JPH01165598A

JPH01165598A - 合成ｈｉｖペプチドおよびそれを用いたｈｉｖ抗体の検出法

Info

Publication number: JPH01165598A
Application number: JP63295886A
Authority: JP
Inventors: Virender K Sarin; ビレンダー・ケイ・セイライン; Kevin M Knigge; ケビン　エム　ニッジ
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1987-11-24
Filing date: 1988-11-22
Publication date: 1989-06-29
Also published as: DE3854550T2; ATE128716T1; AU621317B2; EP0317804A2; AU2567888A; KR890008565A; ES2080047T3; CA1340157C; DE3854550D1; EP0317804A3; EP0317804B1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】（産業上の利用分野）本発明は、合成ペプチド、それを用いたＨＩＶ抗体の検
出法およびＨＩＶワクチンに関する。

（従来の技術および発明が解決しようとする課題）ヒト
免疫不全ウィルス（ｈｕｍａｎ　ｉｍｍｕｎｏｄｅｆｉ
ｃｉｅｎｃｙ　ｖｉｒｕｓ　：　ＨＩ　Ｖ）と称される
レトロウィルスは、現在、後天性免疫不全症候群（ＡＩ
ＤＳ）の病因物質として知られている。このウィルスの
種々の単離物は、リンパ節疾患関連ウィルス（ＬＡＶ）
、向ヒトＴリンパ球性ウィルス■型（ＨＴＬＶ−ＩＩＩ
）またはＡＩＤＳ関連レトロウィルス（ＡＲＶ）と称さ
れている。ＨＩＶの移行の仕方は完全には理解されてい
ないが、ＨＩＶの最も一般的な移行の仕方は、性的接触
、汚染された静脈内器具の使用および汚染された血液製
剤の軸性によるものである。

ＨＩＶを試験することは、該ウィルスへの接触の有無を
診断する上において、とりわけ血液製剤を該ウィルスに
よる汚染から防ぐために極めて重要になってきている。

ＨＩＶへの接触の有無を検出するために、ＨＩＶ患者や
ＡＩＤＳに感染のおそれのある個人の血清、血漿、だ液
または他の生物学的試料中のＨＩＶ抗体（抗ＨＩＶ）レ
ベルを測定する。第一世代のＨＩＶ抗体試験においては
、ＨＩＶ感染細胞溶解物からの不活性化した粗製または
精製ウィルスタンパク質を固相をコーティングするのに
用いる。

細胞溶解物でコーティングした固相は、抗ＨＩＶを含有
していると思われる生物学的試料とともにインキュベー
トし、洗浄し、ついで検出可能な標識を付加した抗ヒト
抗体を固相に加える。標識（酵素、放射性同位体または
蛍光分子であってよい）を測定して試料中のＨｒＶ抗体
の存在を決定する。

ＨＩＶ抗原源としてウィルス溶解物を用いることに伴う
問題は、ＨＩＶウィルスが感染性の性質を有しているｌ
；め該ウィルスを製造することに潜在的な危険が伴うこ
とである。またＨＩＶウィルス溶解物は不純物を含んで
いるかもしれないので、これがＨＩＶ抗体の試験を妨害
する。従って、安全で非感染性の別のＨＩＶ抗原源が必
要となってくる。ざらにＨＩＶ抗原が充分に明確にされ
、試験しようとする試料中に含まれている他の非ＨＩＶ
抗体や他の妨害物質と交差反応を起こさないことも必要
である。

種々の研究により、無症候性のＡＩＤＳ関連合併症（ｃ
ｏｍｐｌｅｘ）およびＡＩＤＳ患者のヒトだ液にｇｐ１
６０およびｇｐ１２０に対するＨＩＶ抗体が見出だされ
ることが示されている［アーチボールド（ａｒｃｈ　ｉ
　ｂａ　ｌｄ）らのＢ　１ｏｏｃＬ　　６ヱ：８３１−
８３４（１９８６）参照］。これらのだ液抗体は、主と
してＩｇＡ免疫応答を示す。

ＨＩＶの種々の単離物がクローン化されており、その遺
伝的構造が確立されている。ＨＩＶゲノムの種々の領域
のヌクレオチドとそれから導き出されたアミノ酸配列が
出版されている。しかしながら、これらの出版された配
列からは、ペプチドとして合成されたときにＨＩＶ分子
のどの領域が天然に存在するＨＩＶタンパク質の対応す
る領域と同様の抗原性および免疫原性を有するかについ
ての情報は得られない。

ＨＩＶ遺伝子のエンベロープ（ｅｎｖ）領域は、種々の
潜在する糖鎖部位を有しながら約８５６残基の前駆体タ
ンパク質をコードしている。前駆体糖タンパク質は分子
量１６０，０００ダルトン（ｇｐ　１６０）に対応し、
−Ｌｙｓ　Ａｒｇ一部位でプロッセシングされて４８０
アミノ酸のＮ末端タンパクｆｆ（ｇｐ１２０）および３
４５アミノ酸タンパク質（ｇｐ４１）を生成する。酵素
結合抗体免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）によると同様
に放射性免疫沈降に続きポリアクリルアミドゲル電気泳
動（ＲＩＰ−ＰＡＧＥ）を行うことによって、ＡＩＤＳ
およびＡＩＤＳ関連合併症（ＡＲＣ）患者から採取した
血清はＨＩＶのｅｎｖおよびｇａｇ遺伝子コードタンパ
ク質と反応することが示されている。これらのタンパク
質にはｇｐ１６０、ｇｐ１２０、ｇｐ４１．ｐ５５、ｐ
３６、ｐ２４、ｐ１８およびｐ１２が含まれるが、これ
らに限られるものではない。

バーマン（Ｂ　ｅｒｍａｎ）らのヨーロッパ特許出願第
２２７．１６９号明細書には、ＡＩＤＳ関連ウィルスタ
ンパク質のアミノ酸配列を擬態する（ｍｉｍｉｃｋｉｎ
ｇ）幾つかのポリペプチドが開示されている。免疫化学
的試薬は、下記合成ポリペプチド配列の２種またはそれ
以上を組み合わせることにより得られる。

すなわちＨＩＶのｇａｇ抗原の少なくとも１個の抗原決
定基を擬態するポリペプチド配列、ＨＩＶの糖タンパク
質ｇｐ１２０の少なくとも１個の抗原決定基を擬態する
ポリペプチド配列、およびＨＩＶの糖タンパク質ｇｐ４
１の少なくとも１個の抗原決定基を擬態するポリペプチ
ド配列。バーマンらは、これらの試薬は天然に存在する
ＨＩＶタンパク質を含んでいてもよいが、開示されたポ
リペプチド配列はＨＩＶの天然に存在するｇａｇ、　ｇ
ｐｌ　２０およびｇｐ４１タンパク質を実質的に含んで
いてはならないと述べている。バーマンらの開示は、だ
液抗体を検出するのにどのＨＩＶ抗原もしくはエピトー
プが重要であるかについては何等示すところかない。

ウオングースタール（Ｗｏｎｇ−Ｓ　ｔａａｌ）らの米
国特許出願第７７９，４３１号明細書には、ａｐ１２０
からの１５アミノ酸の長さのペプチドが記載されている
。

このペプチドは、モノクローナル抗体産生およびＥＬ　
Ｉ　ＳＡアッセイにおける免疫原として有用である。

ポーカ−（ｐ　ａｌｋｅｒ）らのＰｒｏｃ、ＮａＬ’１
．Ａｃａｄ、Ｓｃｉ、ＵｓＡ、８４：２４７９〜２４８
３（１９８７）には、１５アミノ酸を含有するｇｐ１２
０のＣ０ＯＨ末端領域に由来する合成ペプチドが開示さ
れている。この比較的短いペプチドは、ＨＩＶ陽性患者
の抗体の反応性を評価するため、およびｇｐ１２０のＣ
０ＯＨ末端に対するヒト抗体応答の官能的　゛重要性を
評価するために用いられた。

コーサンド（Ｃｏｒｓａｎｄ）の米国特許第４．６２９
．７８３号明細書には、ｇｐ１２０、ｇｐ４１およびｐ
２４の短い領域の擬態配列を有するペプチドが開示され
ている。これらのペプチドは血液スクリーニング手順に
おいて抗ＨＩＶの検出に用いることができるものである
が、ウィルスゲノムのｇａｇまたはｅｎｖ領域によりコ
ードされるタンパク質を擬態するものである。コーサン
ドにより開示されたペプチドは２５未満のアミノ酸を含
有するのが好ましい。

（課題を解決するための手段）本発明者らは、生物学的試料中のＨＩＶ抗体を検出する
のに用いることができ、ＨＩＶ抗体を産生ずるのに用い
ることができ、またワクチンのために用いることができ
る新規なｇｐ１６０ペプチドを開発した。これらのペプ
チドはｇｐ１６０またはそのｇｐ１２０断片の領域を実
質的に擬態するものであり、非感染性で純粋なＨＩＶ抗
原源を提供するものである。

まず塩基対（ｂｐ）７２２１〜７３０５の領域でコード
されるｇｐ１２０のアミノ酸４９０〜５１７に対応する
短いペプチド（以下、ペプチド■という）ｃサンチェス
ーペスカドール（Ｓ　ａｎｃｈｅｚ　−Ｐ　ｅｓｃａｄ
。

ｒ）らの５ｃｉｅｎｃｅｓ　　２２ヱ：４８４〜４９２
（１９８５）参照］を免疫原性／抗原性を試験するため
に合成した。このペプチドは下記式（Ｉ）で示されるア
ミノ酸配列を有する。

Ｙ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−１１ｅ
−Ｌｙｓ−＋１ｅ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−
１１ｅ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−（
Ｉ　）Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｇｌ
ｎ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｘ１式中、Ｙは−Ｈ１アミノ酸、ペプチド、タンパク質ま
たはリンカ−１Ｘは−ＯＨ，−ＮＨ，、−ＮＲ，Ｒ，（
式中、Ｒ３およびＲ２はアルキル基を表す）、ペプチド
、タンパク質またはリンカ−を表わす］下記式（Ｉｆ）で示されるペプチド（以下、ペプチド■
という）のアミノ酸配列は、ｂｐ７１９７〜７３０５の
領域でコードされるａｐ１２０のアミノ酸４８２〜５１
７に対応する（サンチェスーパスヵドールの上掲文献参
照）。

Ｙ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ａｒｇ−５ｅｒ
−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−
Ｖａｌ−１１ｅ−Ｌｙｓ−１１ｅ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−（
ＩＩ）Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｉ　１ｅ−Ａｌａ−Ｐｒｏ−Ｔ
ｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒｇ−Ｖａ
ｌ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ
−Ｘ（式中、ＸおよびＹは前記と同じ）下記式（ＩＩＩ）で示されるペプチド（以下、ペプチド
■という）は、ｂｐ７１６５〜７３３５の領域をコード
するａｐ１２０のアミノ酸４５５〜５１１に対応する［
ミユージツク（Ｍｕｅｓｉｎｇ）らのＮａｔｕｒｅ。

ｌ土３：４５０〜４５８（１９８５）参照］。

Ｙ−Ｔｈｒ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ
−Ｓｅｒ−Ａｓｎ−Ｇｌｕ−５ｅｒ−Ｇｌｕ−１１ｅ−
Ｐｈｅ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａ
ｓｐ−Ｍｅｔ−Ａｒｇ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｔｒｐ−Ａｒ
ｇ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ−（ＩＩＩ）Ｌ６１−Ｔｙｒ−Ｌｙ
５−４ｙ「−４，ｙｓ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−１１
ｅ−Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ
−Ｐｒｏ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−
Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｇｌｎ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｌ
ｙｓ−Ａｒｇ−Ｘ（式中、ＸおよびＹは前記と同じ）下記式（ＩＶ）で示されるペプチド（以下、ペプチド■
という）はｇｐ１２０のＣ末端からｇｐ４１のＮ末端に
わたっており、ｂｐ７２４０〜７３８９の領域をコード
するアミノ酸４８０〜５２９のアミノ酸配列を有する（
ミユージツクらの上掲文献参照）。

Ｙ−Ａｒｇ−３ｅｒ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ
−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｌｙｓ−１１ｅ−
Ｇｌｕ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｐ
ｒｏ−Ｔｈｒ−Ｌｙｓ−Ａｌａ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｒ
ｇ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−（ＩＶ）ＧｉｎｌＡｒｇ−Ｇｌｕ
−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−１１ｅ−
Ｇ　１ｙ−Ａ　１ａ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇ　Ｌ
ｙ−Ｐｈｅ−Ｌｅｕ−Ｇ　１ｙ−Ａｌａ−Ａｌａ−Ｇｌ
ｙ−Ｓｅｒ−Ｔｈｒ−Ｘ（式中、ＸおよびＹは前記と同
じ）（発明の構成および効果）これらのペプチドは単独または２以上を組み合わせてＨ
ＩＶ抗原源として用いることができるし、−層大きな担
体分子と結合させてもよい。ペプチドＩ〜■のｌまたは
それ以上を他の抗原およびエピトープ、とりわけｐ２４
やｇｐ４１のような他のＨＩ　Ｖ抗原と組合わせて用い
るのが好ましい。

本発明のペプチドは、溶液中の合成または段階的もしく
は断片結合手順を用いた固相ペプチド法を含む多くの方
法により合成することができる。

本発明のペプチドはまた酵素的に合成することもできる
し、組換えＤＮＡ法により融合タンパク質まにはペプチ
ドとすることもできる。これらのペプチドをコードして
いる遺伝子の領域を組換えＤＮＡ技術により合成、クロ
ーニングおよび発現させることもでき、この配列をサブ
クローニングし大腸菌、酵母または哺乳動物細胞などの
適当な発現系で発現させることもできる。本発明のペプ
チドは、担体分子を用いるかまたは用いずにＨＩＶの他
のエピトープもしくは抗原と組合わせることができ、組
換えＤＮＡ法により発現し、または合成法により融合タ
ンパク質とすることができる。

本発明のペプチドの置換類似体、欠失類似体または付加
類似体も当業者によく知られた方法により製造すること
ができる。

本明細書に記載する種々の実施例に対応するペプチドは
、単独またはそれらの組合わせで、または関連する他の
抗原と組合わせて用いることができる。たとえば、これ
ら種々のペプチドは、スペーサー分子を用いるかまたは
用いないで、互いに物理的に混合または化学的に結合さ
せることができる。これらペプチドは担体ペプチド、タ
ンパク質または支持体に化学的または物理的に結合させ
ることもできる。これらペプチドは、ｇｐ４１　、ｇｐ
１２０、ｐ５５、ｐ２４または他のものなどの他の）１
１　Ｖ抗原またはエピトープとともに用いることができ
る。これらのペプチド、とりわけペプチド■は、チログ
ロブリンやウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）のような担体
分子に結合させ、単独で抗原としてまたは他のエピトー
プもしくは抗原と組合わせて用いることができる。

つぎに本発明を実施例に基づいてさらに詳しく説明する
が、本発明はこれらに限られるものではない。なお以下
の実施例は、本発明のペプチドの合成法、および純粋で
充分に明確にされた非感染性のＨＩＶ抗原として該ペプ
チドを用いるだめの方法を記載したものである。

実施例１本実施例では、カルボキシ末端から出発した段階的固相
合成法により樹脂支持体上でペプチド■を合成する。バ
ラニー（Ｂａｒａｎｙ）およびメリフィールド（Ｍｅｒ
ｒｉｆ　１ｅｌｄ）のＴｈｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ、　２
　：　１９８４、グロス（Ｇｒｏｓｓ、Ｅ、）およびマ
イネホーファ−（Ｍｅｉｎｅｈｏｆｅｒ、　Ｊ　、）編
、アカデミツクプレス、ニューヨーク、Ｎ、Ｙ、（１９
８０）に記載の手順などを本実施例の合成に用いること
ができる。Ｂｏｃ−Ｌ　−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）　−０ＣＨ
２−Ｐａｍ樹脂を、アプライドバイオシステムズシンセ
サイザー（Ａｐｐｌｉｅｄ　　Ｂ　ｉｏｓｙｓｔｅｍｓ
　　Ｓ　ｙｎｔｈｅｓｉｚｅｒ）、モデル４３０Ａ［ア
プライド・バイオシステムズ（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏ
ｓｙｓｔｅｍｓ　）、７オスターシテイー、カリフォル
ニアから入手可］の反応容器に移した。保護アミノ酸を
予備成形対称無水物化学（ｐｒｅｆｏｒｍｅｄ　ｓｙｍ
ｍｅｔｒｉｃ　ａｎｈｙｄｒｉｄｅ　ｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ）により段階的方法で樹脂支持体にカップリングした
。ただしアルギニン、アスパラギンおよびグルタミンの
付加については、ケーニッヒ（Ｋｏｎｉｇ）およびガイ
ガー（Ｇｅｉｇｅｒ）のＣｈｅａ＋、Ｂｅｒ、、１０３
ニア８８〜７９８（１９７０）に記載のＤＣＣ／ＨＯＢ
Ｔ手順を用いた。アミノ末端はすべてｔ−ブチロキシカ
ルボニル基で保護しくｔ／ＢＯＣ結合）、種々のアミノ
酸残基の側鎖はＡｒｇ：Ｔｏｓ％Ｌｙｓ：２−ＣＩＺ％
Ｇｌｕ：０ＢＺＩ。

Ｔｈｒ：Ｂｚｌ、Ｔｙｒ：２−ＢｒＺで保護した。

完全に保護したペプチド−・樹脂（０，７９）を塩化メ
チレン（ＣＨｚＣｌｘ）中で５分間膨潤させた。Ｎα−
Ｂｏａ保護基の除去は、６０％トリフルオロ酢酸（ＴＦ
Ａ／ＣＨ，ＣＩ、）で脱保護し、ＣＨ，ＣＩ、で洗浄し
、１０％Ｎ、Ｎ−シイイソプロピルエチルアミン（Ｄ　
Ｉ　ＥＡ／ＣＨＩＣ１りにより中和し、ついで最後にＣ
Ｈ，ＣＩ、で再び洗浄することにより行った。樹脂を真
空下で乾燥させた。こうして得られたペプチド樹脂を、
ｐ−クレゾール（ｌ　ｍ＜２）を加えたフッ化水素酸（
ＨＦ　Ｘ　９　ｍＱ）でＯ′Ｃにて６０分間処理した。

ＨＦを真空下、０°Ｃにて蒸留して除いた。開裂させた
遊離のペプチドと樹脂をジエチルエーテルの１５＋ｉα
アリコートで３回洗浄し、ペプチドを４０％酢酸水溶液
（１５１１１１２）で３回抽出した。水性抽出物を集め
、ジエチルエーテルの１０ｍＱアリコートで３回洗浄し
、その後水層を凍結乾燥して粗製のペプチドを得て精製
に供した。ポリペプチドの精製は、溶媒系として０．１
％ＴＦＡ／水（Ａ）および１００％アセトニトリル（Ｂ
）の勾配を用い、分析物［Ｖｙｄａｃ　−２１４−ＴＰ
　５４、ビダック・セパレーション・グループ（Ｖｙｄ
ａｃ　５ｅｐａｒａｉ　ｉｏｎ　Ｇ　ｒｏｕｐ）、ヘス
ペリア、カリフォルニア］についてはｌ　ｍ０１分の流
速、セミプレパラティブ（Ｖｙｄａｃ　−２１４−Ｔ　
Ｐ　５１０）カラムについては３　ｍ０１分の流速での
０４カラム上での逆相高速液体クロマトグラフィー（Ｈ
ＰＬＣ）により行った。

用いた勾配は以下のようであった。

１分　　　　　２０分２０％（Ｂ）　→　２０％（Ｂ）　→　２５％（Ｂ）１
分 →　２０％（Ｂ）ＨＰＬＣカラムからのポリペプチドの溶出は、２２２ｎ
ｍおよび２８０ｎｍでモニターした。ペプチドの組成に
ついては、真空下、６Ｎ塩酸（ＨＣ１）１０．３％フェ
ノール中、１５０℃で２時間加水分解し、引き続き５Ｉ
ＣＡ７０００Ａインテグレーシヨン（ｉｎｔｅｇｒａｔ
ｉｏｎ）を備えたベックマン６３００アミノ酸分析器［
ベックマン・インスッルメンツ（Ｂ　ｅｃｋｍｅｎ　Ｉ
　ｎｓむｒｕｍｅｎｔｓ）、ラブレア、カリフォルニア
より入手可１で分析して確認した。

ペプチド■、■および■についても上記と同様の方法で
合成した。メチオニンはスルホキシドの形で用い、トリ
プトファンはホルミル基（ＣＨＯ）で保護し、Ｓｅｒは
Ｂｚｌで、Ａｓｐは０ＢＺＬで保護した。メチオニンス
ルホキシドおよびホルミルド　　リプトファンを含むペ
プチド−樹脂については、タム（Ｔ　ａｍ）らのＪ　、
Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、、　ｌ　０５　：６４２２〜
６４５５（１９８３）に記載のような「低高（ｌｏｗ　
ｈｉｇｈ）ＪＨＦ手順を用いてペプチドを脱保護し樹脂
から開裂させた。所望のペプチドはまた、脱保護および
開裂のあいだに適当なスカベンジャーを用いることによ
りい保護されていないメチオニンおよびトリプトファン
を用いても合成することができる。ペプチドの精製は、
すべて０．１％ＴＦＡ水溶液および１００％アセトニト
リル勾配系を用いた逆相Ｃ，ＨＰＬＣにより行った。

ペプチドＩ、ｎ、■および■は、リウ（Ｌｉｕ）らのＢ
　ｉｏｃｈｅｍ、　、上８：６９０〜６９７（１９７９
）およびキタガワ（Ｋｉｔａｇａｗａ）らのＪ　、　Ｂ
　ｉｏｃｈｅｍ、、　９２　：５８５〜５９０（１９８
２）に記載のように水溶性のカルボジイミドまたはマレ
イミド−ベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（
ＭＢＳ）を用い、ウシ血清アルブミン（Ｂ　Ｓ　Ａ＞、
キーホールリンペットヘモシアニン（ＫＬＨ）またはチ
ログロブリンのような一層大きな担体分子に結合させて
もよい。

これらの結合体は、ついで配列特異的抗体を生成させる
ために用いることができる。

実施例２本実施例では、実施例１に記載のペプチドを用い、生物
学的試料中のＨＩＶ抗体を検出する方法を説明する。本
実施例に記載の方法により試験することのできる生物学
的試料には、血清や血漿のような血液調製物、尿および
だ液が含まれる。

本発明のペプチドは、とりわけ他のＨＩＶ抗原と組合わ
せたときに、ＨＩＶに対するＩｇＡ、ＩｇＧまたはＩｇ
Ｍ抗体の存在についてのだ液試験に特に有用である。

ペプチドＩと■について、生物学的試料中のＨＩＶ抗体
の検出方法におけるＨＩＶ抗原源としての有用性を決定
するために、組換えＤＮＡ由来ＨＩ　Ｖｐ２４　オよび
ＨＩＶｇｐ４１を用い比較して試験した。

以下のようにして５０ｍＭ炭酸ナトリウム（ｐＨ９，５
）中で４つの抗原溶液を調製した。すなわち、ペプチド
Ｉ　（１０７７ｙ／ｍＱ）、ペプチドＩＩＩ（６，２５
ｐ　ｇ／　ｍ（１）、組換えＤＮＡ由来ＨＩＶｐ２４タ
ンパク質（１，６４μｇ／講Ｑ）および組換えＤＮＡ由
来ＨＩＶｇｐ４１タンパク質（１２５−ｔニット／ｍＱ
）。ｐ２４およびｇｐ４１タンパク質は、本発明と共願
にかかる米国特許出願第０２０．２８７号明細書（１９
８７年２月２７日出願）に記載の方法により調製した。

各抗原溶液（１００μ＋２）を、ポリスチレンマイクロ
タイタープレート［ダイナチク・ラボラトリーズ（Ｄｙ
ｎａＬｅｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、アレクサ
ンドリア、バージニアより入手可Ｊのウェルに加えた。

本実施例に記載の方法に使用できる他の同相としては、
ビーズ、ペーパーストリップ、微細粒子、ニトロセルロ
ース膜、ポリスチレンチューブ、または他の適当なプラ
スチックまたはペーパー支持体が挙げられる。溶液およ
びプレートを室温で１時間インキュベートし、その後、
溶液を除いてプレートを蒸留水で５回洗浄した。リン酸
バッファー食塩水（ＰＢＳ）中の１０％ウシ血清アルブ
ミン、３％ショ糖および０．０５％ツイーン２０からな
るオーバーコート溶液（２５０μＱ）をウェルに加えた
。３０分インキュベートした後、オーバーコート溶液を
除きプレートを蒸留水で５回洗浄した。

コーティングプレートを引き続き使用するときまで２〜
８°Ｃで貯蔵した。

コーティングプレートは、抗ＨＩＶ抗体の検出のための
アッセイに以下のようにして用いた。すなわち、リン酸
バッファー食塩水（０，０１Ｍ　　ＫＨ２ＰＯ４，０，
１５Ｍ　　ＮａＣ１，ｐＨ７，２）中の１０％ウシ血清
アルブミンおよび２％ツイーン２０からなる希釈液中で
ｌ　：８００に希釈した血清試料または１：１０に希釈
しただ液試料（１００μＩ２）をコーティングマイクロ
タイタープレートのウェルに加えた。室温で１時間イン
キュベートした後、試料を除きウェルを蒸留水で５回洗
浄した。抗体−酵素結合体（アルカリホスファターゼ：
ヤギ抗ヒト１８Ｇまたはアルカリホスファターゼ：ヤギ
抗ヒトＩｇＡＸＩ　ＯＯμＱ）をウェルに加えた。抗体
−酵素結合体はまた、ＩｇＭ抗体を検出するのであれば
ＩｇＭ抗体結合体であってもよい。抗体−酵素結合体は
、エングポール（Ｅｎｇｖａｌｌ）らのＢｉｏｃｈｉｍ
、　Ｂ　１ｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ、　２５ユニ４２７〜
４３４（１９７１）；コーン（Ｋ　ｏｒｎ）らのＪ　、
Ｍｏ１．Ｂ　ｉｏｌ、、　６５　：５２５〜５２９（１
９７２）；およびアブラメアズ（Ａｖｒａｍｅａｓ）お
よびターニング（Ｔ　ｅｒｎｙｎｋ）のＩ　ｍｍｕｎｏ
ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　　６　：５３〜６６（１９６９
）に記載に従って調製した。室温でさらに１時間インキ
ュベートした後、結合体を除きウェルを蒸留水で５回洗
浄シタ。ｐ−ニトロフェニルホスフェート基質溶液（１
００μＱ）をウェルに加え、室温で３０分間インキュベ
ートした。２Ｎ　Ｎａ０Ｈ（１００μＱ）をウェルに加
えて反応を停止させた。ウェルの吸光値を４０５ｎｍで
読み取った。０．２００　０．Ｄ。

またはそれ以上のカットオフ値で陽性の結果が測定され
た。カットオフ値は、１００の陰性および５０の陽性の
一対の血清およびだ液試料から得られた結果に基づいて
確立した。結果を第１表、第２表および第３表に示す。

第１表〜第３表の結果は、血清陽性と確認された試料は
すべてｇｐ４１．ペプチドＩおよびペプチド■に対する
血清１ｇＧを含んでいるが、ｐ２４に対する血清反応性
は変化したことを示している。

だ液試料においては、血清陽性試料における１ｇ０反応
性は試験したすべての抗原について変化した。だ液１ｇ
Ａ反応性はｐ２４およびｇｐ４１については変化したが
、すべての血清陽性試料はペプチドＩおよび■に対する
だ液１ｇＡを含んでいた。

陰性が確認された試料からは試験したすべての抗原につ
いて血清についてもだ液についても反応性が検出されな
かった。一般にペプチド■の反応性はペプチド■の反応
性よりも大きかった。

これらの結果は、ペプチドＩおよびペプチド■がＨＩＶ
に対する抗体と特異的に反応することを示している。こ
れらの結果はさらに、だ液試料中でＨＩＶに対する抗体
を試験するときにはｇｐ１２０の少なくとも一部が存在
していなければならないことを示している。

第１表ＩＤＳにかかる危険性の高いもの第２表ＴＤＳにかかる危険性の高いもの第３表ＩＤＳにかかる危険性の高いもの実施例３本実施例では、ペプチド■、組換えＤＮＡ由来ｐ２４お
よび組換えＤＮＡ由来ｇｐ４１を用い、ＨＩＶ抗体を検
出するための微細粒子アッセイを説明する。アミノ修飾
微細粒子［固形分２．５％、平均粒径０．４５ミクロン
、ポリサイエンス（Ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ）、ウオリ
ントン、ペンシルベニアよす市販］（１００μＱ）を、
リン酸バッファー食塩水（ＰＢＳＸ１ｍ１２）およびス
ルホ−ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスク
シンイミド（Ｓｕｌｆｏ−ＭＢＳＸＰＢＳ中にｌ　、　
Ｏｍｇ／　＋ｎＱＸ　３　、０１１１１２）に加えた。

溶液を室温で１時間撹拌し、その後、微細粒子を５００
０　Ｘｙのスピードの遠心分離により単離し、ＰＢＳで
２回洗浄し、Ｐ　Ｂ　Ｓ　（１ｍ（１’）中に再び懸濁
した。この再懸濁させた微細粒子にペプチド■の溶液（
蒸留水中にｌ　ｍｙ／　ｍＱＸ　３０　、ｕ　（２）を
加え、室温で２時間撹拌した。微細粒子を５０００Ｘｇ
のスピードの遠心分離により単離し、０．０５％ツイー
ン２０を含有するＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳ中に再懸
濁させて０．１２５％溶液を得た。

ＰＢＳ中に再懸濁させた後、引き続き抗ＨＩＶのアッセ
イにｐ２４およびｇｐ４１コーティング微細粒子と組み
合わせて用いるときまで２〜８℃で貯蔵した。

ｐ２４コーティング微細粒子およびｇｐ４１コーティン
グ微細粒子の微細粒子溶液を別に調製するｔ；め、アミ
ノ修飾微細粒子（固形分２．５％、平均粒径３．０ミク
ロン、ポリサイエンスより市販）（１００μｍ２）を、
各抗原に対し５０ｍＭＮ−メチルモルホリン（ｐＨ７，
５Ｘ５００μＱ）および２−イミノチオラン（氷冷０．
ＩＭ炭酸水素ナトリウムｌμＱ当たりｌ　０ｍｇＸ３０
０μＱ）に加えた。溶液を室温で１時間インキュベート
した。ｐ２４抗原およびｇｐ４１抗原（濃度がｐ２４は
６５４μ９／　ｌ（１％ｇｐ４１はＩ　ＯＯ，００３！
二７ト／ｄであった他は実施例２に記載のものと同じＸ
２００μＱ）を、Ｓｕｌｆｏ−ＭＢ　Ｓ（Ｐ　Ｂ　Ｓ中
に３．７５μｇ／ｌ１ＩＱ）（２００μＱ）とともに室
温で１時間それぞれインキュベートした。ついで各活性
化抗原を微細粒子に加え、室温で一夜インキユベートし
た。微細粒子を遠心分離により単離し、０．０５％ツイ
ーン２０を含有するＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳ中に再
び懸濁させて０．１２５％溶液を得た。ＰＢＳ中に再懸
濁させｔ；後、以引き続き以下に記載するＨＩＶ抗体の
微細粒子アッセイに使用するときまで２〜８°Ｃで貯蔵
した。

各抗原コーティング微細粒子溶液（ペプチド■、ｐ２４
およびｇｐ４１Ｘ２０μＱ）を、微細粒子アッセイ態様
に配列したファツトマン（Ｗｈａｔｍａｎ）　Ｇ　Ｆ−
Ｄガラス繊維フィルターの中央部分に滴下した。

このアッセイ態様は、本願と共願にかかる米国特許出願
第８３１，０１３号明細書（１９８６年２月１８日出願
）に−層詳細に記載されている。オーバーコート溶液（
ＰＢＳ中に１０％ウシ血清アルブミン、３％ショ糖、０
．０５％ツイーン２０Ｘ３００μＱ）を加え、装置を４
５°Ｃで９０分間インキュベートしてフィルターを乾燥
させた。なお本実施例においては、上記実施例に記載し
た技術に加えて種々の方法、たとえば吸着、特異的抗体
の使用または他の種々の化学的活性剤の使用により抗原
を微細粒子または他の表面に付着させることができる。

プレフィルタ−はユニットの上に位置しており、ユニッ
トはフィルターおよび抗原コーティング微細粒子を含ん
でいた。このプレフィルタ−に、試料希釈液中（ＰＢＳ
中の１０％ウシ血清アルブミンおよび２％ツイーン２０
）の血清かまたはだ液の１：１０希釈（２００μＱ）を
加えた。試料を吸着させた後、ヤギ抗ヒトＩｇＧおよび
ＩｇＡ：アルカリホス７アターゼの混合物からなる抗体
−酵素結合体（２００μＱ）をプレフィルタ−を通して
マトリックスに加えた。吸着させた後、プレフィルタ−
を除き、界面活性洗浄溶液（ＰＢＳ中の１Ｍグアニジン
塩酸塩、ＩＭ　　ＮａＣ１および０．０５％ツイーン２
０ＸｌｌＩ＋＜１）をマトリックスに加えて過剰の抗体
−酵素結合体を除いた。ついでマトリックスに色原体指
示薬（プロモークロロインドリルホスフェート／ニトロ
ブルーテトラゾリウム）を加えた。２分後に洗浄溶液（
ｌ　ｔａＱ）をマトリックスに加えた。マトリックスを
視覚によりチエツクした。色のついたスポットが現れる
ことにより、試料がＨＩＶに対する抗体を検出可能なレ
ベルまで含んでいることが示された。上記手順で試験し
たがＨＩＶに対する抗体を検出可能なレベルまで含まな
い試料は、マトリックス中に色が生じなかった。結果を
第４表および第５表に示す。

（以下、余白）第　４　表（微細粒子アッセイ）ＩＤＳにかかる危険性の高いもの第　５　表（微細粒子アッセイ）ＩＤＳにかかる危険性の高いもの実施例４ペプチドＩ、　ＩＩ、Ｉ［Ｉまたは■、またはこれらペ
プチド同士もしくは他のＨＩＶ抗原との組合わせを、抗
血清またはワクチンを製造するために用いることができ
る。

抗血清は、以下のようにして本発明のペプチドＩまたは
■をウサギに注射して免疫することにより特別に製造す
ることができる。上記ペプチドを以下の一般的手順によ
り担体タンパク質のチログロブリンに結合させる。すな
わち、蒸留水かまたはジメチルホルムアミド中の選択し
たペプチド（２ｍｇ）の溶液にｌ−エチル−３−（３−
ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（シグマ・ケ
ミカフ１社、セントルイス、ミズーリ、７．０ｍｇ／ｍ
Ｑ水）の溶液（３６μＱ）を０℃で加える。混合物を０
℃で５〜１０分撹拌する。ついで、この反応混合物にチ
ログロブリンの溶液（シグマ、ＰＢＳ中に１０　ｍｇ／
ｍＱ）（０，５＋＋＋Ｑ）を加え、０°Ｃで一夜撹拌す
る。最後に、バッファーを３回交換しながら混合物をＰ
ＢＳバッファーに対して透析する。

完全７０インドアジユバントをｌ：ｌで混合した結合体
ペプチド（２５０１１１９）をニューシーラント白ウサ
ギに接種した。引き続くすべてのブースターには不完全
フロインドアジュバントｔ−１：ｌで混合した結合体ペ
プチドが含まれていた。各ブースターの２週間後に動物
から採血した。採血を調製して血清中のポリクローナル
抗体を得た。こうして得られたペプチド抗体は、３６Ｓ
−メチオニンおよび！６５−システィンで標識した細胞
溶解物からｇｐ１６０およびｇｐ１２０を免疫沈降させ
た。これらの抗体は、たとえば、診断アッセイの試薬と
して、ｇｐ１２０もしくはｇｐ１６０抗原のアフィニテ
ィー精製のために、または治療もしくは予防用の受動ワ
クチンとして用いることができる。本発明の活性ワクチ
ン溶液は、ペプチドＩ、　ＩＩ、　ＩＩＩまたは■また
はこれらの組合わせ（または他のＨＩＶ抗原との組合わ
せ）を免疫学的に許容し得る希釈液、アジュバントまた
はキャリアー中に懸濁することにより調製することがで
きる。最初のおよびブースターの注射または経口投与は
、免疫を付与するために用いる。

実施例５本発明のモノクローナル抗体は、ＨＩＶの他のエピトー
プとともにまたはＨ［Ｖの他のエピトープを用いないで
ペプチドＩ、　　Ｉｆ、■または■またはこれらの組合
わせの免疫量をマウスに注射することにより得ることが
できる。これらペプチドは、実施例４に記載したように
して注射する前に担体タンパク質に結合させる。ついで
免疫した動物からマウス肺臓を除き、ポリエチレングリ
コールヲ用いてミエローマ細胞（たとえばＭＳ−１細胞
）と融合させる。モノクローナル抗体を産生するハイブ
リドーマ細胞を、ヒポキサンチンアミノプテリンチミシ
ン（ＨＡ　Ｔ）培地などの適当な細胞培地中でスクリー
ニングすることにより選択する。ＨＩＶタンパク質に特
異的なモノクローナル抗体は、上記ハイブリドーマ細胞
を培養した培地からアフィニティークロマトグラフィー
により単離することができる。

本発明のペプチドは多くの利点を有している。

第一に、本発明のペプチドは非感染性であるため診断に
用いる場合に一層安全である。第二に、本発明のペプチ
ドは低コストで大量に生産することができる。第三に、
本発明のペプチドを単独で含むか、それらの組合わせま
たは他のＨＩＶエピトープとの組合わせを含む診断アッ
セイは、従来のＨＩＶアッセイに比べて感度および特異
性が高い。

第四に、本発明のペプチドはＨＩＶのだ液スクリーニン
グアッセイのための応用が優れている。

以上、実施例に基づいて本発明を説明したが、当業者は
本発明の範囲内で種々の変更を加えることができること
が理解されなければならない。たとえば、本発明のペプ
チドは、診断試験およびワクチンまたは診断アッセイの
ための抗体の産生において、多くのＨＩＶまたは他の抗
原または抗体とともに用いることかできる。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）（ａ）式（ I ）：【遺伝子配列があります】（ I ）［式中、Ｙは−Ｈ、アミノ酸、ペプチド、タンパク質ま
たはリンカー、Ｘは−ＯＨ、−ＮＨ＿２、−ＮＲ＿１Ｒ
＿２（式中、Ｒ＿１およびＲ＿２はアルキル基を表す）
、ペプチド、タンパク質またはリンカーを表わす］で示
されるペプチド、（ｂ）式（II）：【遺伝子配列があります】（II）（式中、ＸおよびＹは前記と同じ）で示されるペプチド
、（ｃ）式（III）：【遺伝子配列があります】（III）（式中、ＸおよびＹは前記と同じ）で示されるペプチド
、および（ｄ）式（IV）：【遺伝子配列があります】（IV）（式中、ＸおよびＹは前記と同じ）で示されるペプチド
よりなる群から選ばれたペプチド。
（２）式（ I ）、（II）、（III）および（IV）で示さ
れるペプチドおよびそれらの置換類似体、欠失類似体お
よび付加類似体よりなる群から選ばれたペプチド。
（３）融合タンパク質としてＨＩＶの他のエピトープと
組み合わされる特許請求の範囲第（２）項記載のペプチ
ド。
（４）ＨＩＶｐ２４、ｇｐ４１、ｇｐ１２０およびそれ
らの組合わせよりなる群から選ばれたＨＩＶ抗原と組合
わされる特許請求の範囲第（２）項記載のペプチド。
（５）生物学的試料中のＨＩＶ抗体の検出のためのイム
ノアッセイ法であって、（ａ）特許請求の範囲第（１）項に記載の式（ I ）、
（II）、（III）および（IV）で示されるペプチドより
なる群から選ばれたペプチドで固相をコーティングし、
（ｂ）該固相を生物学的試料とともにインキュベートし
、（ｃ）該固相を検出可能な標識で標識した抗ヒトＩｇと
ともにインキュベートし、ついで（ｄ）標識を検出して試料中の抗ＨＩＶの存在を決定す
ることを特徴とする方法。
（６）上記工程（ａ）において該固相をｐ２４、ｇｐ４
１、ｇｐ１２０およびそれらの組合わせよりなる群から
選ばれたＨＩＶ抗原でさらにコーティングする特許請求
の範囲第（５）項記載の方法。
（７）固相が下記（ｉ）〜（ｉｉｉ）の１またはそれ以
上から独立に選ばれた性質を有する特許請求の範囲第（
５）項記載の方法、（ｉ）上記工程（ａ）において固相が特許請求の範囲第
（３）項記載のペプチドでコーティングされている；（ｉｉ）抗ヒトＩｇが、抗ヒトＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ
およびそれらの混合物よりなる群から選ばれたものであ
る；（ｉｉｉ）検出可能な標識が、酵素、放射性同位元素お
よび蛍光分子よりなる群から選ばれたものである。
（８）ヒトだ液試料中のＨＩＶ抗体の検出のためのイム
ノアッセイ法であって、（ａ）特許請求の範囲第（１）項に記載の式（Ｉ）、（
II）、（III）および（IV）で示されるペプチドよりな
る群から選ばれたペプチドで固相をコーティングし、（
ｂ）該固相をだ液試料とともにインキュベートし、（ｃ
）該固相を検出可能な標識で標識した抗ヒトＩｇととも
にインキュベートし、ついで（ｄ）標識を検出してだ液試料中の抗ＨＩＶの存在を決
定することを特徴とする方法。
（９）固相が下記（ｉ）〜（ｉｖ）の１またはそれ以上
から独立に選ばれた性質を有する特許請求の範囲第（８
）項記載の方法、（ｉ）上記工程（ａ）において固相が特許請求の範囲第
（３）項記載のペプチドでコーティングされている；（ｉｉ）ペプチドが式（III）で示されるペプチドであ
り、ＨＩＶ抗原がｐ２４およびｇｐ４１である；（ｉｉ
ｉ）抗ヒトＩｇが、抗ヒトＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭおよ
びそれらの混合物よりなる群から選ばれたものである；（ｉｖ）検出可能な標識が、酵素、放射性同位元素およ
び蛍光分子よりなる群から選ばれたものである。
（１０）適当なアジュバント中の特許請求の範囲第（１
）項に記載の式（ I ）、（II）、（III）、（IV）で示
されるペプチドおよびそれらの混合物よりなる群から選
ばれたペプチドで動物を免疫し、ついで動物の血清から
ＨＩＶ抗体を得ることにより製造されたＨＩＶ抗体。
（１１）少なくとも１個の他のＨＩＶ抗原と組合わせた
ペプチドで動物を免疫する特許請求の範囲第（１０）項
記載の方法。
（１２）特許請求の範囲第（１）項に記載の式（ I ）
、（II）、（III）、（IV）で示されるペプチドおよび
それらの混合物よりなる群から選ばれたペプチドの免疫
量を動物に注射し、動物から脾臓を除き、脾臓をミエロ
ーマ細胞と融合させ、融合細胞を適当な培地中で培養し
、ついで該培地からＨＩＶ抗体を集めることにより調製
されるＨＩＶに対するモノクローナル抗体。
（１３）動物を少なくとも１個の他のＨＩＶ抗原と組合
わせたペプチドで免疫する特許請求の範囲第（１２）項
記載のモノクローナル抗体。
（１４）特許請求の範囲第（１）項に記載の式（ I ）
、（II）、（III）、（IV）で示されるペプチドおよび
それらの混合物よりなる群から選ばれたペプチドを適当
な薬学的に許容し得るキャリアー中に懸濁することによ
り調製されるＨＩＶワクチン。
（１５）ペプチドをさらに少なくとも１個の他のＨＩＶ
抗原と組合わせる特許請求の範囲第（１４）項記載のＨ
ＩＶワクチン。