに よって、上記の核酸分子の操作および発現を提供する。 本発明の核酸分子とともに使用するに適切な多くのベクター構築物が、便宜的 に調製され得る。本発明の範囲内で、ベクター構築物は、代表的には、全体とし て天然には他に存在しない様式で組み合わされそして並置された(juxtaposed)DN Aのセグメントを含むように、ヒトの介入によって改変されている、DNA分子また はそのような分子(一本鎖または二本鎖のいずれか)のクローンをいうと理解され る。本発明のベクター構築物は、プラス鎖RNAウイルスの１つ以上の、プロセシ ングされていないコア様抗原−隣接タンパク質および非構造タンパク質をコード する第１のDNAセグメント、ならびにこれと作動可能に連結された、第１のDNAセ グメントの発現に必要なさらなるDNAセグメントを含む。本発明の範囲内におい て、さらなるDNAセグメントは、プロモーターを含み、そして一般的には、転写 ターミネーターを含み、そして、エンハサーおよび他のエレメントをさらに含み 得る。WO 94/25597およびWO/25598を参照。 本発明のタンパク質の発現のために構築されるヌクレオチド配列における変異 は、好ましくは、コード配列のリーディングフレームを保存する。さらに、変異 は、好ましくは、mRNAの翻訳に有害に影響するmRNA二次構造(例えば、ループま たはヘアピン)を生じるようハイブリダイズし得る相補領域を作製しない。変異 部位は予め決定され得るが、変異の性質自体は、予め決定されなくてもよい。例 えば、所定の部位の変異体の最適な特徴について選択するために、ランダム変異 誘発が標的コドンで行われ得、そして発現した変異体が、示される生物学的活性 についてスクリーニングされ得る。 変異は、天然配列のフラグメントへの連結を可能にする制限部位によって隣接 される、変異配列を含むオリゴヌクレオチドを合成することによって、特定の座 位に導入され得る。連結後、得られた再構築された配列は、所望のアミノ酸の挿 入、置換、または欠失を有する誘導体をコードする。 あるいは、オリゴヌクレオチド指向性、部位特異的変異誘発手順が、必要な置 換、欠失、または挿入に従って変更された特定のコドンを有する変更された遺伝 子を提供するために用いられ得る。上記の変更を作製する例示的な方法は、Wald erら(Gene 42:133，1986)；Bauerら(Gene 37:73，1985)；Craik(BioTechniques, January 1985，12-19)；Smithら(Genetic Engineering: Principles and Method s，Plenum Press，1981)；およびSambrookら(前出)によって開示されている。 上記タンパク質のアミノ酸の一次構造もまた、他の化学的部分(グリコシル基 、脂質、リン酸、アセチル基)あるいは他のタンパク質またはポリペプチドと、 共有結合体または凝集結合体を形成することによって改変され得る。ただし、こ のような改変は、そのタンパク質の抗原性を妨害すべきではない。(米国特許第4 ,851,341号を参照；また、Hoppら、Bio/Technology 6:1204，1988を参照)。例え ば、このような改変は、プロセシングされていないコア様抗原−隣接タンパク質 に特異的なエピトープ形状(エピトープへのアクセスおよび他の抗原性に関して 考慮すべきことを包含する)を妨害すべきではない。 ベクター構築物の好ましいタイプは、発現ベクターとして知られている。上記 のように、プラスミドpEN-1およびpEN-2は、このような発現ベクターの例であり 、そしてそれぞれ、HCV NS5非構造領域およびプロセシングされていないHCVコア 抗原−エンベロープタンパク質をコードする核酸分子を含む。 発現のために、上記の核酸分子(代表的には、DNA)は、適切なベクター構築物 に挿入され、これは次いで、適切な発現用宿主細胞を形質転換またはトランスフ ェクトするために用いられる。好ましくは、本発明の遺伝子配列の発現において 使用するための宿主細胞は、原核生物宿主細胞であり、さらに好ましくはE.coli のような細菌である。他の適切な宿主細胞としては、Salmonella、Bacillus、Sh igella，Pseudomonas，Streptomycesおよび当該分野で公知の他の属が挙げられ る。さらに好ましい実施態様において、宿主細胞は、DE3溶原菌またはRNAポリメ ラーゼを含むE.coli(例えば、BL21(DE3)、JM109(DE3)またはBL21(DE3)pLysS)で ある。 クローニングされたDNA配列を細菌宿主において発現させるために用いられる ベクターは、一般に、選択マーカー(例えば、抗生物質耐性のための遺伝子)およ びその宿主細胞において機能するプロモーターを含む。適切なプロモーターとし ては、trp(NicholsおよびYanofsky，Meth．Enzymol．101:155-164，1983)、lac( Casadabanら、J．Bacteriol．143:971-980，1980)およびλファージ(Queen，J.M ol．Appl．Genet．2:1-10，1983)プロモーターシステムが挙げられる。発現ユ ニットはまた、転写ターミネーターを含み得る。細菌を形質転換するに有用なプ ラスミドとしては、pUCプラスミド(Messing，Meth．Enzymol．101:20-78，1983 ；VieiraおよびMessing、Gene 19:259-268，1982)、pBR322(Bolivarら、Gene 2: 95-113，1977)、pCQV2(Queen、同)、およびそれらの誘導体が挙げられる。プラ スミドは、ウイルスエレメントおよび細菌エレメントの両方を含み得る。 別の実施態様において、宿主細胞は真核生物細胞であり得る。ただし、宿主細 胞は、宿主細胞が、例えば、プロセシングされていないコア様抗原−隣接タンパ ク質もプロセシングされていない非構造領域(例えば、NS3-NS4非構造タンパク質 )もプロセシングし得ないように改変されているか、あるいはプロセシングされ ていないポリペプチド中のプロセシングシグナルおよび/またはプロセシング部 位は、タンパク質がもはやプロセシングを受けないように改変されている(その ような改変は、プロセシングされていないタンパク質の抗原性に影響するはずが ない)かのいずれかである。本発明実施においての使用に適切な真核宿主細胞と しては、哺乳動物細胞、トリ細胞、植物細胞、昆虫細胞および菌類細胞が挙げら れる。好ましい真核生物細胞としては、培養された哺乳動物細胞株(例えば、齧 歯類またはヒト細胞株)、昆虫細胞株(例えば、Sf-9)および菌類細胞(酵母(例え ば、Saccharomyces spp.、特にS．cerevisiae、Schizosaccharomyces spp.、ま たはKluyveromyces spp.)あるいは糸状菌(例えば、Aspergillus spp.，Neurospo ra spp.)の種を含む)が挙げられる。 これらの宿主細胞を形質転換するための技術、およびそれらにおいてクローニ ングされた外来性DNA配列を発現させるための方法は、当該分野において周知で ある(例えば、Maniatisら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual，Cold Sp ring Harbor Laboratory，1982；Sambrookら、前出；「Gene Expression Technol ogy」、Methods in Enzymology、185巻、Goeddel(編)、Academic Press，San Die go，Calif.，1990；「Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology」、Metho ds in Enzymology、GuthrieおよびFink(編)、Academic Press，San Diego，Cali f.，1991；Hitzemanら、J．Biol．Chem．255:12073-12080，1980；AlberおよびK awasaki、J．Mol．Appl．Genet．1:419-434，1982；Youngら、Genetic Engineer ing of Microorganisms for Chemicals，Hollaenderら(編)355頁、Plenum，New York，1982；Ammerer，Meth．Enzymol．101:192-201，1983；McKnightら、米国 特許第4,935,349号を参照)。 一般に、宿主細胞は、目的のタンパク質を高レベルで産生するその能力に基づ いて選択される。この方法において、宿主細胞に導入されるべきクローニングさ れたDNA配列の数は、最小化され得、そして生物学的に活性なタンパク質の全収 量は、最大化され得る。本明細書において提供される教示内容を考えれば、プロ モーター、ターミネーター、および本発明のタンパク質をコードするそのような 発現ベクターを所望の宿主細胞に導入する方法は、当業者に明らかである。 次いで、本発明のベクター構築物を含む宿主細胞は、上記のようにDNA分子を 発現させるために培養される。細胞は、標準的な方法に従い、選択された宿主細 胞の増殖に必要な栄養素を含む培養培地において培養される。種々の適切な培地 は、当該分野において公知であり、そして一般に、炭素源、窒素源、必須アミノ 酸、ビタミン、およびミネラル、ならびに他の成分(例えば、特定の宿主細胞に よって要求され得る成長因子または血清)を含む。増殖培地は、一般に、例えば 、薬物選択、または必須栄養素の欠損(DNA構築物上の選択マーカーまたはDNA構 築物とともに同時トランスフェクトされる選択マーカーによって補足されるか、 )によって、DNA構築物を含む細胞について選択する。 本発明のプロセシングされていないポリペプチドを含むポリペプチド 上記のように、本発明は、プラス鎖RNAウイルス由来のプロセシングされてい ない実質的に完全なポリタンパク質を含むポリペプチドを提供する。本発明はま た、隣接タンパク質のアミノ末端部分(例えば、HCVエンベロープ領域)に連結さ れたコア様抗原タンパク質(例えば、HCVコアタンパク質)を含むポリペプチドを 提供する。本発明はまた、特定の非構造タンパク質を提供する。１つの好ましい 実施態様において、コア様抗原タンパク質のアミノ酸配列は、図1B(配列番号８) に示されたアミノ酸配列である。このような好ましい実施態様において、ポリペ プチドは、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲルによる電気泳動に よって測定されるように、約25,000ダルトンの分子量を有し、そして約223アミ ノ酸を有すると推定された。 プラス鎖RNAウイルス由来のプロセシングされていないポリペプチドは、プラ ス鎖RNAウイルスに特異的な抗体に結合し得る。HCVの場合、このことは、ウエス タンブロッティングおよび酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)によって確認され た。プロセシングされていないコア抗原−エンベロープタンパク質は、HCVを有 する患者の血清と特異的に反応することが見出され、従って、HCVを有さないヒ トの血清とは反応しない。プラス鎖RNAウイルス由来のプロセシングされていな いポリペプチドはまた、サンプル中のプラス鎖RNAウイルスに特異的な抗体の存 在を検出し得、従って患者、特にヒトにおけるプラス鎖RNAウイルスの検出およ び診断に有用である。 本発明はまた、プラス鎖RNAウイルス由来の非構造タンパク質を含むポリペプ チドを提供する。好ましい実施態様において、ポリペプチドは、図3B(配列番号1 0)に示すポリペプチドのアミノ酸配列を有する。図3B(配列番号10)のポリペプチ ドは、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル(SDS-PAGE)を介する電 気泳動によって測定されるように、約29,000ダルトンの分子量を有し、そして約 267アミノ酸を有すると推定された。 本発明の非構造タンパク質は、プラス鎖RNAウイルスに特異的な抗体に結合し 得、HCVの場合、このことは、本明細書に開示されているNS5およびNS3-NS4非構 造タンパク質の両方について、ウエスタンブロッティングおよび(ELISA)によっ て確認された。本発明の非構造タンパク質は、プラス鎖RNAウイルスに感染した 患者の血清と特異的に反応し、従って、プラス鎖RNAウイルスを有さないヒトの 血清とは反応しない。非構造タンパク質はまた、サンプル中のプラス鎖RNAウイ ルスに特異的な抗体の存在を検出し得、従って患者、特にヒトにおけるプラス鎖 RNAウイルスの診断に有用である。 本発明のタンパク質が天然の遺伝子の部分、天然の遺伝子の誘導体によってコ ードされるか、あるいは改変されている場合、そのタンパク質は、実質的に天然 のタンパク質と同一の生物学的活性を維持する。例えば、プラス鎖RNAウイルス 由来のプロセシングされていない、実質的に完全なポリタンパク質、コア様抗原 −隣接タンパク質、または非構造タンパク質に対応するタンパク質の構造は、例 えば、P/C GeneまたはIntelligenetics Suite(Intelligenetics，Mountain View ， Calif)を用いて、あるいはKyteおよびDoolittle(J．Mol．Biol．157:105-132，1 982)により記載の方法に従って、その一次翻訳産物から予測され得る。 好ましい実施態様において、本発明は、単離されたタンパク質を提供する。タ ンパク質は、とりわけ、適切な宿主およびベクターシステムを培養し、本発明の 組換え翻訳産物を産生させることによって単離され得る。次いで、このような細 胞株の上清、あるいはタンパク質が上清中に排泄も分泌もされない場合にはタン パク質含有物または全細胞は、所望のタンパク質を単離するために、種々の精製 手順によって処置され得る。例えば、上清は、まず、市販のタンパク質濃縮フィ ルター(例えば、AmiconまたはMillipore Pellicon限外濾過ユニット)を用いて濃 縮され得る。濃縮後、濃縮物を、例えば、適切な支持体に結合した抗タンパク質 抗体のような適切な精製マトリクスに適用し得る。あるいは、タンパク質を精製 するために、陰イオンまたは陽イオン交換樹脂が使用され得る。さらなる代替法 として、タンパク質をさらに精製するために、１つ以上の逆相高速液体クロマト グラフィー(RP-HPLC)工程が使用され得る。本発明のタンパク質を単離する他の 方法は、当該分野において周知である。WO 94/25597およびWO/25598を参照。 タンパク質は、他の(所望しない)タンパク質が、SDS-PAGE分析、それに続くク ーマシーブルー染色によって検出されない場合、本発明において「単離された」と みなされる。他の実施態様では、所望のタンパク質は、SDS-PAGE分析、それに続 く銀染色によって他の(所望しない)タンパク質、および好ましくはリポポリサッ カライド(LPS)が検出されないように単離され得る。さらに他の実施態様では、 タンパク質は、検出アッセイまたは免疫学的事象を顕著に妨害する重要な抗原活 性を有する他のタンパク質がタンパク質内に含まれない場合、単離される。 本発明のプロセシングされていないポリペプチドに対する結合パートナー 本発明はまた、プロセシングされていないプラス鎖RNAウイルスポリタンパク 質、プラス鎖RNAウイルスのコア様抗原−隣接タンパク質、このようなプラス鎖R NAウイルスの非構造タンパク質または本発明の他のタンパク質に対するモノクロ ーナル抗体およびポリクローナル抗体を提供する。抗体は、本発明のポリペプチ ドを免疫原として用いてハイブリドーマを調製するための標準的な手順によって 、 および/または他の方法によって産生される。得られる抗体は、サンプル、好ま しくはヒト由来のサンプル中のプラス鎖RNAウイルスを検出するために特に有用 である。WO 94/25597およびWO/25598を参照。 ポリクローナル抗体は、種々の温血動物(例えば、ウマ、ウシ、ヤギ、ヒツジ 、イヌ、ニワトリ、シチメンチョウ、ウサギ、マウス、またはラット)から、当 業者によって容易に作製され得る。簡単に説明すると、所望のタンパク質または ペプチドを利用して、代表的には、腹腔内、筋肉内、眼内、皮下注射により動物 を免疫する。目的のタンパク質またはペプチドの免疫原性は、アジュバント（例 えば、完全または不完全フロイントアジュバント）の使用により増大させ得る。 何回かの追加免疫後、血清の小量サンプルを回収し、そして所望のタンパク質ま たはペプチドに対する反応性についてテストする。 一旦、タンパク質に対する反応性に関して、動物の力価がプラトーに達すると より多量のポリクローナル抗血清が、毎週の採血または動物を放血させるかのい ずれかにより容易に入手され得る。 モノクローナル抗体もまた、周知の技術を用いて容易に作製され得る(米国特 許第RE32,011号、同第4,902,614号、同第4,543,439号および同第4,411,993号を 参照；またMonoclonal Antibodies，Hybridomas: A New Dimension in Biologic al Analyses，Plenum Press，Kennett，McKearnおよびBechtol(編)，1980および Antibodies: A Laboratory Manual、前出を参照)。簡単に説明すると、１つの実 施態様において、被験動物(例えば、ラットまたはマウス)に所望のタンパク質ま たはペプチドを注射する。所望であれば、タンパク質によって生じる得られる免 疫応答を増大させるために、より高い抗体反応性を生じさせるために、種々の技 術が利用され得る。例えば、所望のタンパク質またはペプチドは、別のタンパク 質(例えば、オブアルブミンまたはキーホールリンペットヘモシアニン(KLH))に 結合し得るか、またはアジュバント(例えば、完全または不完全フロイントアジ ュバント)の使用を介し得る。免疫応答の初回誘発は、腹腔内、筋肉内、眼内、 または皮下経路を介し得る。 初回免疫の１週間後と３週間後との間に、動物は、追加免疫によって再免疫さ れ得る。次いで、動物はテスト採血され得、そして血清は、上記のアッセイを用 いて、プロセシングされていないポリペプチドへの結合についてテストされ得る 。動物が、所望のタンパク質またはペプチドに対する反応性において、プラトー に達するまで、さらなる免疫化が行われ得る。次いで、動物は、所望のタンパク 質またはペプチドの最終追加免疫を与えられ得、そして３〜４日後に屠殺される 。この時、脾臓およびリンパ節が回収され、そしてこれらの器官をメッシュスク リーンに通過させることによって、または細胞を被包する脾臓膜もしくはリンパ 節膜を破裂させることによって、単一細胞懸濁液に破壊される。１つの実施態様 において、赤血球は、続いて、低張溶液の添加、続く迅速な等張性への復帰によ って溶解される。 別の実施態様において、モノクローナル抗体を調製するために適切な細胞は、 インビトロ免疫技術の使用により得られる。簡単に説明すると、動物を屠殺し、 そして上記のように膵臓およびリンパ節細胞を取り出す。単一細胞の懸濁液を調 製し、そして細胞を、上記のような免疫応答を生じるに適切である、所定の形態 の目的のタンパク質またはペプチドを含む培養物中に置く。続いて、リンパ球を 回収し、そして下記のように融合する。 上記のように、インビトロ免疫の使用によるかまたは免疫された動物から得ら れる細胞は、ウイルス(例えば、エプスタイン−バールウイルス(EBV))を用いる トランスフェクションによって不死化され得る。(GlaskyおよびReading，Hybrid oma 8(4):377-389，1989)。あるいは、好ましい実施態様では、回収された脾臓 および/またはリンパ節の細胞懸濁液は、モノクローナル抗体を分泌する「ハイブ リドーマ」を作製するために、適切なミエローマ細胞と融合される。適切なミエ ローマ株は、好ましくは、抗体の構築および発現を欠損し、そしてさらに免疫さ れた動物由来の細胞と同遺伝子型である。多くのそのようなミエローマ株が、当 該分野において周知であり、そしてアメリカンタイプカルチャーコレクション(A TCC；Rockville，Maryland)(Catalogue of Cell Lines & Hybridomas 第６版、A TCC、1988)のような供給源から得ることができる。代表的なミエローマ株として は、ヒトについては、UC 729-6(ATCC番号CRL 8061)、MC/CAR-Z2(ATCC番号CRL 81 47)、およびSKO-007(ATCC番号CRL 8033)；ならびにマウスについては、SP2/O-Ag 14(ATCC番号CRL 1581)、およびP3X63Ag8(ATCC番号TIB 9)：ならびにラットにつ いては、Y3-Agl.2.3(ATCC番号CRL 1631)、およびYB2/0(ATCC番号CRL 1662)が挙 げられる。特に好ましい融合株としては、NS-1(ATCC番号TIB 18)およびP3X63-Ag 8.653(ATCC番号CRL 1580)が挙げられ、マウス、ラット、またはヒトのいずれの 細胞株との融合のためにも利用され得る。ミエローマ細胞株と免疫された動物由 来の細胞との間の融合は、ポリエチレングリコール(PEG)(Antibodies: A Labora tory Manual，前出を参照)または電気融合(ZimmermanおよびVienken，J．Membra ne Biol．67:165-182，1982)の使用を包含する種々の方法によって達成され得る 。 融合後、細胞は、適切な培地(例えば、RPMI 1640またはDMEM(ダルベッコの改 変イーグル培地、JRH Biosciences，Lenexa，Kan.))を含む培養プレート中に置 かれる。培地はまた、さらなる成分(例えば、ウシ胎児血清(FBS、例えば、Hyclo ne(Logan，Utah)またはJRH Biosciences製)、免疫に使用した同じ種の幼生動物 から採取した胸腺細胞、または培地を固化するための寒天)を含み得る。さらに 、培地は、融合された脾臓およびミエローマ細胞の増殖を選択的に可能にする試 薬を含むべきである。特に、好ましいのは、HAT培地(ヒポキサンチン、アミノプ テリン、およびチミジン)(Sigma Chemical Co.，St．Louis，MO.)の使用である 。約７日後、得られる融合細胞またはハイブリドーマは、HCVのコアーエンベロ ープ領域またはHCV非構造タンパク質を認識する抗体の存在を決定するために、 スクリーニングされ得る。何回かのクローン希釈および再アッセイ後、目的のタ ンパク質に結合する抗体を産生するハイブリドーマが単離され得る。 他の技術もまた、モノクローナル抗体を構築するために利用され得る(Huseら 、「Generation of a Large Combinational Library of the Immunoglobulin Rep ertoire in Phage Lambda」、Science 246:1275-1281，1989を参照；また、Sastr yら、「Cloning of the Immunological Repertoire in Escherichia coli for Ge neration of Monoclonal Catalytic Antibodies: Construction of a Heavy Cha in Variable Region-Specific cDNA Library」、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 86 :5728-5732，1989を参照；また、Alting-Meesら、「Monoclonal Antibody Expres sion Libraries: A Rapid Alternative to Hybridomas」、Strategies in Molecu lar Biology 3:1-9，1990を参照；これらの文献は、組換え技術による抗体の産 生を可能にする、Stratacycte(La Jolla，Califormia)から入手可能な市販のシ ス テムについて記載している)。簡単に説明すると、mRNAが、B細胞集団から単離さ れ、そしてλIMMUNOZAP(H)およびλIMMUNOZAP(L)ベクターにおいて、重鎖および 軽鎖免疫グロブリンcDNA発現ライブラリーを作製するために利用される。これら のベクターは、個々にスクリーニングされ得るか、または同時発現されFabフラ グメントまたは抗体を形成し得る(Huseら、前出を参照；また、Sastryら、前出 を参照)。続いて、陽性プラークが、E.coliからのモノクローナル抗体フラグメ ントの高レベル発現を可能にし得る、非溶解性プラスミドに変換され得る。 同様に、結合パートナーはまた、特異的に結合する抗体をコードする遺伝子の 可変領域を取り込む組換えDNA技術を利用して構築され得る。これらの結合パー トナーの構築は、本明細書に提供される開示内容を考慮すると、当業者によって 容易に達成され得る。(Larrickら、「Polymerase Chain Reaction Using Mixed P rimers: Cloning of Human Monoclonal Antibody Variable Region Genes From Single Hybridoma Cells」、Biotechnology 7:934-938，1989；Riechmannら、「Re shaping Human Antibodies for Therapy」、Nature 332:323-327，1988；Roberts ら、「Generation of an Antibody with Enhanced Affinity and Specificity fo r its Antigen by Protein Engineering」、Nature 328:731-734，1987；Verhoey enら「Reshaping Human Antibodies: Grafting an Antilysozyme Activity」、Sci ence 239:1534-1536，1988；Chaudharyら、「A Recombinant Immunotoxin Consis ting of Two Antibody Variable Domains Fused to Pseudomonas Exotoxin」、Na ture 339:394-397，1989を参照；また、米国特許第5,132,405号(発明の名称「Bio synthetic Antibody Binding Stites」)を参照)。簡単に説明すると、１つの実施 態様において、所望の目的のタンパク質またはペプチドに特異的な抗原結合性ド メインをコードするDNAセグメントが、特異的に結合するモノクローナル抗体を 産生するハイブリドーマから増幅され、そしてヒト抗体を産生する細胞のゲノム に直接挿入され得る。(Verhoeyenら、前出を参照；また、Reichmannら、前出を 参照)。この技術は、特異的に結合するマウスまたはラットのモノクローナル抗 体の抗原結合部位が、ヒト抗体に移入されることを可能にする。このような抗体 は、ヒトにおける治療用途に好ましい。なぜなら、それらは、ラットまたはマウ ス抗体ほど抗原性ではないからである。 別の実施態様において、目的のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ 由来の可変領域をコードする遺伝子が、その可変領域に対するオリゴヌクレオチ ドプライマーを用いて増幅される。これらのプライマーは、当業者によって合成 され得るか、または商業的に利用可能な供給源から購入され得る。例えば、マウ スおよびヒト可変領域に対するプライマー(とりわけＶ_Ha、Ｖ_Hb、Ｖ_Hc、Ｖ_Hd、 Ｃ_Hl、Ｖ_LおよびＣ_L領域に対するプライマーを含む)は、Stratacyte(La Jolla， Calif.)から入手可能である。これらのプライマーは、重鎖または軽鎖可変領域 を増幅するために利用され得る。次いで、これらの領域は、それぞれ、IMMUNOZA P^TM(H)またはIMMUNOZAP^TM(L)(Stratacyte)のようなベクター中に挿入され得る。 次いで、これらのベクターは、発現のためにE.coliに導入され得る。これらの技 術を用いて、Ｖ_HドメインとＶ_Lドメインとの融合物を含む大量の一本鎖タンパク 質が産生され得る(Birdら、Science 242:423-426，1988を参照)。 モノクローナル抗体および結合パートナーは、組織培養物、細菌、真核生物細 胞、植物、および当該分野において公知の他の宿主システムを含む、多くの宿主 システムにおいて産生され得る。 一旦、適切な抗体または結合パートナーが得られると、それらは、当業者に周 知の多くの技術によって、単離または精製され得る(Antibodies: A Laboratory Manual．HarlowおよびLane(編)、Cold Spring Harbor Laboratory Press，1988 ；米国特許第4,736,110号；および米国特許第4,486,530号を参照)。適切な単離 技術には、ペプチドまたはタンパク質アフィニティーカラム、HPLCまたはRP-HPL C、プロテインＡまたはプロテインＧカラムによる精製、またはこれらの技術の 任意の組合せが挙げられる。本発明において、抗体または結合パートナを定義す るために用いられる用語「単離された」は、「実質的に他の血液成分がない」ことを 意味する。 本発明の抗体および結合パートナーは、多くの用途を有する。以下にさらに記 載するように、本発明の抗体および結合パートナーは、プラス鎖RNAウイルスの 検出および診断に特に有用である。他の用途としては、例えば、本発明の１つ以 上のタンパク質を提示する細胞を選別するためのフローサイトメトリーが挙げら れる。簡単に説明すると、細胞上の目的のタンパク質またはペプチドを検出する ために、細胞は、目的のタンパク質に特異的に結合する標識されたモノクローナ ル抗体とともにインキュベートされ、続いて、結合抗体の存在を検出する。これ らの工程はまた、さらなる工程(例えば、非結合抗体を除去するための洗浄工程) を伴って行われ得る。本発明における使用に適切な標識は、当該分野において周 知であり、これには、とりわけ、フルオレセインイソチオシアネート(FITC)、フ ィコエリトリン(PE)、西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)、および金コロイドが 含まれる。フローサイトメトリーにおける使用については、FITCが特に好ましく 、これは、「Conjugation of Fluorescein Isothiocyanate to Antibodies．I．E xperiments on the Conditions of Conjugation」、Immunology 18:865-873，197 0のKeltkampの方法に従って、精製された抗体に結合され得る。(また、Keltkamp 、「Conjugation of Fluorescein Isothiocyanate to Antibodies．II．A Reprod ucible Method」、Immunology 18:875-881，1970；Goding、「Conjugation of Ant ibodies with Fluorochromes: Modification to the Standard Methods」、J．Im munol．Methods 13:215-226，1970を参照)。 サンプル中のプラス鎖RNAウイルスの検出に関するアッセイ 上記のように、本発明は、プラス鎖RNAウイルス由来の、プロセシングされて いない、実質的に完全なポリタンパク質を含むポリペプチドを提供する。本発明 はまた、コア様抗原−隣接タンパク質および特定の非構造タンパク質を含むポリ ペプチドを提供する。本発明はさらに、サンプル中のこのようなポリペプチドを 検出する方法を提供する。このアッセイは、代表的には、プラス鎖RNAウイルス により提示される抗原またはプラス鎖RNAウイルスに対して産生される抗体の検 出に基づくが、当該分野において公知のように、核酸をベースにするアッセイ( 代表的には、ハイブリダイゼーションに基づく)もまた含み得る。この方法は、 プラス鎖RNAウイルスに対する抗体により結合される、本発明のポリペプチドの 能力、およびサンプル中のプラス鎖RNAウイルスの抗原に結合する、本発明のタ ンパク質に対して産生された抗体の能力によって特徴付けられる。 驚くべきことに、本発明のプロセシングされていないポリペプチドは、プラス 鎖RNAウイルスの、顕著により良好でより高感度の検出を提供する。例えば、HCV に関して、プロセシングされていないコア抗原−エンベロープタンパク質は、プ ロセシングされたコアタンパク質(時には、p22と呼ばれる)またはコアタンパク 質のフラグメント単独より、顕著に良好な、サンプル中のHCVの検出を提供する 。また、驚くべきことに、アッセイにおける、プラス鎖RNAウイルスのプロセシ ングされていないコア様抗原−隣接タンパク質および非構造タンパク質の両方の 使用は、プロセシングされていないコア様抗原−隣接タンパク質または非構造タ ンパク質のいずれかを単独で使用した場合より、顕著に高感度の、プラス鎖RNA ウイルスの検出を可能にする相乗効果を提供する。 プラス鎖RNAウイルスの検出のために好ましいアッセイは、サンドイッチアッ セイ(例えば、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA))である。１つの好ましい実施 態様において、ELISAは以下の工程を包含する：(1)本発明のコア抗原−エンベロ ープタンパク質を、固相にコートする工程、(2)HCV抗体を含むと疑われるサンプ ルを、固相にコートしたポリペプチドとともに、抗原−抗体複合体の形成を可能 にする条件下でインキュベートする工程、(３)固相に結合した得られる抗原−抗 体複合体により捕捉される標識を結合した抗抗体(例えば、抗IgG)を添加する工 程、および(４)捕捉された標識を測定し、そしてこの測定からサンプルがHCV抗 体を有するかどうかを決定する工程。 好ましいアッセイは上述されているが、サンプルから所望のタンパク質に特異 的に結合する抗体を検出するため、またはサンプルから１またはそれ以上の抗体 に結合する所望のタンパク質を検出するために、種々のアッセイが利用され得る 。例示的なアッセイは、Antibodies：A Laboratory Manual(HarlowおよびLane( 編)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1988)に詳細に記載される。この ようなアッセイの代表的な例は、交叉免疫電気泳動(CIEP)、ラジオイムノアッセ イ、放射免疫沈降法、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、ドットブロットアッ セイ、阻害または競合アッセイ、サンドイッチアッセイ、イムノスティック(デ ィップ-スティック)アッセイ、同時アッセイ、免疫クロマトグラフィーアッセイ 、免疫濾過アッセイ、ラテックスビーズ凝集アッセイ、免疫蛍光アッセイ、バイ オセンサーアッセイ、および低光検出アッセイ(low-light detection assay)を 含む(米国特許第4,376,110号および第4,486,530号；WO 94/25597；WO/25598を参 照；また、Antibodies: A Laboratory Manual(前掲)も参照)。 蛍光抗体テスト(FAテスト)は、本発明の１つのタンパク質に結合し得る、蛍光 標識された抗体を使用する。検出には、視覚的測定が、蛍光顕微鏡観察を使用し て熟練者によってなされる。これは定性的な結果を与える。１つの実施態様にお いて、このアッセイは、組織サンプルまたは組織学的切片の検査のために使用さ れる。 ラテックスビーズ凝集アッセイにおいて、本発明の１またはそれ以上のタンパ ク質に対する抗体を、ラテックスビーズに結合させる。次いで、ラテックスビー ズに結合し抗体を、サンプルと、抗体がサンプル中の所望のタンパク質(もしあ れば)と結合することを可能にする条件下で接触させる。次いで、結果は視覚的 に読み取られ、定性的な結果を与える。１つの実施態様において、この方式は、 オンサイト(on-site)テストの分野において使用され得る。 酵素イムノアッセイ(EIA)には、本発明により提供される抗体を利用し得る多 くの異なるアッセイが含まれる。例えば、異種間接EIAは、本発明の抗体と結合 した固相およびアフィニティー精製された抗IgG免疫グロブリン調製物を使用す る。好ましくは、固相は、ポリスチレンマイクロタイタープレートである。次い で、抗体および免疫グロブリン調製物を、サンプルと、抗体結合を可能にする条 件下で接触させる。この条件は当該分野において周知である。このようなアッセ イの結果は、視覚的に読み取られ得るが、好ましくは、分光光度計(例えば、ELI SAプレートリーダー)を使用して読み取られ、定量的な結果を与える。別の固相E IA方式は、アッセイの手順の間に、磁石により除去され得るプラスチックコート した鉄金属ビーズを含む。さらに別の代替法は、低光検出イムノアッセイ方式で ある。この高度に感受性の方式において、適切に標識された結合した抗体により 生じる発光は自動的に定量される。好ましくは、この反応は、マイクロタイター プレートを使用して行われる。 別の実施態様において、放射活性トレーサーを、EIAにおいて検出を仲介する 酵素と置き換えて、ラジオイムノアッセイ(RIA)とされる。 捕捉抗体サンドイッチ酵素アッセイにおいて、所望のタンパク質は、固相(好 ましくは、ポリスチレンマイクロタイタープレート)に付着した抗体と標識され た抗体との間に結合する。好ましくは、結果は、分光光度計(例えば、ELISAプレ ートリーダー)を使用して測定される。このアッセイは、本発明に好ましい１つ の実施態様である。 逐次(sequential)アッセイ方式において、試薬は、段階的な様式で、捕捉抗体 とともにインキュベートされる。テストサンプルがまず、捕捉抗体とともにイン キュベートされる。洗浄工程に続いて、標識された抗体とともにインキュベート する。同時アッセイにおいて、逐次アッセイにおいて記載された２つのインキュ ベーション期間は組み合わされる。これは、１つのインキュベーション期間およ び洗浄工程を省略する。 ディップスティック/イムノスティック方式は、固相が、ポリスチレンマイク ロタイタープレートである代わりに、ポリスチレンパドルまたはディップスティ ックであることを除いて、本質的にはイムノアッセイである。試薬は同じであり 、この方式は同時または逐次のいずれかであり得る。 クロマトグラフィーストリップテスト方式において、捕捉抗体および標識され た抗体が、クロマトグラフィーストリップ(代表的には、ニトロセルロース、ま たは酢酸セルロースに接合された高い有孔性のナイロン)上に乾燥される。捕捉 抗体は、通常、ストリップの一端に線状に噴射乾燥される。この端にストリップ と接触している吸収材がある。ストリップの他端に、標識された抗体が、メンブ レン中に吸収されることを防ぐ様式で、置かれる。通常、抗体に付着させる標識 は、ラテックスビーズまたはコロイド状の金である。このアッセイは、標識され た抗体の直前にサンプルを塗布することによって開始され得る。 免疫濾過/免疫濃縮方式は、大きな固相表面をサンプル/試薬の指向性フローと 組み合わせる。サンプル/試薬の指向性フローは一点に集中し(concentrate)、そ して抗原と抗体との結合を加速させる。好ましい方式において、テストサンプル は、標識された抗体とともにプレインキュベートされ、次いで固相(例えば、フ ァイバーフィルターまたはニトロセルロースメンブレンなど)に塗布される。固 相もまた、捕捉抗体をコートしたラテックスビーズまたはガラスビーズを予めコ ートされ得る。分析物の検出は、標準的なイムノアッセイと同じである。サンプ ル/試薬のフローは、減圧または基礎をなす吸収材のウィッキング作用のいずれ かにより調整され得る。 閾値バイオセンサーアッセイは、多数のサンプルの低コストでのスクリーニン グになじみ易い、高感度の計器アッセイ(instrumented assay)である。１つの実 施態様において、このようなアッセイは、光アドレッサブル電位差センサー(lig ht addressable potentiometric sensor)の使用を包含する。ここで、反応には 、捕捉抗体、架橋抗体、およびウレアーゼ結合抗体による所望のタンパク質の結 合に起因するpH変化の検出が含まれる。結合の際、電位(μボルト)への翻訳によ り測定され得るpH変化がおこる。このアッセイは、代表的には、非常に小さな反 応容量で生じ、そして非常に高感度である。さらに、このアッセイの報告された 検出限界は、1,000ウレアーゼ分子/分である。 HCV に対する免疫応答の誘発のための組成物および方法 本発明はまた、プラス鎖RNAウイルスに対する免疫応答(体液性、細胞性、また はその両方のいずれであってもよい)の誘発のための組成物および方法を提供す る。好ましくは、免疫応答は、プラス鎖RNAウイルスに対するワクチンによって 誘導され、従って免疫防御性免疫応答である。これらの組成物および方法は、代 表的には、本発明のプロセシングされていないポリペプチドを、薬学的に受容可 能なキャリアまたは希釈剤と組み合わせて含む免疫原を包含する。好ましい実施 態様において、この組成物および方法は、HCVのプロセシングされていないコア 抗原−エンベロープタンパク質およびHCVの非構造タンパク質(さらに好ましくは 、NS5非構造タンパク質またはNS3-NS4非構造タンパク質)の両方を包含する。こ の組成物および方法はまた、本発明のタンパク質を含む不活化調製物または弱毒 化調製物を包含する。 従って、本発明の別の局面は、免疫応答を誘発し得る単離された抗原、好まし くは、動物を免疫し得る免疫原を提供する。好ましい実施態様において、図1A、 1B、3A、または3Bに示されるアミノ酸配列または分子、あるいはこれらの図に示 される配列に由来するアミノ酸配列または分子、あるいはそれらの実質的均等物 を含む。当業者により理解されるように、本発明のポリペプチドに関して、アミ ノ酸配列のわずかな逸脱(deviation)は、免疫原の免疫原性に影響することなく なされ得る。上記タンパク質の実質的均等物は、元のアミノ酸と実質的に同じ電 荷および疎水性を維持するアミノ酸の保存的置換を含む。保存的置換には、イソ ロイシンまたはロイシンに対するバリンの置換、およびグルタミン酸に対するア スパラギン酸の置換、ならびに同様な性質の他の置換が含まれる(Dayhoffら(編) 、「Atlas of Protein Sequence and Structure」、Natl.Biomed.Res.Fdn、1978を 参照)。 当業者に明らかなように、上記の免疫原(その実質的均等物を含む)は、異なる 動物において異なるレベルの応答を刺激し得る。上記の免疫原(その実質的均等 物を含む)は、ワクチンとしての有効性についてテストされ得る。これらのテス トには、Ｔ細胞増殖アッセイ、刺激後のリンホカイン産生の測定、および免疫防 御試験が含まれる。簡潔に述べれば、Ｔ細胞増殖アッセイは、細胞仲介免疫につ いての能力の指標として利用され得る。さらに、免疫原による刺激後のリンホカ イン産生の証拠は、免疫原により提供される防御についての能力を測定するため に利用され得る。 最後に、下記のように、動物において防御を測定するために、現実の免疫防御 試験が実施され得る。しかし、ヒトの場合、免疫防御試験の代わりに、まず、HC Vに感染した患者に由来する末梢血リンパ球(PBL)を、以下の様式でスクリーニン グすることが好ましい。簡潔に述べれば、PBLは、フィコール密度勾配遠心分離 を使用して、希釈された全血から単離され、そして下記のように、[³H]−チミジ ンを用いる細胞増殖研究において利用され得る。次いで、陽性ペプチドを選択し 、そして霊長類の試験に利用する。 本発明の免疫原(またはポリペプチド)は、当該分野において周知の多くの他の 技術を利用して、容易に作成され得る(Sambrookら、前掲、Molecular Cloning， A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press、1989を参照)。 本発明のポリペプチドを、薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤と組み合 わせて含む免疫原は、当該分野において公知の多くの手順に従って、患者に投与 され得る(WO 94/25597およびWO/25598を参照)。 本発明の目的のためには、温血動物には、とりわけ、ヒトおよび霊長類が含ま れる。 多くの適切なキャリアまたは希釈剤が、本発明において利用され得、これには 、とりわけ、生理食塩水、緩衝化生理食塩水、および非特異血清アルブミンと混 合された生理食塩水が含まれる。薬学的組成物はまた、他の賦形剤成分を含み得 、これには、アジュバント、緩衝液、抗酸化剤、炭水化物(例えば、グルコース 、スクロース、またはデキストリン)、およびキレート剤(例えば、EDTA)が含ま れる。特に好ましい実施態様では、アジュバントが免疫原とともに利用される。 このようなアジュバントの例には、ヒトについては、ミョウバンまたは水酸化ア ルミニウムが含まれる。 投与の量および頻度は、臨床試験において決定され得、そして因子(例えば、 プラス鎖RNAウイルス種(このウイルス種に対して防御することが所望される)、 使用される特定の抗原、必要な防御の程度、および多くの他の因子)に依存し得 る。好ましい実施態様において、免疫には経口投与が含まれる。あるいは、ワク チンは、皮下経路または他の経路により非経口的に投与され得る。適用に依存し て、注入する免疫原の量は、生理学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤と組み 合わせて、アジュバントビヒクル中50μgから数ミリグラムまで、好ましくは、 約100μgから１mgまで変化する。追加免疫を４〜６週間後から与え得る。 本発明はまた、HCVのプロセシングされていないコア抗原−エンベロープタン パク質または非構造タンパク質(あるいはその両方)を動物中で発現し得る核酸ベ クターの投与を包含する。ここで、この核酸分子は、この核酸分子から発現した 発現タンパク質に対して、従ってHCVに対して、動物において免疫応答を誘発し 、そして好ましくは動物を免疫し得る。この手順の１つの実施態様において、裸 のDNAを適切な細胞(例えば、筋細胞)中に導入する。この細胞において、このDNA はタンパク質を産生し、次いでこのタンパク質がこの細胞の表面に提示され、こ のことによって、宿主の細胞傷害性Ｔリンパ球(CTL)から応答を誘発する。この ことは、誘発された応答が特異抗体を含む従来の免疫原に対する利点を提供する 。特異抗体は、一般には、株特異的であり、そして異なる株の対応する抗原を認 識し得ない。一方、CTLは、保存される抗原に対して特異的であり、そして対応 する抗原を発現する異なる株に対して応答し得る(Ulmerら、「Heterologous prot ection against influenza by injection of DNA encoding a viral protein」、 Sc ience、259:1745-1749、1993；Linら、「Expression of recombinant genes in m yocardium in vivo after direct injection of DNA」、Circulation、82:2217-2 1、1990；Wolffら、「Long-term persistence of plasma DNA and foreign gene expression in mouse muscle」、Human Mol.Gen．1:363-69、1992)。 裸のベクター構築物の動物細胞中への導入により、次いで、この構築物は、こ の構築物が運ぶ核酸分子(代表的には、遺伝子)を発現し得る。遺伝子は、好まし くは、HCVの１つ(またはそれ以上)のプロセシングされていないコア抗原−エン ベロープタンパク質または非構造タンパク質を含む。従って、所望のペプチドの 発現により、免疫応答が宿主動物から誘発される。好ましくは、免疫応答は、所 定の形態の所望のペプチドを提示する異なる株に対して応答し得るCD8⁺ CTLを包 含する。 本願発明の種々の局面を実施するためのキット 本発明はさらに、プラス鎖RNAウイルス由来の抗原または抗体の存在について 、サンプルを分析するためのキットを提供する。このキットは、本発明のポリペ プチドまたは抗体、および適切な固相を含む。好ましくは、ポリペプチドは固相 に結合される。このキットはまた、HCV抗原または抗体の検出のための、１また はそれ以上の試薬および/またはデバイスを提供する。キットに包含される種々 の方式、試薬およびデバイス(抗原または抗体を検出するための手段を含む)が、 本明細書中で議論される。 本発明はまた、免疫応答を誘導するためのキットを提供する。このキットは、 本発明のポリペプチドを、薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤とともに含 有する組成物を含み、そしてまた、この組成物を投与するためのデバイス、また はこの組成物の投与を補助するためのデバイスを提供する。 本発明の特徴を有する使用に適切な他のキットもまた、本明細書により提供さ れる。 以下の実施例は、限定のためではなく、例示のために提供される。 実施例 以下の実施例は３つの群に分けられる。第１は、適切なコア様抗原−隣接タン パク質(すなわち、HCVのプロセシングされていないコア抗原−エンベロープ融合 タンパク質)の単離および作成、ならびに非構造タンパク質を用いないその使用 に関する実施例である。第２は、コア様抗原−隣接タンパク質との使用に適切な 第２のタンパク質(すなわち、HCVの非構造タンパク質)の単離および作成、なら びにHCVコア抗原−エンベロープ融合タンパク質を用いないその使用に関する実 施例である。第３は、コア様抗原−隣接タンパク質と第２のタンパク質(例えば 、HCV NS5タンパク質、HCV NS3-NS4タンパク質、HIVエンベロープタンパク質お よびHTLV-Iエンベロープタンパク質)との組み合わせおよび使用に関する実施例 である。第４は、コア様抗原−隣接タンパク質に対するモノクローナル抗体の作 製の実施例である。第５は、動物において免疫応答を誘導するための、適切なコ ア様抗原−隣接タンパク質(すなわち、HCVのプロセシングされていないコア抗原 −エンベロープ融合タンパク質)の使用に関する実施例である。 コア様抗原−隣接タンパク質の単離および作成 １． HCV cDNA のクローニング Ｃ型肝炎ウイルスに感染した患者の血漿を集め、そして４℃にて超遠心分離し 、次いでウイルス粒子を得た。次いで、ウイルス核酸(RNA)を、ウイルス粒子か ら、グアニジンイソチオシアネートおよび酸性フェノールを使用して、抽出およ び精製した(Chomczynskiら、Anal.Biochem．162:156-159、1987)。 以下のオリゴヌクレオチド配列： を、cDNAのクローニングにおけるプライマーとして使用した。一本鎖DNA分子を 、ランダムプライマー、逆転写酵素、およびRNAテンプレートを使用して作製し た。 HCVコアーエンベロープ領域の配列を含む二本鎖DNA分子を、Taqポリメラーゼお よびプライマー(i)および(ii)を使用するPCR法によって増幅した。 クローニングしたDNA分子を、同定のため配列分析に供した。得られた分子をE N-80-2と呼んだ。分子EN-80-2のDNA配列を図1A(配列番号７)に与える。DNA分子 は、HCVコアおよびエンベロープ領域に由来し、そして669bpを有する。 ２． HCV cDNA を含むプラスミドの構築 分子EN-80-2を制限エンドヌクレアーゼBamHIおよびEcoRIで処理して、所望のH CV cDNAを含むDNAフラグメントを得た。得られたDNAフラグメントを、制限エン ドヌクレアーゼBamHIおよびEcoRIで最初に切断したビヒクルプラスミド中に挿入 して、pEN-2と呼ぶ発現プラスミドを得た。HCV cDNAの発現は、T7プロモーター の制御下にある。発現プラスミドpEN-2の構造および制限地図を、図２に示す。 ３． E.coli の形質転換 発現プラスミドpEN-2をE.coli BL21(DE3)中に形質転換し、アンピシリン寒天 プレートに拡げ、そして37℃インキュベーター中に一晩置いた。HCVコア抗原タ ンパク質を産生するE.coliコロニーを、SDS-PAGEおよびウエスタンブロッティン グによりそれらの発現生成物をスクリーニングすることによって選択した。 ４． プロセシングされていないコア抗原−エンベロープタンパク質の作成 形質転換したE.coliコロニーを、馴化培養培地中でインキュベートした。コロ ニーを遠心分離し、そして凍結融解サイクルおよびリゾチーム消化により溶解し た。プロセシングされていないコア抗原−エンベロープタンパク質生成物を、溶 解した細胞により遊離させ、そしてカラムクロマトグラフィーにより精製した。 このポリペプチドは90％以上純粋であった。 プロセシングされていないコア抗原−エンベロープタンパク質は、ドデシル硫 酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲルによる電気泳動によって測定されるよう に、約25,000ダルトンの分子量を有する。 ５． ウエスタンブロッティングによる、HCVコア抗原のHCV抗体との免疫学的 反応性 精製したプロセシングされていないコア抗原−エンベロープタンパク質を、標 準的な手順を使用するSDS-PAGE電気泳動に供した。SDS-PAGEゲルを、４℃の脱イ オン水で15分間洗浄し、そして４℃のブロッティング緩衝液(0.15Mリン酸ナトリ ウム緩衝液、pH6.7)で20分間洗浄した。次いで、ゲル上のポリペプチドを、ブロ ッティング緩衝液下、1.3Aにて１〜1.5時間、ニトロセルロースメンブレンにエ レクトロブロッティングした。メンブレンを洗浄緩衝液(PBS-Tween20、pH7.4)で 洗浄し、そしてブロッキング緩衝液(0.1M NaCl，５mM EDTA、50mM Tris(pH7.2〜 7.4)、0.2％ウシ血清アルブミン、0.05％Nonidet p-40、１M尿素)で一晩ブロッ クした。 メンブレンを、Ｃ型肝炎に感染した/感染していない人の血清(40％新生ウシ血 清/Tris-HCl(pH7.4)で10×にまず希釈した)と、40℃にて２時間反応させた。反 応後、メンブレンを、洗浄緩衝液で３回洗浄した。メンブレンを、抗hIgG:HRPO 結合体(下記のように調製された)と40℃にて２時間反応させた。反応後、メンブ レンを洗浄緩衝液で３回洗浄し、次いで10mlの基質溶液(0.01％ ４-クロロ-１- ナフトール、18％メタノール、0.04M Tris(pH7.2〜7.4)、0.1M NaClおよび0.01 ％ H₂O₂)と20分間反応させた。本発明のプロセシングされていないコア抗原−エ ンベロープタンパク質は、HCV患者の血清と反応性であったが、健常人の血清と は反応性ではなかった。 ６． HCV 抗体のためのELISA (Ａ) マイクロタイタープレートの処理 マイクロタイタープレートに、本発明の精製したプロセシングされていないコ ア抗原−エンベロープタンパク質を、適切な濃度でコートし、そしてこれを、ウ シ血清アルブミンを含む緩衝液でブロックした。処理したマイクロタイタープレ ートを２〜８℃にて保存した。 (Ｂ) 抗hIgG:HRPO結合体の調製 精製した抗ヒト免疫グロブリンＧ(抗hIgG)を、NaIO₄を使用して西洋ワサビペ ルオキシダーゼ(HRPO)と結合させて、抗IgG:HRPO結合体を得た。この結合体をク ロマトグラフィーにより精製した。 (Ｃ) 試薬の成分 (a) 洗浄溶液：0.9％ NaClおよびThimerosalを含むリン酸緩衝液。 (b) 抗hIgG:HRPO結合体溶液：タンパク質安定化剤(proteineous stabilizer )および防腐剤を含むTris緩衝液に溶解した、上記のように調製された抗hIgG:HR PO結合体。 (c) サンプル希釈剤：タンパク質安定化剤および防腐剤を含むTris緩衝液。 (d) OPD基質溶液：H₂O₂を含むクエン酸−リン酸緩衝液に溶解したo-フェニ レンジアミン(OPD)。（この溶液がオレンジ色になると、それは、この溶液が汚 染され、もはや使用し得ないことを意味する。） (e) 停止溶液：２N H₂SO₄溶液。 (f) 陽性/陰性コントロール：適切な濃度でタンパク質安定化剤および防腐 剤を含むリン酸緩衝液で希釈された、Ｃ型肝炎に感染した/感染していない人の 血清サンプル。 (Ｄ) 手順: (a) 150マイクロリットル(μl)のテストサンプルを、サンプル希釈剤で希釈 し(1:10)、そして陽性/陰性コントロールを、処理したマイクロタイタープレー トのウェル中に加えた。いくつかのウェルを基質ブランクとして保持した。 (b) プレートを、振盪することによって穏やかに混合し、そして37〜40℃に て１時間インキュベートした。 (c) プレートを、１ウェルあたり0.3mlの洗浄溶液で３回洗浄した。 (d) 100μlの抗hIgG:HRPO結合体溶液を各ウェルに加えた。 (e) プレートを、振盪することによって穏やかに混合し、そして37〜40℃に て30分間インキュベートした。 (f) プレートを５回洗浄した。 (g) 100μlのOPD基質溶液を各ウェルに加え、そしてプレートを15〜30℃に て、遮光して30分間インキュベートした。 (h) 100μlの停止溶液を各ウェルに加え、そして穏やかに混合して反応を停 止させた。 (i) 各ウェルのOD値を、分光光度計において492nmで測定した。 (Ｅ) 測定: 各ウェルのOD_492nm値から、ブランク(バックグラウンド)の読み取り値の平均 を引く。陽性コントロールの読み取り値の平均(PCx)と陰性コントロールの読み 取り値の平均(NCx)との間の差(PCx-NCx)は、0.5以上である。 カットオフ値(CO)を以下の式より計算する： テストサンプルの読み取り値がCO値未満であった場合、サンプルは陰性と考え られた(すなわち、HCV抗体はサンプル中に検出され得なかった)。 テストサンプルの読み取り値がCO値以上であった場合、サンプルは陽性である と予想された；しかし、そのサンプルについてのアッセイを２連で(in duplicat e)繰り返すことが好ましい。２連のサンプルのいずれかの読み取り値が、CO値未 満であった場合、サンプルは陰性であると考えられた。２連のサンプルがともに カットオフ値以上であった場合、サンプルは陽性であると考えられた。 テストサンプルの読み取り値が、NCxより大きいがCO値より20％小さい場合、 サンプルは、不確かなサンプルとみなされるべきであり、そしてそのようなサン プルについてはアッセイを繰り返さなければならない。 27サンプルを、本発明に従うELISAによってテストした。同時に、これらのサ ンプルをまた、Abbott社のキット(II)HCV抗体アッセイを用いてテストした。こ のキットは構造タンパク質と非構造タンパク質との両方を含む(すなわち、コア( アミノ酸：１〜150)、NS-3およびNS-4)。Abbott社のキット(II)のテスト結果と 本発明のアッセイのテスト結果との間の比較を、表１に与える。サンプルG229の 結果は、Abbott社キット(II)によれば陰性であったが、本発明のアッセイによれ ば陽性であったことに気づく。サンプルG229は、HCVについて陽性であることが 確認された。 適切な第２のタンパク質HCV非構造タンパク質の単離および作成 ７． NS5 非構造タンパク質をコードするHCV cDNAのクローニング Ｃ型肝炎ウイルスに感染した患者の血漿を集め、そして４℃にて超遠心分離し 、次いでウイルス粒子を得た。続いて、ウイルス核酸(RNA)を、ウイルス粒子か ら、グアニジンイソチオシアネートおよび酸性フェノールを使用して、抽出およ び精 製した(Chomczynskiら、Anal.Biochem．162:156-159、1987)。 以下のオリゴヌクレオチド配列： を、cDNAのクローニングにおけるプライマーとして使用した。一本鎖DNA分子を 、ランダムプライマー、逆転写酵素、およびRNAテンプレートを使用して作製し た。NS-5配列を含む二本鎖DNA分子を、Taqポリメラーゼおよびプライマー(i)お よび(ii)を使用するPCR法によって増幅した。 クローニングしたDNA分子を、同定のため配列分析に供した。得られた分子をE N-80-1と呼んだ。分子EN-80-1のDNA配列を図3Aに与え、そしてこの分子によりコ ードされるアミノ酸配列を図3Bに与える。DNA分子は、HCV非構造領域５のゲノム に由来し、そして803bpを有する(配列番号９)。分子EN-80-1のアミノ酸配列は図 3B(配列番号10)に与えられ、そして267残基を有する。 ８． HCV cDNA を含むプラスミドの構築 分子EN-80-1を制限エンドヌクレアーゼBamHIおよびEcoRIで処理して、当該HCV cDNAを含むDNAフラグメントを得た。得られたDNAフラグメントを、制限エンド ヌクレアーゼBamHIおよびEcoRIでまず切断したビヒクルプラスミド中に挿入して 、pEN-1と呼ぶ発現プラスミドを得た。HCV cDNAの発現は、T7プロモーターの制 御下にある。発現プラスミドpEN-1の構造および制限地図を、図４に与える。 ９． E.coli の形質転換 発現プラスミドpEN-1をE.coli BL21(DE3)中に形質転換し、アンピシリン寒天 プレートに拡げ、そして37℃インキュベーター中に一晩置いた。HCV非構造タン パク質を産生するE.coliコロニーを、SDS-PAGEおよびウエスタンブロッティング によりそれらの発現生成物をスクリーニングすることによって選択した。 10． NS5 非構造タンパク質の作成 形質転換したE.coliコロニーを、馴化培養培地中でインキュベートした。コロ ニーを遠心分離し、そして凍結融解サイクルおよびリゾチーム消化により溶解し た。タンパク質生成物を、溶解した細胞により遊離させ、そしてカラムクロマト グラフィーにより精製した。得られたポリペプチドは90％以上純粋であった。 このタンパク質は、ドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲルによる 電気泳動によって測定されるように、約29,000ダルトンの分子量を有する。 11． ウエスタンブロッティングによる、NS5非構造タンパク質のHCV抗体との 免疫学的反応性 精製したポリペプチドを、標準的な手順を使用するSDS-ポリアクリルアミドゲ ル電気泳動に供した。SDS-PAGEゲルを、４℃の脱イオン水で15分間洗浄し、そし て４℃のブロッティング緩衝液(0.15Mリン酸ナトリウム緩衝液、pH6.7)で20分間 洗浄した。次いで、ゲル上のポリペプチドを、ブロッティング緩衝液下、1.3Aに て１〜1.5時間、ニトロセルロースメンブレンにエレクトロブロッティングした 。メンブレンを洗浄緩衝液(PBS-Tween20、pH7.4)で洗浄し、そしてブロッキング 緩衝液(0.1M NaCl、５mM EDTA、50mM Tris(pH7.2〜7.4)、0.2％ウシ血清アルブ ミン、0.05％Nonidet p-40、１M尿素)で一晩ブロックした。 メンブレンを、Ｃ型肝炎に感染した/感染していない人の血清(40％新生ウシ血 清/Tris-HCl(pH7.4)で10×にまず希釈した)と、40℃にて２時間反応させた。反 応後、メンブレンを、洗浄緩衝液で３回洗浄した。次いで、メンブレンを、抗hI gG:HRPO結合体(下記のように調製される)と40℃にて２時間反応させた。反応後 、ペーパーを洗浄緩衝液で３回洗浄し、次いで10mlの基質溶液(0.01％ ４-クロ ロ-１-ナフトール、18％メタノール、0.04M Tris(pH7.2〜7.4)、0.1M NaClおよ び0.01％ H₂O₂)と20分間反応させた。本発明のポリペプチドは、HCV患者の血清 と反応性であったが、健常人の血清とは反応性でなかった。 12． HCV 抗体のためのELISA (Ａ) マイクロタイタープレートの処理 マイクロタイタープレートに、本発明のNS5非構造タンパク質を適切な濃度で コートし、そしてこれを、ウシ血清アルブミンを含む緩衝液でブロックした。処 理したマイクロタイタープレートを２〜８℃にて保存した。 (Ｂ) 抗hIgG:HRPO結合体の調製 精製した抗ヒト免疫グロブリンＧ(抗hIgG)を、NaIO₄を使用して西洋ワサビペ ルオキシダーゼ(HRPO)と結合させて、抗IgG:HRPO結合体を得た。この結合体をク ロマトグラフィーにより精製した。 (Ｃ) 試薬の成分 (a) 洗浄溶液：0.9％ NaClおよびThimerosalを含むリン酸緩衝液。 (b) 抗hIgG:HRPO結合体溶液：タンパク質安定化剤および防腐剤を含むTris 緩衝液に溶解した、上記のように調製された抗hIgG:HRPO結合体。 (c) サンプル希釈剤：タンパク質安定化剤および防腐剤を含むTris緩衝液。 (d) OPD基質溶液：H₂O₂を含むクエン酸−リン酸緩衝液に溶解したo-フェニ レンジアミン(OPD)。(この溶液がオレンジ色になると、この溶液が汚染され、も はや使用し得ないことを意味する。) (e) 停止溶液：２N H₂SO₄溶液。 (f) 陽性/陰性コントロール：適切な濃度でタンパク質安定化剤および防腐 剤を含むリン酸緩衝液で希釈された、Ｃ型肝炎に感染した/感染していない人の 血清サンプル。 (Ｄ) 手順: (a) 150マイクロリットル(μl)の、サンプル希釈剤で希釈(１:10)されたテ ストサンプル、および陽性/陰性コントロールを、処理したマイクロタイタープ レートのウェルに加えた。いくつかのウェルを基質ブランクとして保持した。 (b) プレートを、振盪することによって穏やかに混合し、そして37〜40℃に て１時間インキュベートした。 (c) プレートを、１ウェルあたり0.3μlの洗浄溶液で３回洗浄した。 (d) 100μlの抗hIgG:HRPO結合体溶液を各ウェルに加えた。 (e) プレートを、振盪することによって、穏やかに混合し、そして37〜40℃ にて30分間インキュベートした。 (f) プレートを５回洗浄した。 (g) 100μlのOPD基質溶液を各ウェルに加え、そしてプレートを15〜30℃に て、遮光して30分間インキュベートした。 (h) 100μlの停止溶液を各ウェルに加え、そして穏やかに混合して反応を停 止させた。 (i) 各ウェルのOD値を、分光光度計において492nmで測定した。 (Ｅ) 測定: 各ウェルのOD_492nm値から、ブランク(バックグラウンド)の読み取り値の平均 を引く。陽性コントロールの読み取り値の平均(PCx)と陰性コントロールの読み 取り値の平均(NCx)との間の差(PCx-NCx)は、0.5以上である。 カットオフ値(CO)を以下の式より計算する： テストサンプルの読み取り値がCO値未満であった場合、サンプルは陰性である と考えられた(すなわち、HCV抗体はサンプル中に検出され得なかった)。テスト サンプルの読み取り値がCO値以上であった場合、サンプルは陽性であると予想さ れた；しかし、そのサンプルについてのアッセイを２連で繰り返すことが好まし い。２連のサンプルのいずれかの読み取り値が、CO値未満であった場合、サンプ ルは陰性であると考えられる。２連のサンプルがともにCO値以上であった場合、 サンプルは陽性であると考えられた。 テストサンプルの読み取り値が、NCxより大きいがCO値より20％小さい場合、 サンプルは、不確かなサンプルとみなされるべきであり、そしてそのサンプルに ついてはアッセイを繰り返さなければならない。 18サンプルを、本発明に従うELISAによってテストした。同時に、これらのサ ンプルをまた、Abbott社のキット(I)HCV抗体アッセイ(このキットは非構造タン パク質C100-3を含む)およびAbbott社キット(II)HCV抗体アッセイ(このキットは 構造タンパク質および非構造タンパク質の両方を含む)を用いてテストした。Abb ott社のキットのテスト結果と本発明のアッセイのテスト結果との間の比較を、 表２に与える。サンプルG30およびサンプルG128の結果は、Abbott社キット(I)に よれば陰性であったが、本発明のアッセイによれば陽性であったことに気づく。 これらのサンプルは、HCVについて陽性であることが確認された。 コア様抗原−隣接タンパク質および第２のタンパク質の両方を使用する検出 13． プロセシングされていないコア抗原−エンベロープタンパク質および NS5 非構造タンパク質の両方を使用するHCVについてのELISA Ａ． コア抗原−エンベロープタンパク質およびNS5非構造タンパク質を、 ABBOTT 社HCVアッセイと比較するアッセイ Ｉ．第１のアッセイ 方法は、プロセシングされていないコア抗原−エンベロープタンパク質を、NS 5非構造タンパク質を組み合わせた(９:１)(EverNew Anti-HCV EIAとして知られ る)ことを除いて、上記のELISAと同様であった。 第１のアッセイにおいて、24サンプルを、上記の方法によりテストした。同時 に、サンプルをまた、Abbott社キット(II)によりテストした。結果を表３に与え る。このアッセイにおいて、Abbott社キット(II)の結果は、本発明の抗原を使用 するアッセイと同様であった。 II．第２のアッセイ EverNew Anti-HCV EIAに関する供血者の臨床試験報告を表４に示す： 病院：Taipei Tri-Service General Hospital サンプル供給源：血液銀行から収集 サンプルの分類：ボランティアの供血者 参照キット：Abbott社キット(II) 結果： 表４の結果は、両アッセイが同じ検出を提供したことを示す。 III．第３のアッセイ EverNew Anti-HCV EIAに関する高リスク患者の臨床試験報告を表５に示す： 病院：Taipei Veteran General Hospital サンプル供給源：臨床ウイルス部から収集 分類： 参照キット：ABBOTT HCV EIA第２世代 結果： 臨床データおよびHCV RT/PCRの結果は、HCV抗体検出に関するEverNew Anti-HC V EIAの効率が、米国FDAより認可されたABBOTT HCV EIA第２世代より良好であっ たことを示す。 Ｂ． コア様抗原−隣接タンパク質および種々の第２のタンパク質の相乗的 協同を示すアッセイ、ならびにHCVコア抗原−エンベロープタンパク質 とHCV部分コアタンパク質との比較 Ｉ．第１のアッセイ このアッセイは、上記の結果と同様なELISAの結果を示し、そしてHCVのEN-80- 2とEN-80-1との間の協同的相互作用を示す。ELISAのプロトコールは以下のとお りである： コーティング緩衝液：0.05M Tris-HCl/0.15N NaCl/６M尿素 pH：7.4±0.2。 洗浄緩衝液：0.05％Tween20を含むPBS。 ポストコーティング緩衝液：１％BSAを含むPBS緩衝液 コーティング手順：EN-80-1およびEN-80-2タンパク質を、コーティング緩衝液 中に加え(最終濃度：約1.5μg/ml)、そして室温にて30分間混合した。混合の後 、希釈したEN-80-1およびEN-80-2タンパク質を、マイクロタイターウェル中に加 え(100μl/ウェル)、そして40℃インキュベーターにおいて24時間インキュベー トした。次いで、マイクロタイターウェルを洗浄し、そしてポストコーティング 緩衝液をウェル中に加えた。次いで、マイクロタイターウェルを４℃にて一晩静 置 した。ポストコーティング後、コートされたマイクロタイターウェルを、抗HCV 抗体検出のために使用し得る。 サンプル希釈剤：40％NBBS、１％BSAおよび２％マウス血清を含む0.1M Tris-H Cl pH：7.4±0.2。 結合体：NaIO₄を使用してHRPOを結合した抗ヒトIgGモノクローナル抗体。結合 後、抗ヒトIgG:HRPO結合体を、S-200ゲル濾過により精製し、そしてサンプル希 釈剤において希釈した。 OPD錠：Beckmanから購入。 基質希釈剤：H₂O₂を含むクエン酸−リン酸緩衝液。 停止溶液：２N H₂SO₄。 陽性コントロール：サンプル希釈剤において希釈された抗HCV陽性血清。 陰性コントロール：カルシウム再添加ヒト血清(HBVマーカー、抗HIV、抗HTLVI および抗HCVについて非反応性である)。 アッセイ手順： 100μlのサンプル希釈剤を各ウェル中に加えた。 50μlのサンプル、陽性コントロールおよび陰性コントロールを適切なウェル 中に加えた。 サンプルインキュベーション：40±１℃にて30±２分間インキュベートした。 サンプル洗浄：ウェルを、洗浄緩衝液を使用して３回洗浄した。 100μlの抗ヒトIgG:HRPO結合体を各ウェル中に加えた。 結合体インキュベーション：40±１℃にて30±２分間インキュベートした。 結合体洗浄：ウェルを、洗浄緩衝液を使用して６回洗浄した。 洗浄後、100μlの基質溶液を加え(この基質溶液は、５mlの基質希釈剤中に１ 錠のOPDを溶解することによって調製された)、次いで混合物を室温にて10分間静 置させた。遮光するため、マイクロタイターウェルを黒いカバーで覆った。 100μlの停止溶液を各ウェル中に加えた。穏やかに混合。 評価：各ウェルのOD値を492nmにて分光光度計において測定した。 解釈： カットオフ値の決定：カットオフ値＝PCx×0.25＋NCx。 カットオフ値以上の吸光度は、反応が陽性であると考えられることを示した。 このことは、抗HCV抗体に関して反応性であることを意味する。カットオフ値未 満の吸光度は陰性であると考えられ、抗HCV抗体に関して非反応性であることを 意味する。 表６に表すアッセイ用のサンプル供給源は以下の通りであった： サンプル供給源Ｉ：G83、G191、G205およびG235は、GPT異常サンプルであった 。これらは抗HCV抗体陰性であり、そしてTaipei blood donation centerから収 集された。 サンプル供給源II：G614およびG615は抗HCV抗体陽性であり、そして米国から 購入された。 サンプル供給源III：8-5は抗HCV抗体陽性であり、そしてTaichung blood dona tion centerから収集された。 サンプル供給源IV：N345は患者血清であった。 これらのデータは、EN-80-2およびEN-80-1タンパク質を組み合わせた場合、抗 HCV陽性サンプルに関する492nmの吸光度が、加算的ではなく、相乗的であったこ とを示す。従って、HCVのEN-80-2タンパク質とEN-80-1タンパク質との間の協同 的相互作用が見い出された。この相乗作用の１つの利益は、例えば、サンプルN3 45て示される。このサンプルは、Abbott社キット(II)によりHCV陰性であること が見出されたが、相乗効果のため、本発明により陽性であることが見出された。 これらのデータはまた、相乗効果が、特に、初期の検出状況において、サンプル 中の抗HCV抗体についてのスクリーニングに有用であることを示す。 II．第２のアッセイ このアッセイは、上記の第１のアッセイにおいて示されたように行われ、そし て１つのウェルに、本発明のコア−エンベロープ融合タンパク質を、EN-80-4と して同定されるNS3-NS4タンパク質と組み合わせて提供することを含んだ。ELISA の結果を表７に示す。 表７のデータは、EN-80-2およびEN-80-4タンパク質を組み合わせた場合、抗HC V陽性サンプルに関する492nmの吸光度が、単なる加算効果ではなく、相乗効果を 示したことを示す。従って、HCVのEN-80-2タンパク質とEN-80-4タンパク質との 間の協同的相互作用が見い出された。 III．第３のアッセイ このアッセイは、上記の第１のアッセイにおいて示されたように行われ、そし て１つのウェルに、本発明のコア−エンベロープ融合タンパク質を、HIVエンベ ロープタンパク質と組み合わせて提供することを含んだ。ELISAの結果を表８に 示す。 表８のデータは、HCVCのEN-80-2タンパク質(すなわち、コア−エンベロープ融 合タンパク質)およびHIVエンベロープタンパク質を組み合わせた場合、抗HCV陽 性サンプルに関する492nmの吸光度が、単なる加算効果ではなく、相乗効果を示 したことを示す。従って、HCVのEN-80-2タンパク質とHIVエンベロープタンパク 質との間の協同的相互作用が見い出された。 IV．第４のアッセイ このアッセイは、上記の第１のアッセイにおいて示されたように行われ、そし て１つのウェルに、本発明のコア−エンベロープ融合タンパク質を、HTLV-Iエン ベロープタンパク質と組み合わせて提供することを含んだ。ELISAの結果を表９ に示す。 表９のデータは、HCVのEN-80-2タンパク質およびHTLV-Iエンベロープタンパク 質を組み合わせた場合、抗HCVサンプルに関する492nmの吸光度が、単なる加算効 果ではなく、相乗効果を示したことを示す。従って、HCVのEN-80-2タンパク質と HTLV-Iエンベロープタンパク質との間の協同的相互作用が見い出された。 Ｖ．第５のアッセイ このアッセイは、上記の第１のアッセイにおいて示されたように行われ、そし て１つのウェルに、本発明のコア−エンベロープ融合タンパク質を、HTLV-I pol タンパク質と組み合わせて提供することを含んだ。ELISAの結果を表10に示す。 表10のデータは、HCVのEN-80-2タンパク質およびHTLV-I polタンパク質を組み 合わせた場合、抗HCVサンプルに関する492nmの吸光度が、単なる加算効果ではな く、相乗効果を示したことを示す。従って、HCVのEN-80-2タンパク質とHTLV-I p olタンパク質との間の協同的相互作用が見い出された。 VI．第６のアッセイ 表11は、第５のアッセイ(Ｖ)のアッセイと同様であったアッセイの結果を示し 、そしてHBV抗原HBsAgおよびHBcAgとHCVのEN-80-1タンパク質との間に協同的相 互作用がなかったことを示す。 HBsAg：HBsAg陽性ヒト血漿から精製。 HBcAg：HBV cDNAフラグメントに由来。 サンプル供給源Ｉ：G30およびG49はGPT異常サンプルであった。これらは、抗H CV抗体陽性であり、そしてTaipei Blood Donation Centerから収集された。 サンプル供給源II：G612、G613、G614およびG615は、抗HCV抗体陽性であり、 そして米国から購入された。 表11のデータは、HBsAgまたはHBcAgを、EN-80-1(NS5)タンパク質とともにコー トした場合、抗HCV陽性サンプルの吸光度は、相乗的ではなかったことを示す。H BsAgとEN-80-1タンパク質、またはHBcAgとEN-80-1タンパク質との間に明らかな 協同的相互作用は見い出されなかった。 VII．第７のアッセイ 表12は、EverNew Anti-HCV EIAとAbbott社キット(II)との間での抗HCV抗体検 出の比較を示す。テストのためのサンプルを以下の供給源から得た： サンプル供給源Ｉ：G23、G26、G30、G32、G49、G58、G114、G128、G186 、G231、G250およびG262は、GPT異常サンプルであった。これらは、抗HCV抗体陽 性であり、そしてTaipei blood donation centerから収集された。 サンプル供給源II：G612、G613、G614およびG615は、抗HCV抗体陽性で あり、そして米国から購入された。 サンプル供給源III：VGH7、VGH11、VGH12、VGH13、VGH16、VGH26、VGH2 7、VGH29、VGH30、VGH32、VGH33、VGH40、VGH43、VGH46およびVGH52は、抗HCV抗 体陽性であり、そしてTaipei Veteran General Hospitalから収集された。 供給源IIIからのサンプルについての分類： VGH7 IHD結石 VGH11 NANB、散在性 VGH12 NANB、散在性 VGH13 NANB、PTH VGH16 HCC VGH26 肝硬変 VGH27 NANB、散在性 VGH29 IHD結石 VGH30 肝臓の住血吸虫症 VGH32 NANB、散在性 VGH33 肝硬変 VGH40 データなし VGH43 NANB、散在性 VGH46 HCCを伴う肝硬変 VGH52 NANB、散在性 コントロール：カルシウム再添加ヒト血清(HBV、抗HCVおよびHIVと非反応性) 。このヒト血清をまた、上記抗HCV陽性サンプルを希釈するために使用した。 テストされたキット： EverNew Anti-HCV EIA---EN-80-1抗原をコートしたマイクロタイターウェル。 EverNew Anti-HCV EIA---EN-80-2抗原をコートしたマイクロタイターウェル。 EverNew Anti-HCV EIA---EN-80-1およびEN-80-2抗原をコートしたマイクロタ イターウェル。 参照キット：Abbott社キット(II)。 結果： 表12の太字のデータは、HCVのコア抗原−エンベロープタンパク質と非構造(NS 5)領域との間の相乗作用の例を示す。太字のデータはまた、本発明が、参照のAb bott社キット(II)HCV検出キットより良好な検出を提供した例を示す。これらの データは、EN-80-1抗原およびEN-80-2抗原をコートしたマイクロタイターウェル の検出能力が、EN-80-1抗原またはEN-80-2抗原のいずれかを単独でコートしたマ イクロタイターウェルより効率的であったことを示す。さらに、サンプルG128 2 40×、G231 672×、G612 804×、VGH27 42×、VGH27 84×、VGH29 84×、VGH30 84×、VGH32 504×、VGH32 1008×、VGH33 84×、VGH33 168×、VGH40 ９×、VG H43 ９×およびVGH43 18×中の抗HCV抗体は、EverNew Anti-HCV EIA(EN-80-1お よびEN-80-2抗原をコートしたマイクロタイターウェル)を使用することによって 検出され得たが、Abbott社キット(II)を使用しては検出されなかった。 VIII．第８のアッセイ このアッセイは、上記の第１のアッセイに示されたプロトコールに従って実施 されたELISAの結果を示す。このアッセイでは、部分コアタンパク質を、HCVのEN -80-1(NS5)タンパク質と組み合わせた。この部分コアタンパク質は、アミノ酸１ 〜120からなり、そして台湾のDevelopment Center of Biotechnology(DCB)から の寄贈であった。 サンプル供給源Ｉ：G235は、GPT異常サンプルであった。これは抗HCV抗体陰性 であり、そしてTaipei blood donation centerから収集された。 サンプル供給源II：G614およびG615は、抗HCV陽性サンプルであり、そして米 国から購入された。 表13のデータは、部分コア(アミノ酸１〜120)およびEN-80-1タンパク質をとと もにコートした場合、抗HCV陽性サンプルの492nmにおける吸光度が、相乗的では なかったことを示す。HCVの部分コアタンパク質とNS5タンパク質との間に協同的 相互作用は見い出されなかった。 IX．第９のアッセイ 表14は上記の結果を確認し、そして部分コア(EN-80-5抗原、これは、SDS-ポリ アクリルアミドゲルによる電気泳動によって測定されるように、約15,000ダルト ンの分子量を有するHCVの部分コア抗原である)、コア抗原−エンベロープタンパ ク質(EN-80-2抗原)および/またはHCV非構造タンパク質(NS5；上記のEN-80-1抗 原)を使用する抗HCV抗体検出の酵素イムノアッセイ比較を示す。アッセイ用のサ ンプルは、抗HCV陽性サンプル番号N8、N81，N89、N12およびN302、ならびに抗HC V陰性サンプル番号N202、N203およびN302であった。陽性サンプルを、40％新生 ウシ血清、１％BSAおよび２％マウス血清を含む0.1M Tris-HCI(pH7.4(+/-0.2)) を用いて、25×と672×との間に希釈した。モノクローナル抗ヒトIgG:HRPO結合 体溶液を、以下の抗原または抗原の組合せと組み合わせて用いて、マイクロタイ ターウェルにおいて、サンプルをアッセイした：a.)NS5；b.)コア抗原−エンベ ロープタンパク質；c.)部分コアタンパク質；d.)NS5およびコア抗原−エンベロ ープタンパク質；e.)NS5および部分コアタンパク質；f.)コア抗原−エンベロー プタンパク質および部分コアタンパク質；ならびにg.)NS5、コア抗原−エンベロ ープタンパク質、および部分コア。 以下の結果を得た： Ｘ．第10のアッセイ 第10のアッセイは、HIV gagタンパク質を、HIV envタンパク質と組み合わせて 使用して、ヒト血清中の抗HIV-1抗体の存在を検出することに関する酵素イムノ アッセイであった。 このアッセイに使用した抗原は、以下のとおりであった：第１は、β−ガラク トシダーゼのアミノ末端フラグメント(377 a.a.)、これと融合したgag-17(a.a.1 5〜132)、続くgag p24(a.a．133〜363)、続くgag p15(a.a．364〜437)を含む組 換え融合タンパク質。このタンパク質は、92.8kDaのMw、831a.a.(スペーサーア ミノ酸を含む)を有した。そしてこれをEN-I-5抗原と呼んだ。アッセイに使用し たタンパク質を、E.coliから、90％以上の純度まで精製した。このタンパク質は グリコシル化されていなかった。第２は、β−ガラクトシダーゼのアミノ末端フ ラグメント(311 a.a.)、これと融合したenvのアミノ酸474〜863(すなわち、gp16 0)を含む組換え融合タンパク質。このタンパク質は、Mw 80.7kDa；705a.a.(スペ ーサーアミノ酸を含む)を有した。そしてこれをEN-I-6抗原と呼んだ。gp160内の エンベロープ切断部位は、Ratnerら(Aids Res.And Human Retroviruses 3(1):57 -69，1987)に従うと、アミノ酸番号491と492との間に見出される。従って、EN-I -6抗原は、gp120のカルボキシル末端およびgp41のアミノ末端の両方を含む。ア ッセイに使用したタンパク質を、E.coliから、90％以上の純度まで精製した。こ のタンパク質はグリコシル化されていなかった。 アッセイ用の陽性サンプルを、臨床的に証明されたHIV陽性のヒトから得た。 従って、これらの陽性サンプルは、証明された抗HIV-1抗体陽性血清であった。 そして、これらの陽性サンプルを、T1、T2、T3、T4、T5、T6、P1、P2およびP3と 番号付けした。コントロールサンプルをNCと番号付けした。このコントロールサ ンプルは抗HIV-1抗体陰性血清であった。マイクロタイターウェルにおいて、モ ノクローナル抗ヒトIgG:HRPO結合体溶液を、以下の抗原または抗原の組合せと組 み合わせて用いて、サンプルをアッセイした：a.)EN-I-5抗原(１μg/ml、0.1ml/ ウェル)；b.)EN-I-6抗原(１μg/ml、0.1ml/ウェル)；ならびにc.)EN-I-5およびE n-I-6(共に、１μg/ml、抗原、0.1ml/ウェル)。 以下の結果を得た： 驚くべきことに、表15は、相乗的相互作用がHIV-1のgagおよびenvタンパク質 の間に見出されることを示す。 XI．第１１のアッセイ 第11のアッセイは、HIV envタンパク質を、他の第２のタンパク質と組み合わ せて使用して、ヒト血清中の抗HIV-1抗体の存在を検出することに関する酵素イ ムノアッセイであった。 このアッセイに使用した抗原は、HIV envタンパク質(EN-I-6抗原、上記)、HCV NS5タンパク質(EN-80-1抗原、上記)およびHCVコア様抗原−隣接タンパク質(EN- 80-2抗原、上記)であった。アッセイ用の陽性サンプルは、T1、T2、T3、T4、T5 およびT6であり、抗HIV-1抗体陽性血清であった。コントロールサンプルは、N63 9、N626、N634、N632およびN637であり、抗HCVおよび抗HIV-1抗体陰性血清であ った。 マイクロタイターウェルにおいて、モノクローナル抗ヒトIgG:HRPO結合体溶液 を用いて、下記の表16に示す抗原または抗原の組合せを使用して、サンプルをア ッセイした。 これらの結果は、HIV envタンパク質が、第２のタンパク質と、上記のHCVコア −envタンパク質を用いて示された相乗相互作用と同様な相乗的相互作用をし得 ることを示す。 コア様抗原−隣接タンパク質に対するモノクローナル抗体の作製 14． HCV に対する抗体の調製 プロセシングされていないコア抗原−エンベロープタンパク質およびNS5非構 造タンパク質に対する抗体を、モノクローナル抗体を作製するための標準的な手 順に従って作製した。詳細には、BALB/cマウスを、アジュバントと混合した、実 施例２および10に記載の精製したタンパク質で免疫し、次いで、脾臓細胞をマウ スミエローマ細胞(FO細胞株)と、ポリエチレングリコールを使用して融合させ、 ハイブリドーマ細胞を形成させた。このように調製したハイブリドーマクローン により産生される抗体の力価をスクリーニングすることによって、所望のモノク ローナル抗体を産生する所望のクローンを得た。本発明の１つの実施態様におい て、ハイブリドーマクローンをEN-80-1-99と呼んだ。 免疫応答を誘導するためのHCVコア様抗原−隣接タンパク質の使用 15． HCV コア様抗原−隣接タンパク質の投与 コア抗原−エンベロープタンパク質(EN-80-2)を、６〜８週齢のICRマウスに筋 肉内投与した。最初の投与、追加免疫およびサンプリングのスケジュールは、以 下のとおりであった： 陰性コントロール群：(ID番号0-1および0-2) ０日目： 免疫なし 13日目： １回目の採血 28日目： ２回目の採血 テスト群１：(ID番号1-1、1-2、1-3、1-4、1-5および1-6) ０日目： 完全フロイントアジュバント(CFA)(Gaithersburg，MD ，USA，20877)を使用して、50μg/マウスのEN-80-2タンパク質 13日目： １回目の採血 28日目： ２回目の採血 39日目： ３回目の採血 テスト群２：(ID番号2-1、2-2、2-3、2-4、2-5および2-6) ０日目： 完全フロイントアジュバント(CFA)(GIBCO)を使用して 、50μg/マウスのEN-80-2タンパク質 13日目： 不完全フロイントアジュバント(IFA)(これもGIBCO(Ga ithersburg，MD，USA，20877)から入手)を使用して、80μg/マウスのEN -80-2タンパク質で、１回目の追加免疫 28日目： １回目の採血 39日目： ２回目の採血 テスト群３：(ID番号3-1、3-2、3-3、3-4、3-5および3-6) ０日目： 完全フロイントアジュバント(CFA)(GIBCO)を使用して 、50μg/マウスのEN-80-2タンパク質 13日目： 不完全フロイントアジュバント(IFA)(GIBCO)を使用し て、80μg/マウスのEN-80-2タンパク質で、１回目の追加免疫、 28日目： 80μg/マウスのEN-80-2タンパク質(PBS中)で、２回目 の追加免疫 39日目： １回目の採血 16． コア抗原−エンベロープタンパク質の投与により誘導される免疫応答の 検出 テスト動物において免疫応答が存在することまたは存在しないことを、上記の 酵素イムノアッセイ(EIA)と同様な２つのEIAを使用して決定した。最初のEIAに おいて、ラット抗マウス:HRPO結合体を、ラット抗マウス:HRPO結合体とともに、 コア抗原−エンベロープタンパク質(EN-80-2)をコートしたマイクロタイタープ レートのウェルに加えた。第１のEIAの結果を下記の表17に示す。 第２のEIAにおいて、ラット抗マウス:HRPO結合体を、以下の抗原または抗原の 組合せをコートしたマイクロタイタープレートのウェルに加えた：a.)NS5(EN-80 -1抗原)；b.)コア抗原−エンベロープタンパク質(EN-80-2抗原)；c.)部分コアタ ンパク質(EN-80-5抗原)；d.)NS5およびコア抗原−エンベロープタンパク質；e.) NS5および部分コアタンパク質；f.)コア抗原−エンベロープタンパク質および部 分コア；ならびにg.)NS5、コア抗原−エンベロープタンパク質、および部分コア 。第２のEIAにおいて使用したサンプルは、以下のとおりであった：0-2(50×希 釈、28日目に採取)；0-2(500×希釈、28日目に採取)；2-2(2500×希釈、28日目 に採取)；3-1(12500×希釈、39日目に採取)；3-4(2500×希釈、39日目に採取)； 3-5(2500×希釈、39日目に採取)；3-6(2500×希釈、39日目に採取)；および3-6( 12500×希釈、39日目に採取)。 第２のEIAの結果を下記の表18に示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 39/29 Ａ６１Ｋ 39/29 Ｃ０７Ｋ 14/155 Ｃ０７Ｋ 14/155 14/18 14/18 16/10 16/10 Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｈ 33/576 33/576 Ｚ // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:92） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，Ｓ Ｄ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．プラス鎖RNAウイルス由来の組成物であって： a）プラス鎖RNAウイルスの隣接タンパク質のアミノ末端部分に連結された該プ ラス鎖RNAウイルスのコア様抗原タンパク質をプロセシングされていない形態で 含む、単離されたポリペプチドであって、該隣接タンパク質の該アミノ末端部分 は、該ポリペプチドが該プラス鎖RNAウイルスのプロセシングされていないコア 様抗原−隣接タンパク質に対応するエピトープ形状を有するようなサイズである 、ポリペプチド；および b）該プラス鎖RNAウイルスの単離された非構造タンパク質 を含む、組成物。 ２．前記プラス鎖RNAウイルスが、トガウイルス科、コロナウイルス科、レトロ ウイルス科、ピコルナウイルス科、カリシウイルス科およびフラビウイルス科か らなる群から選択される、請求項１に記載の組成物。 ３．前記プラス鎖RNAウイルスが、ヒト免疫不全症ウイルス(HIV)およびヒトＴ細 胞白血病ウイルス(HTLV)からなる群から選択される、請求項２に記載の組成物。 ４．前記単離されたポリペプチドが、適切な原核宿主細胞により産生される、請 求項１に記載の組成物。 ５．前記単離されたポリペプチドが、該単離されたポリペプチドをプロセシング し得ない真核宿主細胞により産生される、請求項１に記載の組成物。 ６．プラス鎖RNAウイルスから得られる複数のポリペプチドを含む組成物を製造 する方法であって： a）第１の宿主細胞に、プラス鎖RNAウイルスの隣接タンパク質のアミノ末端部 分に連結された該プラス鎖RNAウイルスのコア様抗原タンパク質をプロセシング されていない形態で含む単離されたポリペプチドをコードする核酸分子を発現し 得る第１の発現ベクターを導入する工程であって、該隣接タンパク質の該アミノ 末端部分は、該ポリペプチドが該プラス鎖RNAウイルスのプロセシングされてい ないコア様抗原−隣接タンパク質に対応するエピトープ形状を有するようなサイ ズである、工程、 b）該発現ベクターが該ポリペプチドを産生するに適切な条件下で、該第１の 宿主細胞をインキュベートする工程、 c）該ポリペプチドを精製して、精製されたポリペプチドを提供する工程、お よび d）第２の宿主細胞に、該プラス鎖RNAウイルスの単離された非構造タンパク質 をコードする核酸分子を発現し得る第２の発現ベクターを導入する工程、 e）該核酸分子が該非構造タンパク質を産生するに適切な条件下で、該第２の 宿主細胞をインキュベートする工程、 f）該非構造タンパク質を精製して、精製された非構造タンパク質を提供する 工程、および、次いで、 g）該精製されたポリペプチドと、該精製された非構造タンパク質とを組み合 わせて、該組成物を生成する工程、 を包含する、方法。 ７．プラス鎖RNAウイルスから得られる複数のポリペプチドを含む組成物を製造 する方法であって： a）宿主細胞に、プラス鎖RNAウイルスの隣接タンパク質のアミノ末端部分に連 結された該プラス鎖RNAウイルスのコア様抗原タンパク質をプロセシングされて いない形態で含む単離されたポリペプチドをコードする第１の核酸分子を発現し 得る発現ベクターを導入する工程であって、該隣接タンパク質のアミノ末端部分 は、該ポリペプチドが該プラス鎖RNAウイルスのプロセシングされていないコア 様抗原−隣接タンパク質に対応するエピトープ形状を有するようなサイズであり 、該発現ベクターがまた該プラス鎖RNAウイルスに由来する非構造タンパク質を 含む第２のタンパク質を発現し得る、工程、 b）該発現ベクターが該ポリペプチドおよび該非構造タンパク質を産生するに 適切な条件下で、該宿主細胞をインキュベートする工程、および c）該ポリペプチドおよび該非構造タンパク質を精製して、精製されたポリペ プチドおよび精製された非構造タンパク質を提供する工程、 を包含する、方法。 ８．前記プラス鎖RNAウイルスが、トガウイルス科、コロナウイルス科、レトロ ウイルス科、ピコルナウイルス科、カリシウイルス科およびフラビウイルス科か らなる群から選択される、請求項６または７に記載の方法。 ９．固体基体に結合した、プラス鎖RNAウイルスからの単離された、実質的に完 全な、プロセシングされていないポリタンパク質を含む、組成物。 １０．固体基体に結合した、プラス鎖RNAウイルスの隣接タンパク質のアミノ末 端部分に連結された該プラス鎖RNAウイルスのコア様抗原タンパク質をプロセシ ングされていない形態で含む単離されたポリペプチドを含む組成物であって、該 隣接タンパク質の該アミノ末端部分は、該ポリペプチドが、該プラス鎖RNAウイ ルスのプロセシングされていないコア様抗原−隣接タンパク質に対応するエピト ープ形状を有するようなサイズである、組成物。 １１．前記固体基体に結合した、前記プラス鎖RNAウイルスの非構造タンパク質 をさらに含む、請求項１０に記載の組成物。 １２．サンプル中のプラス鎖RNAウイルスを検出するためのアッセイであって： a）プラス鎖RNAウイルスの隣接タンパク質のアミノ末端部分に連結された該プ ラス鎖RNAウイルスのコア様抗原タンパク質をプロセシングされていない形態で 含む、単離されたポリペプチドを提供する工程であって、該隣接タンパク質の該 アミノ末端部分は、該ポリペプチドが該プラス鎖RNAウイルスのプロセシングさ れていないコア様抗原−隣接タンパク質に対応するエピトープ形状を有するよう なサイズである、工程、 b）抗体結合ポリペプチドを提供するために、該単離されたポリペプチドを、 該サンプルと、該ポリペプチドが、該サンプル中に存在する該プラス鎖RNAウイ ルスに特異的な１またはそれ以上の抗体に結合するに適切な条件下および十分な 時間で接触させる工程、および c）該抗体結合ポリペプチドを検出し、そしてそのことから該サンプルがプラ ス鎖RNAウイルスを含むことを決定する工程 を包含する、アッセイ。 １３．a）前記工程 a)において、前記固体基体に結合した前記プラス鎖RNAウイ ルスの非構造タンパク質を提供すること、 b）前記工程 b)において、抗体結合プラス鎖RNAウイルス非構造タンパク質を 提供するために、該非構造タンパク質を、前記サンプルと、該非構造タンパク質 が、該サンプル中に存在する該プラス鎖RNAウイルスに特異的な１またはそれ以 上の抗体に結合するに適切な条件下および十分な時間で接触させること、および c）前記工程 c)において、前記抗体結合ポリペプチドまたは該抗体結合非構造 タンパク質の１つまたは両方を検出し、そしてそのことから該サンプルが該プラ ス鎖RNAウイルスを含むことを決定すること をさらに包含する、請求項１２に記載のアッセイ。 １４．サンプル中のプラス鎖RNAウイルスを検出するためのアッセイであって： a）プラス鎖RNAウイルスからの単離された、実質的に完全な、プロセシングさ れていないポリタンパク質を含む、単離されたポリペプチドを提供する工程、 b）抗体結合ポリペプチドを提供するために、該単離されたポリペプチドを、 該サンプルと、該ポリペプチドが、該サンプル中に存在する該プラス鎖RNAウイ ルスに特異的な１またはそれ以上の抗体に結合するに適切な条件下および十分な 時間で接触させる工程、および c）該抗体結合ポリペプチドを検出し、そしてそのことから該サンプルが該プ ラス鎖RNAウイルスを含むことを決定する工程 を包含する、アッセイ。 １５．前記単離されたポリペプチド、前記非構造タンパク質、または前記ポリタ ンパク質を固体基体に結合させる工程をさらに包含する、請求項１２、１３また は１４に記載のアッセイ。 １６．前記サンプルが精製されていないサンプルである、請求項１２、１３また は１４に記載のアッセイ。 １７．前記接触させる工程の前に、動物から前記サンプルを得る工程をさらに含 む、請求項１２、１３または１４に記載のアッセイ。 １８．前記動物がヒトである、請求項１７に記載のアッセイ。 １９．前記アッセイが、交叉免疫電気泳動(CIEP)アッセイ、ラジオイムノアッセ イ、放射免疫沈降法、酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)、ドットブロットアッ セイ、阻害または競合アッセイ、サンドイッチアッセイ、イムノスティック(デ ィップスティック)アッセイ、同時アッセイ、免疫クロマトグラフィーアッセイ 、免疫濾過アッセイ、ラテックスビーズ凝集アッセイ、免疫蛍光アッセイ、バイ オセンサーアッセイ、および低光検出アッセイからなる群から選択される、請求 項１２、１３または１４に記載のアッセイ。 ２０．前記アッセイがウエスタンブロットアッセイではない、請求項１２、１３ または１４に記載のアッセイ。 ２１．抗体を作製する方法であって： a）動物に、プラス鎖RNAウイルスの隣接タンパク質のアミノ末端部分に連結さ れた該プラス鎖RNAウイルスのコア様抗原タンパク質をプロセシングされていな い形態で含む、単離されたポリペプチドを投与する工程であって、該隣接タンパ ク質の該アミノ末端部分は、該ポリペプチドが該プラス鎖RNAウイルスのプロセ シングされていないコア様抗原−隣接タンパク質に対応するエピトープ形状を有 するようなサイズである、工程、および b）該ポリペプチドに対する該抗体を単離する工程 を包含する、方法。 ２２．請求項２１に記載の方法により作製された抗体。 ２３．抗体を作製する方法であって： a）動物に、プラス鎖RNAウイルスからの単離された、実質的に完全な、プロセ シングされていないポリタンパク質を含む、単離されたポリペプチドを投与する 工程、および b）該ポリタンパク質に対する該抗体を単離する工程、 を包含する、方法。 ２４．請求項２３に記載の方法により作製された抗体。 ２５．前記抗体が固体基体に結合している、請求項２２または請求項２４に記載 の抗体。 ２６．サンプル中のプラス鎖RNAウイルスを検出するためのアッセイであって： a）該サンプルを、請求項２２に記載の抗体と、該抗体が、前記プロセシング されていないプラス鎖RNAウイルスコア様抗原タンパク質に結合するに適切な条 件下および十分な時間で接触させて、結合抗体を提供する工程、および b）該結合抗体を検出し、そしてそのことから該サンプルがプラス鎖RNAウイル スを含むことを決定する工程、 を包含する、アッセイ。 ２７．a）前記工程 a)において、前記サンプルを、プラス鎖RNAウイルス非構造 タンパク質に特異的なさらなる抗体と、該さらなる抗体が、該プラス鎖RNAウイ ルス非構造タンパク質を結合するに適切な条件下および十分な時間で接触させて 、結合したさらなる抗体を提供すること、および b）前記工程 b)において、前記結合抗体または該結合したさらなる抗体の１つ または両方を検出し、そしてそのことから該サンプルがプラス鎖RNAウイルスを 含むことを決定すること をさらに包含する、請求項２６に記載のアッセイ。 ２８．サンプル中のプラス鎖RNAウイルスを検出するためのアッセイであって： a）該サンプルを、請求項２４に記載の抗体と、該抗体が、該プラス鎖RNAウイ ルスに特異的な抗原に結合するに適切な条件下および十分な時間で接触させて、 結合抗体を提供する工程、および b）該結合抗体を検出し、そしてそのことから該サンプルがプラス鎖RNAウイル スを含むことを決定する工程、 を包含する、アッセイ。 ２９．動物において免疫応答を誘発し得る組成物であって、 プラス鎖RNAウイルスの隣接タンパク質のアミノ末端部分に連結された該プラ ス鎖RNAウイルスのコア様抗原タンパク質をプロセシングされていない形態で含 む、単離されたポリペプチドを、薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤と組 み合わせて含み、該隣接タンパク質の該アミノ末端部分は、該ポリペプチドが該 プラス鎖RNAウイルスのプロセシングされていないコア様抗原−隣接タンパク質 に対応するエピトープ形状を有するようなサイズである、組成物。 ３０．前記プラス鎖RNAウイルスからの非構造タンパク質をさらに含む、請求項 ２９に記載の組成物。 ３１．動物において免疫応答を誘発し得る組成物であって、プラス鎖RNAウイル スからの単離された、実質的に完全な、プロセシングされていないポリタンパク 質を、薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤と組み合わせて含む、組成物。 ３２．前記動物がヒトである、請求項２９、３０または３１に記載の組成物。 ３３．プラス鎖RNAウイルスに対するワクチンであって、プラス鎖RNAウイルスの 隣接タンパク質のアミノ末端部分に連結された該プラス鎖RNAウイルスのコア様 抗原タンパク質をプロセシングされていない形態で含む、単離されたポリペプチ ドを、薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤と組み合わせて含み、該隣接タ ンパク質の該アミノ末端部分は、該ポリペプチドが該プラス鎖RNAウイルスのプ ロセシングされていないコア様抗原−隣接タンパク質に対応するエピトープ形状 を有するようなサイズである、ワクチン。 ３４．プラス鎖RNAウイルスに対するワクチンであって、プラス鎖RNAウイルスか らの単離された、実質的に完全な、プロセシングされていないポリタンパク質を 、薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤と組み合わせて含む、ワクチン。 ３５．前記プラス鎖RNAウイルスからの非構造タンパク質をさらに含む、請求項 ３３または３４に記載のワクチン。 ３６．プラス鎖RNAウイルスを検出するためのキットであって： a）固体基体に結合した、プラス鎖RNAウイルスの隣接タンパク質のアミノ末端 部分に連結された該プラス鎖RNAウイルスのコア様抗原タンパク質をプロセシン グされていない形態で含む、単離されたポリペプチドであって、該隣接タンパク 質の該アミノ末端部分は、該ポリペプチドが該プラス鎖RNAウイルスのプロセシ ングされていないコア様抗原−隣接タンパク質に対応するエピトープ形状を有す るようなサイズである、ポリペプチド、および b）該単離されたポリペプチドを検出するための試薬またはデバイスの１つま たは両方、 を含む、キット。 ３７．前記プラス鎖RNAウイルスからの非構造タンパク質、および該非構造タン パク質を検出するための試薬またはデバイスの１つまたは両方をさらに含む、請 求項３６に記載のキット。 ３８．プラス鎖RNAウイルスを検出するためのキットであって： a）固体基体に結合した、プラス鎖RNAウイルスからの単離された、実質的に完 全な、プロセシングされていないポリタンパク質、および b）該単離されたポリタンパク質を検出するための試薬またはデバイスの１つ または両方、 を含む、キット。 ３９．プラス鎖RNAウイルスを検出するためのキットであって： a）請求項２２に記載の抗体、および b）該抗体を検出するための試薬またはデバイスの１つまたは両方、 を含む、キット。 ４０．HCV非構造タンパク質に特異的なさらなる抗体、および該さらなる抗体を 検出するための試薬またはデバイスの１つまたは両方をさらに含む、請求項３９ に記載のキット。 ４１．プラス鎖RNAウイルスを検出するためのキットであって： a）請求項２４に記載の抗体、および b）該抗体を検出するための試薬またはデバイスの１つまたは両方、 を含む、キット。 ４２．プラス鎖RNAウイルス由来の組成物であって： a）プラス鎖RNAウイルスの隣接タンパク質に連結された該プラス鎖RNAウイル スのコア様抗原タンパク質をプロセシングされていない形態で含む、単離された ポリペプチドであって、該隣接タンパク質は、該ポリペプチドが該プラス鎖RNA ウイルスのプロセシングされていないコア様抗原−隣接タンパク質に対応するエ ピトープ形状を有するようなサイズである、ポリペプチド、および b）該単離されたポリペプチドと協同的に相互作用して、該単離されたポリペ プチドの抗原性を増大させ得る第２のタンパク質、 を含む、組成物。 ４３．複数のポリペプチドを含む組成物を製造する方法であって： a）第１の宿主細胞に、プラス鎖RNAウイルスの隣接タンパク質に連結された該 プラス鎖RNAウイルスのコア様抗原タンパク質をプロセシングされていない形態 で含む単離されたポリペプチドをコードする核酸分子を発現し得る第１の発現ベ クターを導入する工程であって、該隣接タンパク質は、該ポリペプチドが該プラ ス鎖RNAウイルスのプロセシングされていないコア様抗原−隣接タンパク質に対 応するエピトープ形状を有するようなサイズである、工程、 b）該発現ベクターが該ポリペプチドを産生するに適切な条件下で、該第１の 宿主細胞をインキュベートする工程、 c）該ポリペプチドを精製して、精製されたポリペプチドを提供する工程、お よび d）第２の宿主細胞に、該単離されたポリペプチドと協同的に作用して、該単 離されたポリペプチドの抗原性を増大させ得る第２の単離されたタンパク質をコ ードする核酸分子を発現し得る第２の発現ベクターを導入する工程、 e）該第２の宿主細胞を、該核酸分子が該第２のタンパク質を産生するに適切 な条件下でインキュベートする工程、 f）該第２のタンパク質を精製して、精製された第２のタンパク質を提供する 工程、そして、次いで、 g）該精製されたポリペプチドと該精製された第２のタンパク質を組み合わせ て、該組成物を生成する工程、 を包含する、方法。 ４４．複数のポリペプチドを含む組成物を製造する方法であって、該複数のポリ ペプチドのうち少なくとも１つがプラス鎖RNAウイルスから得られ、以下の工程 ： a）宿主細胞に、プラス鎖RNAウイルスの隣接タンパク質に連結された該プラス 鎖RNAウイルスのコア様抗原タンパク質をプロセシングされていない形態で含む 単離されたポリペプチドをコードする第１の核酸分子を発現し得る発現ベクター を導入する工程であって、該隣接タンパク質は、該ポリペプチドが該プラス鎖RN Aウイルスのプロセシングされていないコア様抗原−隣接タンパク質に対応する エピトープ形状を有するようなサイズであり、該発現ベクターがまた、該単離さ れたポリペプチドと協同的に相互作用して、該単離されたポリペプチドの抗原性 を増大させ得る第２のタンパク質を発現し得る、工程、 b）該発現ベクターが該ポリペプチドおよび該第２のタンパク質を産生するに 適切な条件下で、該宿主細胞をインキュベートする工程、および c）該ポリペプチドおよび該第２のタンパク質を精製して、精製されたポリペ プチドおよび精製された第２のタンパク質を含む組成物を提供する工程、 を包含する、方法。 ４５．前記第２のタンパク質が、プラス鎖RNAウイルスから由来する、請求項４ ３または４４に記載の方法。 ４６．固体基体に結合した、プラス鎖RNAウイルスの隣接タンパク質に連結され た該プラス鎖RNAウイルスのコア様抗原タンパク質をプロセシングされていない 形態で含む、単離されたポリペプチドを含む組成物であって、該隣接タンパク質 は、該ポリペプチドが、該プラス鎖RNAウイルスのプロセシングされていないコ ア様抗原−隣接タンパク質に対応するエピトープ形状を有するようなサイズであ る、組成物。 ４７．前記単離されたポリペプチドと協同的に相互作用して、該単離されたポリ ペプチドの抗原性を増大させ得る第２のタンパク質をさらに含む、請求項４６に 記載の組成物。 ４８．サンプル中のプラス鎖RNAウイルスを検出するためのアッセイであって、 a）プラス鎖RNAウイルスの隣接タンパク質に連結された該プラス鎖RNAウイル スのコア様抗原タンパク質をプロセシングされていない形態で含む、単離された ポリペプチドを提供する工程であって、該隣接タンパク質は、該ポリペプチドが 該プラス鎖RNAウイルスのプロセシングされていないコア様抗原−隣接タンパク 質に対応するエピトープ形状を有するようなサイズである、工程、 b）抗体結合ポリペプチドを提供するために、該単離されたポリペプチドを、 該サンプルと、該ポリペプチドが、該サンプル中に存在する該プラス鎖RNAウイ ルスに特異的な１またはそれ以上の抗体に結合するに適切な条件下および十分な 時間で接触させる工程、および c）該抗体結合ポリペプチドを検出し、そしてそのことから該サンプルが該プ ラス鎖RNAウイルスを含むことを決定する工程、 を包含する、アッセイ。 ４９．a）前記工程 a)において、前記単離されたポリペプチドと協同的に相互作 用して、該単離されたポリペプチドの抗原性を増大させ得る第２のタンパク質を 提供すること、 b）前記工程 b)において、該第２のタンパク質を、前記サンプルと、該第２の タンパク質が、該単離されたポリペプチドと協同的に相互作用するに適切な条件 下および十分な時間で接触させること、および c）前記工程 c)において、結合抗体を検出し、そしてそのことから該サンプル が前記プラス鎖RNAウイルスを含むことを決定すること をさらに包含する、請求項４８に記載のアッセイ。 ５０．前記単離されたポリペプチドまたは前記第２のタンパク質を、固体基体に 結合させる工程をさらに包含する、請求項４８または４９に記載のアッセイ。 ５１．抗体を作製する方法であって： a）動物に、プラス鎖RNAウイルスの隣接タンパク質に連結された該プラス鎖RN Aウイルスのコア様抗原タンパク質をプロセシングされていない形態で含む、単 離されたポリペプチドを投与する工程であって、該隣接タンパク質は、該ポリペ プチドが該プラス鎖RNAウイルスのプロセシングされていないコア様抗原−隣接 タンパク質に対応するエピトープ形状を有するようなサイズである、工程、およ び b）該ポリペプチドに対する該抗体を単離する工程、 を包含する、方法。 ５２．前記動物に、前記単離されたポリペプチドと協同的に相互作用して、該単 離されたポリペプチドの抗原性を増大させ得る第２のタンパク質を投与する工程 をさらに包含する、請求項５１に記載の方法。 ５３．請求項５１または５２に記載の方法により作製された抗体。 ５４．前記抗体が固体基体に結合している、請求項５１または５２に記載の方法 により作製された抗体。 ５５．サンプル中のプラス鎖RNAウイルスを検出するためのアッセイであって： a）該サンプルを、請求項５１または５２に記載の方法により作製された抗体 と、該抗体が、前記プロセシングされていないプラス鎖RNAウイルスコア様抗原 タンパク質を結合するに適切な条件下および十分な時間で接触させて、結合抗体 を提供する工程、および b）該抗体結合を検出し、そしてそのことから該サンプルがプラス鎖RNAウイル スを含むことを決定する工程 を包含する、アッセイ。 ５６．動物において免疫応答を誘発し得る組成物であって、 プラス鎖RNAウイルスの隣接タンパク質に連結された該プラス鎖RNAウイルスの コア様抗原タンパク質をプロセシングされていない形態で含む単離されたポリペ プチドを、薬学的に受容可能なキャリアまたは希釈剤と組み合わせて含み、該隣 接タンパク質は、該ポリペプチドが該プラス鎖RNAウイルスのプロセシングされ ていないコア様抗原−隣接タンパク質に対応するエピトープ形状を有するような サイズである、組成物。 ５７．前記単離されたポリペプチドと協同的に相互作用して、該単離されたポリ ペプチドの抗原性を増大させ得る第２のタンパク質をさらに含む、請求項５６に 記載の組成物。 ５８．プラス鎖RNAウイルスに対するワクチンであって、プラス鎖RNAウイルスの 隣接タンパク質に連結された該プラス鎖RNAウイルスのコア様抗原タンパク質を プロセシングされていない形態で含む単離されたポリペプチドを、薬学的に受容 可能なキャリアまたは希釈剤と組み合わせて含み、該隣接タンパク質は、該ポリ ペプチドが該プラス鎖RNAウイルスのプロセシングされていないコア様抗原−隣 接タンパク質に対応するエピトープ形状を有するようなサイズである、ワクチン 。 ５９．前記単離されたポリペプチドと協同的に相互作用して、該単離されたポリ ペプチドの抗原性を増大させ得る第２のタンパク質をさらに含む、請求項５８に 記載のワクチン。 ６０．活性な治療物質として使用するための、請求項１から５，９から１１，２ ９から３２、４２、４６、４７、５６または５７のいずれかに記載の組成物。 ６１．活性な治療物質として使用するための、請求項３３から３５、５８または ５９のいずれかに記載のワクチン。 ６２．動物におけるHCV感染を阻害、防止または処置するための医薬の製造にお いて使用するための、請求項１から５、９から１１、２９から３２、４２、４６ 、４７、５６または５７のいずれかに記載の組成物。 ６３．動物におけるHCV感染を阻害、防止または処置するための医薬の製造にお いて使用するための、請求項３３から３５、５８または５９のいずれかに記載の ワクチン。 ６４．プラス鎖RNAウイルスを検出するためのキットであって： a）固体基体に結合した、プラス鎖RNAウイルスの隣接タンパク質に連結された 該プラス鎖RNAウイルスのコア様抗原タンパク質を含む、単離されたポリペプチ ドであって、該隣接タンパク質は、該ポリペプチドが、該プラス鎖RNAウイルス のプロセシングされていないコア様抗原−隣接タンパク質に対応するエピトープ 形状を有するようなサイズである、ポリペプチド、および b）該単離されたポリペプチドを検出するための試薬またはデバイスの１つま たは両方、 を含む、キット。 ６５．前記単離されたポリペプチドと協同的に相互作用して、該単離されたポリ ペプチドの抗原性を増大させ得る第２のタンパク質、および該第２のタンパク質 を検出するための試薬またはデバイスの１つまたは両方をさらに含む、請求項６ ４に記載のキット。 ６６．プラス鎖RNAウイルスを検出するためのキットであって： a）請求項５１または５２に記載の方法により作製された抗体、および b）該抗体を検出するための試薬またはデバイスの１つまたは両方、 を含む、キット。 ６７．前記提供する工程が、少なくとも２つの単離されたポリペプチドを提供す ることであって、該少なくとも２つの単離されたポリペプチドが、Ｃ型肝炎ウイ ルス(HCV)、ヒト免疫不全症ウイルス(HIV)およびヒトＴ細胞白血病ウイルス(HTL V)からなる群から選択される異なるプラス鎖RNAウイルスから得られる、提供す ることを包含し、そして前記接触させる工程が、該単離されたポリペプチドを前 記サンプルと、該単離されたポリペプチドのそれぞれが、これに特異的な１また はそれ以上の抗体に結合するに適切な条件下および十分な時間で接触させ、それ によって１またはそれ以上の抗体結合ポリペプチドを提供することを包含する、 請求項１２、１３、１４、４８または４９に記載のアッセイ。 ６８．前記提供する工程が、少なくとも３つの単離されたポリペプチドを提供す ることであって、該少なくとも３つの単離されたポリペプチドが、Ｃ型肝炎ウイ ルス(HCV)、ヒト免疫不全症ウイルス(HIV)およびヒトＴ細胞白血病ウイルス(HTL V)からなる群から選択される異なるプラス鎖RNAウイルス由来である、提供する ことを包含し、そして前記接触させる工程が、該単離されたポリペプチドを前記 サンプルと、該単離されたポリペプチドのそれぞれが、これに特異的な１または それ以上の抗体に結合するに適切な条件下および十分な時間で接触させ、それに よって１またはそれ以上の抗体結合ポリペプチドを提供することを包含する、請 求項１２、１３、１４、４８または４９に記載のアッセイ。 ６９．前記キットが、a）Ｃ型肝炎ウイルス(HCV)、ヒト免疫不全症ウイルス(HIV )およびヒトＴ細胞白血病ウイルス(HTLV)からなる群から選択される少なくとも ２つの異なるプラス鎖RNAウイルスからの少なくとも２つの前記単離されたポリ ペプチド、およびb）該少なくとも２つの単離されたポリペプチドを検出するた めの手段を含む、請求項３６、３７、６４または６５に記載のキット。 ７０．前記キットが、a）Ｃ型肝炎ウイルス(HCV)、ヒト免疫不全症ウイルス(HIV )およびヒトＴ細胞白血病ウイルス(HTLV)のそれぞれからの少なくとも３つの前 記単離されたポリペプチド、およびb）該少なくとも３つの単離されたポリペプ チドを検出するための手段を含む、請求項３６、３７、６４または６５に記載の キット。 ７１．前記キットが、a）Ｃ型肝炎ウイルス(HCV)、ヒト免疫不全症ウイルス(HIV )およびヒトＴ細胞白血病ウイルス(HTLV)からなる群から選択される少なくとも ２つの異なるプラス鎖RNAウイルスからの少なくとも２つの前記単離されたポリ タンパク質、およびb）該少なくとも２つの単離されたポリタンパク質を検出す るための手段を含む、請求項３８に記載のキット。 ７２．前記キットが、a）Ｃ型肝炎ウイルス(HCV)、ヒト免疫不全症ウイルス(HIV )およびヒトＴ細胞白血病ウイルス(HTLV)のそれぞれからの少なくとも３つの前 記単離されたポリタンパク質、およびb）該少なくとも３つの単離されたポリタ ンパク質を検出するための手段を含む、請求項３８に記載のキット。