DE3854550T2

DE3854550T2 - HIV-Peptide und Methoden für den Nachweis von HIV.

Info

Publication number: DE3854550T2
Application number: DE3854550T
Authority: DE
Inventors: Kevin M Knigge; Virender K Sarin
Original assignee: Abbott Laboratories
Current assignee: Abbott Laboratories
Priority date: 1987-11-24
Filing date: 1988-11-03
Publication date: 1996-04-25
Anticipated expiration: 2008-11-04
Also published as: CA1340157C; DE3854550D1; KR890008565A; JPH01165598A; EP0317804B1; AU2567888A; ATE128716T1; EP0317804A2; EP0317804A3; AU621317B2; ES2080047T3

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Ein als humanes Immundefektvirus (HIV) bezeichnetes Retrovirus ist jetzt als das ätiologische Agens bei dem erworbenen Immundefektsyndrom (AIDS) bekannt. Verschiedene Isolate von diesem Virus wurden als Lymphadenopthie assoziiertes Virus (LAV), als humanes T-Zellen lymphotropes Virus vom Typ III (HTLV-III) oder als AIDS-assoziiertes Retrovirus (ARV) bezeichnet. Obwohl die Art und Weise der Übertragung von HIV noch nicht vollständig geklärt ist, sind die üblichsten Formen der Übertragung des HIV-Virus sexueller Kontakt, Verwendung kontaminierter intravenöser Geräte und Transfusionen mit kontaminierten Blutprodukten. Der Nachweis von HIV ist für die Diagnose der Exposition durch das Virus und für den Schutz von Blutprodukten vor einer Kontamination äußerst wichtig geworden.
Um die Exposition durch das Virus nachzuweisen, werden die Konzentrationen von HIV-Antikörpern (Anti-HIV) im Serum, im Plasma, im Speichel oder in anderen biologischen Proben von HIV-Patienten oder von AIDS-gefährdeten Personen gemessen. In der ersten Generation der Tests auf HIV-Antikörper wird inaktiviertes rohes oder gereinigtes virales Protein aus Lysaten von HIV-infizierten Zellen verwendet, um eine feste Phase zu beschichten. Die mit dem Lysat beschichtete feste Phase wird mit einer biologischen Probe, von der man vermutet, daß sie Anti-HIV enthält, inkubiert, gewaschen und dann wird der anti-human Antikörper, der mit einer nachweisbaren Kennzeichnung markiert ist, zu der festen Phase zugegeben. Die Kennzeichnung, die ein Enzym, ein radioaktives Isotop oder ein fluoreszierendes Molekül sein kann, wird gemessen, um die Anwesenheit von HIV-Antikörpern festzustellen.
Das Problem bei der Verwendung von viralen Lysaten als Ausgangsmaterial für HIV-Antigene besteht darin, daß die infektiöse Beschaffenheit des HIV-Virus die Herstellung des Virus potentiell gefährlich macht. Die HIV-viralen Lysate können auch Verunreinigungen enthalten, welche den Nachweis von HIV-Antikörpern beeinflussen. Es sind daher alternative Ausgangsmaterialien für HIV-Antigene erforderlich, die sicher und nicht infektiös sind. Es besteht auch ein Bedarf an HIV-Antigenen, die genau definiert sind und nicht mit anderen Antikörpern, die keine HIV-Antikörper sind, und mit anderen störenden Materialien, die in der zu untersuchenden Probe enthalten sind, eine Kreuzreaktion eingehen.
Untersuchungen haben gezeigt, daß HIV-Antikörper gegen gp160 und gp120 im humanen Speichel von Patienten mit AIDS und dem asymptomatischen, mit AIDS verwandten Komplex gefunden werden. Archibald et al., Blood 67: 831-834 (1986). Diese Speichelantikörper stellen meist die IgA-Immunantwort dar.
Verschiedene HIV-Isolate wurden geklont und ihre genetischen Strukturen nachgewiesen. Die Nukleotid- und die abgeleiteten Aminosäuresequenzen von verschiedenen Regionen des HIV-Genoms wurden publiziert. Die publizierten Sequenzen liefern jedoch keinerlei Information darüber, welche Regionen des HIV-Moleküls, wenn sie als Peptide synthetisiert werden, antigene oder immunogene Eigenschaften, ähnlich denen der entsprechenden Region der natürlich vorkommenden HIV-Proteine, aufweisen würden.
Die Hüll(env)region des HIV-Gens codiert ein Precursorprotein mit etwa 856 Resten und verschiedenen potentiellen Glycolisierungsstellen. Das Precurserglycoprotein entspricht einem Molekulargewicht von 160.000 Dalton (gp160) und wird bei dem -Lys Arg-Paar prozessiert, um ein N-terminales Protein mit 480 Aminosäuren (gp120) und ein Protein mit 345 Aminosäuren (gp41) zu liefern.
Es wurde mittels Radioimmunfällung, gefolgt von einer Polyacrylamid-Gelelektrophorese (RIP-PAGE), und ebenso mittels eines Enzymimmunoassays (ELISA) gezeigt, daß Seren von Patienten mit AIDS und dem mit AIDS verwandten Komplex (ARC) mit env- und gag-Gen codierten Proteinen von HIV reagieren. Diese Proteine umfassen gp160, gp120, gp41, p55, p36, p24, p18 und p12, aber sie sind nicht auf diese beschränkt.
In der EP-A-227 169 beschreiben Berman et al. verschiedene Polypeptide, welche Aminosäuresequenzen von mit AIDS verwandten viralen Proteinen imitieren. Ein immunchemisches Reagens wird durch Kombination von zwei oder mehreren synthetischen Polypeptidsequenzen hergestellt, ausgewählt aus der folgenden Gruppe: Eine Polypeptidsequenz, die mindestens eine Antigendeterminante des gag-Antigens von HIV imitiert, eine Polypeptidsequenz, die mindestens eine Antigendeterminante des Glycoproteins gp120 von HIV imitiert und eine Polypeptidsequenz, die mindestens eine Antigendeterminante des Glycoproteins gp41 von HIV imitiert. Berman et al. stellen fest, daß die beschriebenen Polypeptidsequenzen im wesentlichen von den natürlich vorkommenden gag-, gp120- und gp41-Proteinen von HIV frei sein sollten, wenn auch diese Reagentien gegebenenfalls natürlich vorkommende HIV-Proteine enthalten können. Die Offenbarung von Berman et al. liefert keinen Hinweis darauf, welches HIV- Antigen oder welche Antigendeterminante für den Nachweis von Antikörpern im Speichel wichtig sein könnte.
Von Wong-Staal et al., USA-Patentanmeldung Ser.No.779.431 wird ein 15 Aminosäuren langes Peptid von gp120 beschrieben. Dieses Peptid ist als ein Immunogen bei der Herstellung von monoklonalen Antikörpern und in einem ELISA-Assay verwendbar.
In Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA, 84, 2479-2483 (1987), beschreiben Palker et al., ein synthetisches Peptid, abgeleitet von der COOH-terminalen Region von gp120, das 15 Aminosäuren enthält, beschrieben. Dieses relativ kurze Peptid wurde verwendet, um die Reaktivität von Antikörpern, die von HIV-positiven Patienten stammen, zu bewerten, und als Immunadsorbens, um die funktionelle Bedeutung der humanen Antikörperantwort auf den COOH- Terminus von gp120 zu bewerten.
Im US-A-4.629.783, Cosand, werden Peptide mit Sequenzen beschrieben, welche kurze Regionen von gp 120, gp41 und p24 imitieren. Solche Peptide, welche für den Nachweis von Anti-HIV in Blut-Screeningsverfahren verwendet werden können, imitieren Proteine, die durch gag- oder env-Regionen des viralen Genoms codiert sind. Die von Cosand beschriebenen Peptide enthalten bevorzugt weniger als 25 Aminosäuren.
Im WO 86/02283, Montagnier et al., werden ein LAV-Hüllantigen mit einem Molekulargewicht von etwa 110.000 oder Antigene mit einem niedrigeren Molekulargewicht (weniger als 200 Aminosäuren), abgeleitet von dem vorhergehenden, als brauchbar bei der Diagnose von LAV-Antikörpern in den Seren von Patienten beschrieben.
Im EP-A-0 231 914, Gallo et al., werden synthetische Peptide, die Teile der Antigen-Determinantensequenz HTLV env (460-550) enthalten, beschrieben, welche als Reagentien in Immunoassays für den Nachweis von AIDS-Antikörpern, als Immunogene zum Induzieren polyklonaler und monoklonaler Antikörper gegen das AIDS-Virus-env-Protein und als Komponenten in AIDS-Vakzinen verwendbar sind.
Im EP-A-0 212 532, Chan et al., wird ein Verfahren zur Herstellung von Fusionsproteinen beschrieben, worin das Fusionsprotein ein AIDS-Virus- env-Protein enthalten kann. Besonders immunreaktive Fragmente des AIDS- Virus-env-Proteins werden offenbart.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Wir haben neue gp160-Peptide entwickelt, welche für den Nachweis von HIV-Antikörpern in biologischen Proben, für die Herstellung von HIV- Antikörpern und für Vakzine verwendet werden können. Diese Peptide imitieren im wesentlichen Regionen von gp160 oder dessen gp120-Fragment und stellen nicht infektiöse und reine Ausgangsmaterialien für HIV-Antigene zur Verfügung.
Zuerst wurde ein kurzes Peptid (Peptid I), entsprechend den Aminosäuren 490-517 von gp120, codiert in der Region zwischen den Basenpaaren (bp) 7221-7305 [Sanchez-Pescador et al., Science 227, 484-492 (1985)] zum Testen der Immunogenität/Antigenizität synthetisiert. Diese Peptidsequenz wird nachstehend gezeigt:
worin Y -H oder eine Aminosäure bedeutet und X -OH, -NH&sub2; oder -NR&sub1;R&sub2; (worin R einer Alkylgruppe entspricht) sein kann.
Die Aminosäurensequenz des Peptids (II) entspricht den Aminosäuren 482-517 von gp120, codiert in der Region zwischen bp 7197-7305 [Sanchez- Pescador et al., siehe oben]. Die Aminosäurensequenz für das Peptid II wird nachstehend gezeigt:
worin Y und X die gleichen Bedeutungen aufweisen, wie es oben für das Peptid I beschrieben wurde.
Das Peptid III erstreckt sich von den Aminosäuren 455 bis 511 von gp120, codiert in der Region zwischen bp 7165-7335 [Muesing et al., Nature, 313, 450-458 (1985)]. Die Aminosäurensequenz für dieses Peptid wird nachstehend gezeigt:
worin Y und X die gleichen Bedeutungen aufweisen, wie es oben für das Peptid I erläutert wurde.
Diese Peptide können als Ausgangsmaterialien für HIV-Antigene für sich allein oder in Kombination verwendet werden oder sie können an größere Trägermoleküle gebunden werden. Es wird bevorzugt, daß eines oder mehrere der Peptide I-III in Kombination mit anderen Antigenen und Antigen- Determinanten verwendet werden, insbesondere mit anderen HIV-Antigenen wie p24 und gp41.
Die Peptide der Erfindung können mit einer Anzahl von Verfahren synthetisiert werden, einschließlich der Synthese in Lösung oder mittels der Festphasen-Peptidmethodik unter Verwendung von stufenweisen oder Fragmentkupplungs-Protokollen. Sie können auch enzymatisch synthetisiert werden oder als Fusionsproteine oder -peptide mittels der rekombinanten DNA-Methodik hergestellt werden. Regionen von Genen, die diese Peptide codieren, können ebenfalls unter Verwendung der rekombinanten DNA-Technologie synthetisiert, kloniert und exprimiert werden, und die Sequenzen können subkloniert und in geeignete Expressionssysteme, wie E. coli, Hefe oder Säugetierzellen exprimiert werden. Die hier beschriebenen Peptide können mit anderen Antigen-Determinanten oder Antigenen von HIV, mit oder ohne Trägermoleküle, kombiniert und mit rekombinanten DNA-Methoden exprimiert werden oder mittels synthetischer Methoden als Fusionsproteine hergestellt werden. Substitutions-, Deletions- und Additionsanaloge der Peptide der Erfindung können ebenfalls mit Methoden hergestellt werden, die dem Fachmann wohlbekannt sind.
Die Peptide gemäß den verschiedenen hier vorliegenden Beispielen können für sich allein, in Kombination miteinander oder in Kombination mit anderen Antigenen, die von Interesse sind, verwendet werden. Beispielsweise können verschiedene dieser Peptide als physikalische Mischungen oder miteinander chemisch gebunden verwendet werden, mit oder ohne Spacermoleküle. Es ist auch möglich, die Peptide chemisch oder physikalisch mit Trägerpeptiden, Proteinen oder Trägersubstanzen zu kuppeln. Diese Peptide können mit anderen HIV-Antigenen oder -Antigen-Determinanten, wie gp41, gp120, p55, p24 und anderen, verwendet werden. Die Peptide, insbesondere das Peptid III, können an Trägermoleküle, wie Thyroglobulin oder BSA, gekuppelt werden und als Antigene für sich allein oder in Kombination mit anderen Antigen-Determinanten oder Antigenen verwendet werden.

DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die folgenden Beispiele erläutern Verfahren zur Herstellung der Peptide, ebenso Methoden, die Peptide als Ausgangsmaterialien für reine, gut definierte, nicht infektiöse HIV-Antigene zu verwenden.

Beispiel 1

Dieses Beispiel erläutert die Synthese des Peptids I an einem Harzträgermaterial mittels stufenweiser Festphasensynthese ausgehend von dem carboxyterminalen Rest. Ein Verfahren kann für diese Synthese verwendet werden, wie das von Barany und Merrifield, The Peptides 2, 1984, Gross E. und Meinehofer J., Hrsg., Academic Press, New York, N.Y. (1980), beschriebene Verfahren. Ein Boc-L-Arg(Tos)-OCH&sub2;-Pam-Harz wurde in ein Reaktionsgefäß eines Applied Biosystems Synthesizer, Model 430A, erhältlich von Applied Biosystems, Foster City, California, gegeben. Geschützte Aminosäuren wurden stufenweise an den Harzträger mit der vorgeformten symmetrischen Anhydridchemie gekuppelt, außer in den Fällen der Zugabe von Arginin, Asparagin und Glutamin, wo das DCC/HOBT-Protokoll, beschrieben von Konig und Geiger. Chem.Ber. 103, 788-798 (1970), verwendet wurde. Alle aminoterminalen Reste wurden mit tert.Butyloxycarbonyl (tert.BOC-Kupplung) geschützt und die Seitenketten von verschiedenen Aminosäureresten wurden durch die folgenden Gruppen geschützt: Arg, Tos; Lys, 2-ClZ; Glu, OBZl; Thr, Bzl; Tyrosin 2-BrZ.
Das Harz mit dem vollständig geschützten Peptid wurde 5 Minuten in Methylenchlorid (CH&sub2;Cl&sub2;) quellen gelassen. Die Nα-Boc-Schutzgruppen wurden entfernt, indem mit 60%iger Trifluoressigsäure (TFA/CH&sub2;Cl&sub2;) abgespalten, mit CH&sub2;Cl&sub2; gewaschen, mit 10%igem N,N-Diisopropylethylamin (DIEA/CH&sub2;Cl&sub2;) neutralisiert und schließlich wieder mit CH&sub2;Cl&sub2; gewaschen wurde. Das Harz wurde im Vakuum getrocknet. Das so erhaltene Peptidharz wurde mit 9 ml wasserfreier Fluorwasserstoffsäure (HF), zu der 1 ml p-Kresol zugegeben worden war, 60 Minuten bei 0ºC behandelt. Die HF wurde im Vakuum bei 0ºC abdestilliert. Das nach der Abspaltung freie Peptid und das Harz wurden dreimal mit je 15 ml Diethylether gewaschen, und das Peptid wurde dreimal mit je 15 ml 40%iger wäßriger Essigsäure extrahiert. Die wäßrigen Extrakte wurden vereint und dreimal mit je 10 ml Diethylether gewaschen, worauf die wäßrige Schicht lyophilisiert wurde, um das Rohpeptid für die Reinigung zu liefern. Das Polypeptid wurde mittels Umkehrphasen-Hochleistungs- Flüssigchromatographie (HPLC) an C&sub4; Säulen gereinigt, wobei Gradienten von 0,1% TFA/Wasser (A) und 100% Acetonitril (B) als Lösungsmittelsysteme bei einer Fließgeschwindigkeit von 1 ml/Min. für die analytischen Säulen (Vydac-214-TP54, Vydac Seperation Group, Hesperia, California) oder bei einer Fließgeschwindigkeit von 3 ml/Min. für die halbpräparativen Säulen (Vydac-214-TP510) verwendet wurden. Der verwendete Gradient war:
Die Elution des Polypeptids von der HPLC-Säule wurde bei 222 nm und 280 nm überwacht. Die Zusammensetzung des Polypeptids wurde durch Hydrolyse mit 6 N Salzsäure (HCl)/0,3% Phenol bei 150ºC über 2 Stunden im Vakuum und anschließende Analyse auf einem Beckmann 6300 amino acid analyzer mit einer SICA 7000 A Integration, erhältlich von Beckmann Instruments, Labrea, California, bestätigt.
Die Peptide II und III wurden auf eine Weise, die der oben beschriebenen ähnelt, synthetisiert. Methionin wurde in der Sulfoxidform verwendet, Tryptophan wurde durch die Formylgruppe (CHO) geschützt; Ser, Bzl; Asp, OBZL. Für Peptidharze, die Methioninsulfoxid und Formyltryptophan enthalten, wurden die Peptidschutzgruppen entfernt und die Peptide vom Harz unter Verwendung der "low high" HF Protokolle, wie sie von Tam et al., J. Am. Chem. Soc., 105, 6442-6455, beschrieben werden, abgespalten. Die gewünschten Peptide können auch synthetisiert werden, indem nicht geschütztes Methionin und Tryptophan eingesetzt werden und sachgemäß Radikalfänger während der Entfernung der Schutzgruppen und während der Abspaltung verwendet werden. Alle Peptide wurden unter Verwendung von Umkehrphasen-C&sub4;-HPLC mit einem Gradientensystem von 0,1%iger wäßriger TFA und 100% Acetonitril gereinigt.
Die Peptide I, II und III können an größere Trägermoleküle wie Rinderserumalbumin (BSA), Hämocyanin der Schlüssellochnapfschnecke (KLH) oder Thyroglobulin unter Verwendung von wasserlöslichem Carbodiimid oder Maleinimido-benzoyl-N-hydroxysuccinimid (MBS), wie es von Liu et al., Biochem. 18, 690-697 (1979), und von Kitagawa et al., J. Biochem. 92, 585- 590 (1982) beschrieben wurde, ankonjugiert werden. Diese Konjugate können dann verwendet werden, um die sequenzspezifischen Antikörper zu vermehren,

Beispiel 2

Dieses Beispiel zeigt eine Methode für den Nachweis von HIV- Antikörpern in biologischen Proben unter Verwendung der im Beispiel 1 beschriebenen Peptide. Biologische Proben, die mit den hier beschriebenen Methoden getestet werden können, umfassen Blutpräparate wie Serum oder Plasma, Urin und Speichel. Die Peptide der Erfindung sind besonders gut in einem Speicheltest für die Anwesenheit von IgA-, IgG- oder IgM-Antikörper gegen HIV verwendbar, besonders wenn die Peptide mit anderen HIV-Antigenen kombiniert sind.
die Peptide I und III wurden mit von rekombinanter DNA abgeleiteten HIV-p24 und HIV-gp41 nebeneinander getestet, um ihre Brauchbarkeit als Ausgangsmaterialien für HIV-Antigene in einer Methode für den Nachweis von HIV-Antikörpern in biologischen Proben zu bestimmen.
Vier Antigenlösungen wurden in 50 mM Natriumcarbonat, pH 9,5 wie folgt hergestellt: Peptid I, 10 ug/ml; Peptid III, 6,25 ug/ml; von rekombinanter DNA abgeleitetes HIV-p24-Protein, 1,64 ug/ml; und von rekombinanter DNA abgeleitetes HIV-gp41-Protein, 125 Einheiten/ml. Die p24- und gp41- Proteine wurden mit Verfahren hergestellt, die in der gleichzeitig anhängigen U.S. Patentanmeldung Serial No. 020.287, angemeldet am 27. Februar 1987, übertragen auf den selben Zessionar wie die vorliegende Erfindung, beschrieben.
Einhundert Mikroliter (100 ul) jeder Antigenlösung wurden in die Löcher einer Polystyrol-Mikrotiterplatte, erhältlich von Dynatech Laboratories, Alexandria, Virginia, gegeben. Andere feste Phasen,welche bei den hier beschriebenen Methoden benützt werden können, umfassen Kügelchen, Papierstreifen, Mikropartikel, Nitrocellulosemembrane, Polystyrolröhrchen oder andere geeignete Träger aus Kunststoff oder Papier. Die Lösung und die Platte wurden 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert, wonach die Lösung entfernt und die Platte fünfmal mit destilliertem Wasser gewaschen wurde. 250 ul einer Deckschichtlösung, bestehend aus 10% Rinderserumalbumin, 3% Saccharose und 0,05% Tween 2D in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) (0,01 M KH&sub2;PO&sub4;; 0,15 M NaCl; pH 7,2) wurden zu den Löchern gegeben. Nach 30 minütiger Inkubation wurde die Deckschichtlösung entfernt und die Platte wurde fünfmal mit destilliertem Wasser gewaschen. Die beschichteten Platten wurden bei 2-8ºC für den nachfolgenden Gebrauch aufbewahrt.
Die beschichteten Platten wurden in einem Assay für den Nachweis von Anti-HIV wie folgt verwendet: 100 ul einer auf 1:800 verdünnten Serumprobe oder einer auf 1:10 verdünnten Speichelprobe in einem Verdünnungsmittel, das aus 10% Rinderserumalbumin und 2% Tween 20 in phosphatgepufferter Salzlösung (0,01 M KH&sub2;PO&sub4;; 0,15 M NaCl; pH 7,2) bestand, wurden zu den Löchern in den beschichteten Mikrotiterplatten gegeben. Nach einstündigem Inkubieren bei Raumtemperatur wurde die Probe entfernt und die Löcher wurden fünfmal mit destilliertem Wasser gewaschen. 100 ul eines Antikörper-Enzymkonjugats (alkalische Phosphatase: Ziegen- anti-human IgG oder alkalische Phosphatase: Ziegen-anti-human IgA) wurden den Löchern zugegeben. Das Antikörper-Enzymkonjugat kann auch ein IgM- Antikörperkonjugat sein, wenn ein IgM-Antikörper aufgefunden wird. Die Antikörper-Enzymkonjugate werden hergestellt, wie es bei Engvall et al., Biochim.Biophys.Acta, 251, 427-434 (1971); Korn et al., J.Mol.Biol.,65, 525-529 (1972) und bei Avrameas und Ternynck, Immunochemistry 6, 53-66 (1969) beschrieben ist. Nach einer weiteren Stunde Inkubieren bei Raumtemperatur wurde das Konjugat entfernt und die Löcher wurden fünfmal mit destilliertem Wasser gewaschen. 100 ul einer p-Nitrophenylphosphatsubstratlösung wurden zu den Löchern gegeben und 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. 100 ul 2N NaOH wurden zu den Löchern gegeben, um die Reaktion zu unterbrechen. Die Absorptionswerte der Löcher wurden bei 405 nm abgelesen. Ein positives Resultat wurde bei einem Unterbrechungswert von 0,200 O.D. oder größer festgesetzt, der aufgrund der Resultate, die von 100 negativen und 50 positiven gepaarten Serum- und Speichelproben erstellt wurden, ermittelt wurde. Die Resultate werden in den Tabellen 1, 2 und 3 gezeigt.
Die Resultate zeigen, daß alle als bestätigt seropositiven Proben, die getestet wurden, Serum IgG zu gp41, Peptid I und Peptid III enthielten, aber die Serumreaktivität bei p24 variierte. Im Speichel variierte die IgG- Reaktivität in allen seropositiven Proben bei allen getesteten Antigenen. Obwohl die IgA-Reaktivität im Speichel für p24 und gp41 variierte, enthielten alle seropositiven Proben Speichel-IgA zu Peptid I und Peptid III. Bei den bestätigt negativen Proben wurde keine Reaktivität, weder im Serum noch im Speichel, für irgendeines der getesteten Antigene nachgewiesen. Im allgemeinen war die Reaktivität des Peptids III größer als die des Peptids I.
Diese Ergebnisse beweisen, daß Peptid I und Peptid III mit den Antikörper gegen HIV spezifisch reaktiv sind. Zusätzlich zeigen die Resultate, daß zumindest ein Teil von gp120 vorhanden sein muß, wenn im Speichel nach Antikörpern gegen HIV getestet wird. Tabelle 1 Mikrotiter Serum IgG Diagnose des Patienten Bestätigt Seropositiv Peptid Asymptomatisch Hämophil Hohes Risiko Gesunder Hetero Tabelle 2 Mikrotiter Speichel IgG Diagnose des Patienten Bestätigt Seropositiv Peptid Asymptomatisch Hämophil Hohes Risiko Gesunder Hetero Tabelle 3 Mikrotiter Speichel IgA Diagnose des Patienten Bestätigt Seropositiv Peptid Asymptomatisch Hämophil Hohes Risiko Gesunder Hetero

Beispiel 3

Dieses Beispiel zeigt einen Mikropartikel-Assay für den Nachweis von HIV-Antikörpern unter Verwendung von Peptid III, von rekombinanter DNA abgeleitetem p24 und von rekombinanter DNA abgeleitetem gp41. Einhundert Mikroliter von amino-modifizierten Mikropartikeln, 2,5% Feststoffe, 0,45 um durchschnittlicher Durchmesser, im Handel erhältlich von Polyscience, Warrington, Pennsylvania, wurden zu 1 ml phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) und 3,0 ml Sulfo-m-maleinimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimid (Sulfo-MBS) (1,0 mg/ml in PBS) gegeben. Die Lösung wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt, wonach die Mikropartikel durch Zentrifugation bei einer Geschwindigkeit von 5000 x g isoliert, zweimal mit PBS gewaschen und in 1 ml PBS resuspendiert wurden. Dreißig Mikroliter einer Lösung von Peptid III (1 mg/ ml in destilliertem Wasser) wurden zu den resuspendierten Mikropartikeln zugegeben und 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Mikropartikel wurden durch Zentrifugation bei einer Geschwindigkeit von 5000 x g isoliert, zweimal mit PBS, das 0,05% Tween 20 enthielt, gewaschen und in PBS resuspendiert, um eine 0,125%ige Lösung zu ergeben. Nach Resuspension in PBS wurden die Partikel bei 2-8ºC für eine nachfolgende Verwendung in Kombination mit durch p24 und gp41 beschichteten Mikropartikeln in einem Assay für Anti-HIV gelagert.
Um separate Mikropartikellösungen von mit p24 beschichteten Mikropartikeln und mit gp41 beschichteten Mikropartikeln herzustellen, wurden einhundert Mikroliter von amino-modifizierten Mikropartikeln, 2,5% Feststoffe, 3,0 um durchschnittlicher Durchmesser, im Handel erhältlich von Polyscience, zu 500 Mikrolitern von 50 mM N-Methylmorpholin, pH 7,5, und zu 300 Mikrolitern von 2-Iminothiolan (10 mg pro ml in eiskaltem 0,1 M Natriumbicarbonat) für jedes Antigen zugegeben. Die Lösung wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Zweihundert Mikroliter des p24-Antigens und des gp41 Antigens (beschrieben im Beispiel 2 mit der Ausnahme, daß die Konzentrationen folgende waren: p24, 645 ug/ml; gp41, 100.000 Einheiten/ml) wurden mit jeweils 200 Mikrolitern von Sulfo-MBS (3,74 ug/ml in PBS) bei Raumtemperatur 1 Stunde inkubiert. Jedes aktivierte Antigen wurde dann zu den Mikropartikeln gegeben und über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. Die Mikropartikel wurden durch Zentrifugation isoliert, zweimal mit PBS, das 0,05% Tween 20 enthielt, gewaschen und in PBS resuspendiert, um eine 0,125%ige Lösung zu ergeben. Nach Resuspension in PBS wurden die Partikel bei 2-8ºC für eine nachfolgende Verwendung in dem unten beschriebenen Mikropartikel-Assay für HIV-Antikörper gelagert.
Zweihundert Mikroliter jeder der mit dem Antigen beschichteten Mikropartikellösungen (Peptid III, p24 und gp41) wurde tropfenweise zum Zentrum eines Whatman-GF-D-Glasfaserfilters gegeben, das in einem Mikropartikel-Assayformat hergerichtet war. Dieses Assayformat ist detaillierter in der gleichzeitig anhängigen U.S. Patentanmeldung Serial No. 831.013, angemeldet am 18. Februar 1986, übertragen auf den selben Zessionar wie die vorliegende Erfindung, beschrieben und hier als Referenz eingefügt. Dreihundert Mikroliter einer Deckschichtlösung (10% Rinderserumalbumin, 3% Saccharose und 0,05% Tween 20 in PBS) wurden zugefügt und die Einheit wurde bei 45ºC 90 Minuten inkubiert, um das Filter zu trocknen. Es muß erwähnt werden, daß, zusätzlich zu der Methode, die in den vorangegangenen Beispielen beschrieben wurde, die Antigene an die Mikropartikel oder an andere Oberflächen mit einer Reihe von anderen Methoden angeheftet werden können, z.B. durch Adsorption, durch die Verwendung spezifischer Antikörper oder durch Verwendung anderer verschiedenartiger chemischer Aktivatoren.
Ein Vorfilter befand sich oberhalb der Einheit, welches das Filter und die mit Antigen beschichteten Mikropartikel enthielt. Zweihundert Mikroliter einer 1:10 Verdünnung entweder des Serums oder des Speichels in einem Probenverdünnungsmittel (10% Rinderserumalbumin, 3% Saccharose und 0,05% Tween 20 in PBS) wurden zu dem Vorfilter zugegeben. Nachdem die Probe absorbiert war, wurden 200 Mikroliter eines Antikörper-Enzymkonjugats, umfassend eine Mischung von Ziegen-anti-human IgG und IgA:alkalischer Phosphatase zu der Matrix durch das Vorfilter zugegeben. Nach Absorption wurde das Vorfilter entfernt und 1 Milliliter einer Detergentwaschlösung (1 M Guanidinhydrochlorid, 1 M NaCl, 0,05% Tween 20 in PBS) wurde zu der Matrix gegeben, um einen etwaigen Überschuß des Antikörper-Enzymkonjugats zu entfernen. Dann wurden 150 Mikroliter eines Chromogenindikators (Bromchlorindolylphosphat/Nitroblautetrazolium) zu der Matrix zugegeben. Nach 2 Minuten wurde 1 Milliliter der Waschlösung zu der Matrix zugegeben. Die Matrix wurde visuell kontrolliert. Das Erscheinen eines gefärbten Flecks zeigte, daß die Probe nachweisbare Konzentrationen von Antikörpern gegen HIV enthielt. Proben, die mittels der obigen Verfahrensweise getestet wurden, aber keine nachweisbaren Konzentrationen von Antikörpern gegen HIV enthielten, riefen keine Farbe in der Matrix hervor. Die Resultate werden in der Tabellen 4 und 5 bekanntgegeben. Tabelle 4 Mikropartikel-Assay Serum Diagnose des Patienten Bestätigt Seropositiv Asymptomatisch Hämophil Hohes Risiko Gesunder Hetero Negativ Positiv Tabelle 5 Mikropartikel-Assay Serum Diagnose des Patienten Bestätigt Seropositiv Asymptomatisch Hämophil Hohes Risiko Gesunder Hetero Negativ Positiv

Beispiel 4

Die Peptide I, II oder III oder irgendeine Kombination dieser Peptide untereinander oder mit anderen HIV-Antigenen können für die Produktion von Antisera oder als Vakzinen verwendet werden.
Antisera werden speziell durch Immunisieren von Kaninchen mit Injektionen der Peptide I oder III gemäß der vorliegenden Erfindung wie folgt hergestellt. Das Peptid wird an ein Trägerprotein, Thyroglobulin, gemäß der folgenden allgemeinen Verfahrensweise gekuppelt: Zu einer Lösung des ausgewählten Peptids (2 mg) in 1 ml, entweder von destilliertem Wasser oder von Dimethylformamid, werden 36 ul einer Lösung von 1-Ethyl-3-(3- dimethylaminopropyl)-carbodiimid (Sigma Chemical Co., St. Louis, Missouri, 7,0 mg/ml H&sub2;O) bei 0ºC zugegeben. Die Mischung wird 5-10 Minuten bei 0ºC gerührt. Dann werden 0,5 ml einer Thyroglobulinlösung (Sigma, 10 mg/ml in PBS) zu dieser Reaktionsmischung zugegeben und über Nacht bei 0ºC gerührt. Schließlich wird die Mischung gegen PBS mit dreimaligem Wechsel des Puffers dialysiert.
Weiße Neuseeland-Kaninchen werden mit 250 mg des konjugierten Peptids mit kompletten Freundschen Adjuvans gemischt (1:1). Alle folgenden Verstärkungen enthielten das konjugierte Peptid 1:1 gemischt mit inkompletten Freundschen Adjuvans. Zwei Wochen nach jeder Verstärkung wurden den Tieren Blut entnommen. Das Blut wurde verarbeitet, um polyklonale Antikörper im Serum zu erhalten. Mit den so erzeugten Peptidantikörpern wurde eine Immunpräzipitation von gp160 und gp120 aus mit ³&sup5;S-Methionin und ³&sup5;S- Cystein gekennzeichneten Zellysaten durchgeführt. Diese Antikörper können z.B. als Reagentien in einem diagnostischen Assay, für eine Affinitätsreinigung der gp120- oder gp160-Antigene oder als passive Vakzine für therapeutische oder prophylaktische Anwendungen verwendet werden.
Eine aktive Impfstofflösung gemäß der vorliegenden Erfindung kann durch Suspendieren der Peptide I, II oder III oder einer Kombination von diesen (oder einer Kombination mit anderen HIV-Antigenen) in einem immunologisch annehmbaren Verdünnungsmittel, Adjuvans oder Träger hergestellt werden. Anfangs- und Verstärkunginjektionen oder eine orale Verabreichung werden angewendet, um eine Immunität zu verleihen.

Beispiel 5

Monoklonale Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung können hergestellt werden, indem Mäusen immunisierende Dosen der Peptide I, II und III oder irgendeiner Kombination von diesen mit oder ohne anderen Antigen- Determinanten von HIV injiziert werden. Das betreffende Peptid wird an ein Trägerprotein gekuppelt, bevor es, so wie im Beispiel 4 beschrieben, injiziert wird. Die Mäusemilz wird dann den immunisierten Tieren entnommen und die Milzzellen werden mit Myelomzellen (z.B. NS-1-Zellen) unter Verwendung von Polyethylenglycol fusioniert. Hybridoma-Zellen, die monoklonale Antikörper produzieren, werden mittels Screening in einem geeigneten Zellkulturmedium, z.B. in einem Hypoxanthin-Aminopterin- Thymidin(HAT)-Medium. Monoklonale Antikörper, die für HIV-Proteine spezifisch sind, können mittels Affinitätschromatographie aus Medien, in welchen solche Hybridome kultiviert worden sind, isoliert werden.
Die Peptide der Erfindung weisen viele Vorteile auf. Erstens sind sie nicht infektiös und daher sicherer bei der diagnostischen Anwendung. Zweitens können die Peptide in großen Mengen mit niedrigen Kosten hergestellt werden. Drittens ist ein diagnostischer Assay, der diese Peptide für sich allein, in Kombination miteinander oder in Kombination mit anderen HIV-Antigen-Determinanten enthält, empfindlicher und spezifischer als die früheren HIV-Assays. Viertens scheinen die Peptide der Erfindung eine hervorragende Anwendung in Speichelscreening-Assays für HIV aufzuweisen.
Wenn auch spezielle Beispiele zur Erläuterung der Erfindung geliefert wurden, muß man verstehen, daß Fachleute auf diesem Gebiet Varianten erkennen werden, die unter den Schutzumfang der Erfindung, wie sie beansprucht ist, fallen. Beispielsweise können die Peptide der Erfindung zusammen mit einer Anzahl von HIV- oder anderen Antigenen oder Antikörpern bei diagnostischen Testen und bei der Herstellung von Antikörpern für Vakzine oder diagnostische Assays verwendet werden.

Claims

1. Ein Peptid, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus

und Substitutions-, Deletions- und Additionsanaloge hiervon, in denen Y -H oder eine Aminosäure und X -OH, -NH&sub2; oder -NR&sub1;R&sub2; (worin R eine Alkylgruppe ist) bedeuten.

2. Das Peptid des Anspruchs 1, worin das genannte Peptid in Kombination mit anderen Antigen-Determinanten von HIV als ein Fusionsprotein erzeugt wird.

3. Das Peptid des Anspruchs 2 in Kombination mit einem HIV-Antigen, ausgewählt aus der Gruppe, die aus HIV p24, gp41, gp120 und Kombinationen hiervon besteht.

4. Ein Immunoassay für den Nachweis von HIV-Antikörpern in einer biologischen Probe, umfassend:

a) Beschichten einer festen Phase mit einem Peptid, ausgewählt aus der Gruppe, die aus den Peptiden des Anspruchs 1 besteht;

b) Inkubieren der festen Phase mit der biologischen Probe;

c) Inkubieren der festen Phase mit einem anti-human Ig, das mit einer nachweisbaren Kennzeichnung markiert ist; und

d) Nachweis der Kennzeichnung, um die Anwesenheit von Anti- HIV in der Probe zu bestimmen.

5. Der Immunoassay des Anspruchs 4, worin die feste Phase in der Stufe a) außerdem mit einem HIV-Antigen, ausgewählt aus der Gruppe, welche aus p24, gp41 und gp120 und Kombinationen hiervon besteht, beschichtet wird.

6. Der Immunoassay des Anspruchs 4, worin die feste Phase Eigenschaften aufweist, welche unabhängig voneinander aus einer oder mehreren der folgenden ausgewählt sind:

a) Die feste Phase der Stufe (a) wird mit dem Peptid des Anspruchs 2 beschichtet;

b) das anti-human Ig ist aus der Gruppe ausgewählt, die aus anti- human IgG, IgA, IgM und Mischungen hiervon besteht;

c) die nachweisbare Kennzeichnung ist aus der Gruppe ausgewählt&sub1; die aus Enzymen, radioaktiven Isotopen und fluoreszierenden Molekülen besteht.

7. Ein Immunoassay für den Nachweis von HIV-Antikörpern in einer Probe von humanem Speichel, umfassend:

a) Beschichten einer festen Phase mit einem Peptid, ausgewählt aus der Gruppe der Peptide des Anspruchs 1;

b) Inkubieren der festen Phase mit der Speichelprobe;

d) Nachweis der Kennzeichnung, um die Anwesenheit von Anti- HIV-Antikörpern in der Speichelprobe zu bestimmen.

8. Der Immunoassay des Anspruchs 7, worin die feste Phase Eigenschaften aufweist, welche unabhängig voneinander aus einer oder mehreren der folgenden ausgewählt sind:

a) Die feste Phase wird in der Stufe (a) außerdem mit einem HIV- Antigen beschichtet, das aus der Gruppe ausgewählt ist, welche aus p24, gp41 und gp120 und Kombinationen hiervon besteht;

b) das Peptid ist das Peptid III des Anspruchs 1 und die HIV- Antigene sind p24 und gp41;

c) das anti-human Ig ist aus der Gruppe ausgewählt, die aus anti-human IgG, IgA, IgM und Mischungen hiervon besteht;

d) die nachweisbare Kennzeichnung ist aus der Gruppe ausgewählt, die aus Enzymen, radioaktiven Isotopen und fluoreszierenden Molekülen besteht.

9. Ein HIV-Antikörper, hergestellt durch Immunisierung eines Tieres mit einem Peptid, das ausgewählt ist aus der Gruppe der Peptide des Anspruchs 1 und deren Mischungen, in einem geeigneten Adjuvans und Gewinnung der Antikörper aus den Seren des Tieres.

10. Der HIV-Antikörper des Anspruchs 9, worin das Tier mit dem Peptid in Kombination mit zumindest einem anderen HIV-Antigen immunisiert wird.

11. Ein monoklonaler Antikörper gegen HIV, hergestellt, indem einem Tier eine immunisierende Dosis eines Peptids, das ausgewählt ist aus der Gruppe der Peptide des Anspruchs 1 und Mischungen hiervon, injiziert wird, die Milz des Tieres entnommen wird, die Milz mit Myelomzellen fusioniert wird, die fusionierten Zellen in einem geeigneten Kulturmedium kultiviert werden und die HIV-Antikörper aus der genannten Kultur aufgesammelt werden.

12. Der monoklonale Antikörper des Anspruchs 11, worin das Tier mit dem Peptid in Kombination mit zumindest einem anderen HIV-Antigen immunisiert wird.

13. Eine HIV-Vakzine, hergestellt durch Suspendieren eines Peptids, ausgewählt aus der Gruppe der Peptide des Anspruchs 1 und Mischungen hiervon, in einem geeigneten pharmazeutisch annehmbaren Träger.

14. Die Vakzine des Anspruchs 13, wobei das Peptid ferner mit zumindest einem anderen HIV-Antigen kombiniert wird.