DE3876496T2

DE3876496T2 - Synthetisches peptid-antigen fuer nachweis von hiv-2-infektionen.

Info

Publication number: DE3876496T2
Application number: DE8888850167T
Authority: DE
Inventors: Peter Horal; Stig Jeansson; Lars Rymo; Bo Svennerholm; Anders Vahlne
Original assignee: Syntello AB
Current assignee: Syntello AB
Priority date: 1987-05-18
Filing date: 1988-05-13
Publication date: 1993-05-13
Anticipated expiration: 2008-05-14
Also published as: NO881719D0; DE3876496D1; NO881719L; NZ224581A; AU1645688A; ZA883431B; EP0292454A2; FI882173A0; FI882173A; DK268588A; EP0292454A3; EP0292454B1; ES2011334A6; ATE83247T1; AU606951B2; US4812556A; DK268588D0

Description

Darstellung des Standes der Technik

Die Erfindung betrifft ein synthetisches Peptid-Antigen, dessen Sequenz einem Bereich eines immunologisch wichtigen Proteins von HIV-2 entspricht. Dieses Peptid dient als Diagnosereagens zum Nachweis der Anwesenheit von Antikörpern gegen HIV-2. Das Peptid kann auch als Immunogen in Stoffverbindungen dazu dienen, die Produktion von Antikörpern gegen HIV-2 in Tieren einschließlich Menschen anzuregen.
Das erworbene Immunschwächesyndrom ("acquired immunodeficiency syndrome" - AIDS) stellt weltweit ein erhebliches Gesundheitsproblem dar. Das ätiologische Agens für AIDS wurde als HIV (für "human immunodeficiency virus" - menschlicher Immunschwächevirus) identifiziert, was der Name für eine Gruppe eng verwandter Viren ist, die früher mit HTLV-III, LAV und ARC bezeichnet wurden (jetzt gemeinsam mit HIV-1).
HIV-Isolate aus AIDS- und ARC- ("Aids related complex" - AIDS-verwandter Komplex) Patienten aus Nordamerika, Westeuropa und Zentralafrika haben im allgemeinen die gleichen biologischen Eigenschaften und antigenisch wirkende, kreuzreagierende Proteine. In genetischen Untersuchungen wurden jedoch Unterschiede in der Nukleotidsequenz der Genome nordamerikanischer und afrikanischer HIV-Isolate beschrieben (Benn et al., Science (1985) 230: 949-951). Außerdem wurden auch geringe Unterschiede in den Nukletidsequenzen bei verschiedenen HIV-Isolaten aus den USA dokumentiert.
In letzter Zeit wurden mehrere andere, genetisch und strukturell mit HIV verwandte Viren isoliert. Diese genetisch und immunologisch HIV ähnelnden Viren wurden aus Rhesusmakaken (Macaca mulatta), die in Gefangenschaft gehalten wurden und an einer AIDS-artigen Krankheit litten, und gesunden, in freier Wildbahn gefangenen afrikanischen Grünen Meerkatzen (Cercopithecus sp.) isoliert (Kanki et al., Science (1985) 230: 951-954). Die früher mit STLV-IIIAGM (afrikanisches Grüne Meerkatzen-Isolat) und STLV-IIIMAC (Makaken-Isolat) bezeichneten Viren sind heute als SIV bekannt (für "simian immunodeficiency virus" - Affenimmunschwächevirus).
Ein neuer, mit HTLV-IV bezeichneter Humanvirus wurde aus scheinbar gesunden Individuen in Westafrikan isoliert (Kanki et al., Science (1986) 232: 238-243). Dieser Virus, der retrovirusartige Teilchen in infizierten Zellen erzeugt, weist Wachstumseigenschaften und wichtige Virusproteine auf, die denen von HTLV-III/LAV und STLV-III ähneln. Aus serologischen Daten ging hervor, daß HTLV-IV enger mit STLV-IIIAGM als mit den prototypischen HTLV-III/LAV-Isolaten aus Patienten in Europa und den Vereinigten Staaten verwandt ist.
In letzter Zeit wurden AIDS-Fälle bei westafrikanischen Patienten identifiziert. Obwohl die Individuen klassische AIDS-Symptome aufwiesen, konnten in den Patientenseren keine nachweisbaren Titer von Antikörpern gegen bekannte HIV- Antigene festgestellt werden. Aus den westafrikanischen Patienten wurde jedoch ein ursprünglich LAV-2 genannter Retrovirus isoliert, der strukturell und biologisch mit HIV verwandt ist (Clavel et al., Science (1986) 233: 343-346). Der westafrikanische Virus, der inzwischen aus einer Reihe von symptomfreien AIDS- und ARC-Patienten isoliert wurde, ist heute als HIV-2 bekannt, um ihn von den HIV- (jetzt HIV-1-) Isolaten zu unterscheiden, die seinerzeit als das ätiologische AIDS-Agens in Europa, Nordamerika und Zentralafrika identifiziert wurden (Clavel et al., N. Eng. of Med. (1987) 316: 1180-1185; Guyader et al., Nature (1987) 326: 662-669).
Wie HTLV-IV ist HIV-2 enger mit SIV als mit HIV-1 verwandt. HIV-2 und HTLV-IV sind jedoch nicht dasselbe Virus, da HIV-2 in vitro infizierte humane T-Helferzellen abtötet, was bei HTLV-IV nicht der Fall ist.
Die kürzlich veröffentlichte, vollständige Nukleotidsequenz von HIV-2 (Guayder et al., oben) weist eine genetische Sequenzhomologie mit HIV-1 von nur 42 % auf. Signifikante Unterschiede treten bei fast allen Virusproteinen auf, sind jedoch am stärksten in den von den HIV-1- und HIV-2-env-Genen (Hüllgenen) codierten Glykoproteinen ausgeprägt. Überhaupt scheinen die HIV-2-env-Gen-Glykoproteine enger mit denen von SIV als von HIV-1 verwandt zu sein.
Die Frage der fehlenden serologischen Kreuzreaktivität zwischen HIV-1 und HIV-2 ist überaus wichtig für die Entwicklung von Diagnosetests zum HIV-2-Infektionsnachweis sowie von Vakzinen dagegen. Aus Untersuchungen geht hervor, daß die Patienten mit HIV-2-Infektionen nicht durch serologische Tests zum Nachweis von HIV-1 identifiziert wurden. Alle bei den beiden Viren allgemein beobachteten Kreuzreaktionen werden durch Antikörper vermittelt, die mit gewöhnlichen Epitopen auf die wichtigsten, durch das gag-Gen (gruppenspezifisches Antigen) der beiden Viren codierten Kernproteine p25 und p26 wirken. Antikörper gegen die Virushüllen-Glykoproteine pg120 und gp41 und ihren Präkursor gp160 von HIV-1 zeigen keine Kreuzreaktion mit den Hüllenglykoproteinen von HIV-2 (Clavel et al., Science (1986) 233: 343-346; Clavel et al., N. Engl. J. Med. (1987) 316: 1180- 1185). Gegenwärtig verfügbare Tests zum Nachweis von HIV-1, die hauptsächlich auf dem Nachweis von Antikörpern gegen die HIV-1-Glykoproteine beruhen, z. B. gp160/gp120/gp41 und deren Abschnitte, können nicht zum Nachweis von Antikörpern gegen HIV-2 in Proben für Diagnose- und Untersuchungszwecke eingesetzt werden. Folglich sollten spezifische HIV-2- Antigene zusammen mit HIV-1-Antigenen in Reagenzien zum wirksamen diagnostischen und therapeutischen Einsatz aufgenommen werden.
Die gegenwärtig zum HIV-2-Infektionsnachweis entwickelten Verfahren messen im allgemeinen die Virusexposition durch den Nachweis und die Quantifizierung von Antikörpern gegen HIV-2-Antigene in Blut, Seren und Blutderivaten. Solche Tests können zur Unterstützung der Diagnose von AIDS und ARC (AIDS- verwandter Komplex) und zur Untersuchung von Blut- und Blutprodukten auf eine zurückliegende Exposition gegenüber HIV-2 eingesetzt werden.
Zu den gegenwärtigen Versuchen, HIV-2-Infektionen zu diagnostizieren und Blut auf Exposition gegenüber HIV-2 zu untersuchen, gehören "enzyme-linked immunosorbent assay"- (ELISA-) Techniken (enzymgekoppelte Immunabsorptionstest) zum Nachweis der Anwesenheit von Antikörpern gegen immunogene HIV-2-Komponenten in einer Probe. Bei anderen Verfahren können Western-Blot-Techniken zum Nachweis von HIV-2-spezifischen Antikörpern in Proben eingesetzt werden. Im allgemeinen läßt sich nahezu jede brekannte Immuntest, wie z. B. Radioimmunanalysen, durch Verwendung spezifischer Reagenzien für den Nachweis von HIV-2 und Antikörpern dagegen anpassen.
Antigene für diese Tests können u. a. HIV-2-Proteine, die aus HIV-2-infizierten T-Zellenlinien gewonnen werden, und durch rekombinante DNS-Techniken produzierte Antigene sein. Die Verwendung von Antigenen aus diesen Herkunftsquellen bringt jedoch signifikante Nachteile mit sich.
Schon die Produktion von HIV-2 in kontinuierlichen Zellinien muß in Sicherheitslabors (P3-Containment) wegen der Gefahren einer möglichen gesundheitsschädigenden Virusexposition für das Untersuchungspersonal durchgeführt werden. Da falsche Negativ- und falsche Positivergebnisse bei ELISA- Tests unter Verwendung aus Zellinien gewonnenen Ganzvirus- HIV-1-Antigenen berichtet wurden, besteht außerdem die Wahrscheinlichkeit, daß ähnlich unzuverlässige Ergebnisse mit HIV-2-Antigenen erzielt werden, die aus Zellen gewonnen werden. Western-Blot-Analysen, bei denen für den HIV-2-Nachweis elektro-geblottete Ganzvirus-Antigene verwendet werden, mögen zwar zu einer höheren Spezifität führen, sind jedoch komplizierter und zeitaufwendiger als ELISA-Tests. Da HIV-2- produzierende Zellen humanen Ursprungs sind, kann weiterhin das aus diesen Zellinien gewonnene Virus-Antigenpräparat bei fehlender erschöpfender Reindarstellung mit normalen Zellantigenen, wie z. B. HLA-Antigenen, kontaminiert sein, was bei einem ELISA-Test falsche Positivreaktionen hervorrufen könnte.
Eine erschöpfende Reindarstellung von Virusantigenen aus Zellinien kann durchaus auch die Immunogenität immunologisch wichtiger Proteine zerstören oder Antigene anderweitig deaktivieren und damit Reagenzien erzeugen, die zu falschen Negativreaktionen führen. Überdies können falsche Negativreaktionen unter Verwendung von lebendvirus-derivierten Antigenen aufgrund einer sterischen Hinderung zustande kommen, bei der Antikörper nicht mit ihren spezifischen Antigenen reagieren können, weil die Reaktion durch die Anwesenheit anderer Antigene und Antikörper im Reaktionsgemisch blockiert wird.
ELISA-Tests zum Nachweis der HIV-2-Infektion können auch immunologisch wichtige Virusproteine nutzen, die von den Klonierungsabschnitten des HIV-2-Genoms in Bakterien erzeugt werden. Die vollständige Nukleotidsequenz von HIV-2 wurde jetzt beschrieben (Guyander et al., Nature (1987) 326: 662- 669), wobei die Gen-Codierung für verschiedene HIV-2-Proteine durch Vergleich mit homologen HIV-1-Genen festgestellt wurde. Die durch die env- und gag-Gene von HIV-2 codierten Virushüllen-Glykoproteine bzw. Kernproteine sind offenbar die Antigene, die von den Antikörpern in den Seren von HIV-2-infizierten Patienten rekognosziert werden.
Immunologisch wichtige HIV-2-Antigene, wie z. B. gp160 und dessen Spaltprodukte gp120 und gp41, die in der Virushülle vorhanden sind, können von Klonierungsabschnitten des HIV-2-Genoms in verschiedenen Expressionssystemen wie Bakterien, Hefe oder Vakzinen hergestellt werden. Solche rekombinanten Antigene können in der Diagnose und als potentielle Impfstoffe verwendet werden, wie dies bereits für HIV- 1-Proteine erfolgte (siehe z. B. Cabradilla et al.; Biotechnology (1986) 4: 128-133; Chang et al., Biotechnology (1985) 3: 905-909; Putney et al., Science (1986) 234: 1392- 1395; Kieny et al., Biotechnolooy (1986) 4: 790-795). Durch rekombinante DNS-Verfahren produzierte HIV-2-Antigene bedürfen jedoch noch immer einer erschöpfenden Reindarstellung, um falsche Positivreaktionen im ELISA-Test infolge einer Antikörperreaktivität auf Antigene des Expressionssystems zu vermeiden, die das HIV-2-Antigenpräparat möglicherweise kontaminieren. Außerdem kann durch eine Denaturierung von HIV-2-Antigenen während der Purifikation wichtige Antigenaktivität zerstört werden.
Zwar können durch rekombinante Techniken produzierte HIV-2-Antigene eine Verbesserung gegenüber Antigenen darstellen, die aus virusinfizierten Zellkulturen gewonnen werden; es ist jedoch möglich, daß die rekombinanten Proteine trotzdem keine Reagenzien für eine möglichst genaue Diagnose darstellen. Aufgrund der Art der Krankheit und des Bedarfs an genauen Ergebnissen müssen andere Reagenzien entwickelt werden, um sich einer 100-%igen Genauigkeit in der Diagnose von HIV-2 anzunähern.
Protein-Antigene enthalten eine Reihe von Epitopen oder Antigendeterminanten, bei denen es sich um die Proteinbereiche mit den Bindungsstellen für spezifische Antikörper handelt. Im allgemeinen enthalten Protein-Antigene 5 bis 10 Epitopen, die jeweils eine Sequenz von 6 bis 8 Aminosäuren enthalten. Epitopen können entweder kontinuierlich sein, wobei die 6 bis 8 Aminosäuren in linearer Sequenz vorhanden sind, oder diskontinuierlich, wobei die das Epitop bildenden Aminosäuren durch die dreidimensionale Faltung des Proteins zusammengeführt werden. Obwohl ein Epitop nur relativ wenige Aminosäuren aufweist, wird seine Reaktivität mit einem Antikörper von den Aminosäuren im Protein beeinflußt, die das Epitop umgeben.
Untersuchungen mit dem Ziel, Antigenstellen oder Epitope von Proteinen abzubilden, wurden durch die Verwendung synthetischer Peptide unterstützt, die den verschiedenen Bereichen der interessierenden Proteine entsprechen (siehe z. B. Lerner et al. in: The Biology of Immunological Disease: A Hospital Practice Book, (1983) Dixon und Fisher, Hrsg., S. 331-338; Lerner Adv. Immunol. (1984) 36: 1). Neben ihrer Nützlichkeit in Abbildungsuntersuchungen für Epitopen können synthetische Peptide, wenn sie wichtige Antigendeterminanten eines Proteins einschließen, potentiell als immunogene Stoffverbindungen, einschließlich Vakzine und Diagnosereagenzien, verwendet werden. Synthetische Peptid-Antigene haben mehrere Vorteile in Bezug auf die Produktion spezifischer Antikörper und die Reaktivität. Die genaue Sequenz des synthetisierten Peptids kann aus der Aminosäuresequenz ausgewählt werden, so wie sie tatsächlich durch Ordnen der Aminosäuren eines Proteins bestimmt oder aus der DNS-Sequenzcodierung für das Protein vorausgesagt wird. Durch Verwendung spezifischer synthetischer Peptide entfällt die Notwendigkeit, das Protein in voller Länge bei der Produktion oder dem Test auf spezifische Antikörper einzusetzen. Außerdem erlauben die Peptidsynthesetechniken in der Festphase nach Merrifield und Mitarbeitern, im wesentlichen unbegrenzte Mengen des interessierenden synthetisierten Peptids chemisch herzustellen (siehe z. B. Erickson und Merrifield in: The Proteins, 3. Edit. (1976), Vol. 2, Academic Press, New York, Kapitel 3). Die Verfügbarkeit automatischer Peptid-Synthesegeräte hat diese Techniken weiter gefördert.
Synthetische Peptid-Antigene, die Bereichen immunologisch wichtiger Proteine von HIV-2 entsprechen, könnten unmittelbar in Diagnoseverfahren und als potentielle Vakzine für HIV-2 verwendet werden.

Zusammenfassende Beschreibung der Erfindung

Erfindungsgemäß wird ein neues synthetisches Peptid geschaffen, das einem antigenisch wirkenden HIV-2-Protein entspricht und in selektiven Diagnoseverfahren zum Nachweis von HIV-2-Infektionen dient.
Ein neues synthetisches Peptid-Antigen, das einem Abschnitt des durch das HIV-2-env-Gen codierten Glykoproteins gp41 entspricht, wurde jetzt ermittelt. Das Peptid eignet sich zur Diagnose von AIDS, verursacht durch HIV-2-Infektion, in verdächtigen Individuen und in Verfahren zur Untersuchung der HIV-2-Exposition in Blut und Blutderivaten mit einem hohen Grad von Zuverlässigkeit und Spezifität.
Das Peptid kann in Nachweisverfahren für Antikörper gegen HIV-2 in Proben verwendet werden. Zu den Verfahren gehört das In-Kontakt-bringen der Probe mit den Peptid-Antigenen unter Bedingungen, die die Bildung eines immunologischen Komplexes zwischen dem Peptid und etwaigen, in der Probe vorhandenen HIV-2-spezifischen Antikörpern ermöglichen. Eine Messung der gegebenenfalls erfolgten Komplexbildung mit geeigneten Nachweismitteln zeigt die Anwesenheit oder das Fehlen von Antikörpern gegen HIV-2 in der Probe an.
Das neue Peptid kann auch als Immunogen in Vakzinen zur Immunisierung gegen eine HIV-2-Infektion oder zur Produktion von HIV-2-spezifischen Antikörpern gegen HIV-2-Antigene in Tieren verwendet werden.

Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung schafft ein Peptid, das einem Bereich des Transmembran-Hüllenglykoproteins gp41 von HIV-2 entspricht, und das synthetisiert und auf Immunoreaktivität gegen HIV-2-positive Serumproben geprüft wurde. Das neue Peptid eignet sich zur Verwendung in Tests zur Diagnose der HIV- 2-Infektion oder einer zurückliegenden Exposition gegenüber dem Virus sowie als Immunogen in Stoffzusammensetzungen zum Anregen der Produktion von Antikörpern gegen HIV-2 in Tieren einschließlich Menschen. Das erfindungsgemäße Peptid weist eine Aminosäuresequenz auf, die mindestens ein kontinuierliches (lineares) Epitop enthält, das mit den HIV-2-spezifischen Antikörpern reaktionsfähig ist.
Somit schließt die Erfindung ein immunologisch reaktives Peptid und dessen funktionell äquivalente Varianten ein, die die Antigeneigenschaften des Peptids, das einem Bereich des durch das env-Gen von HIV-2 codierten gp41 entspricht, nicht wesentlich beeinflussen. Das Peptid wurde mit bekannten Peptidsynthesetechniken in der Festphase synthetisiert (siehe z. B. Merrifield und Barany, The Peptides: Analysis, Synthesis Biology (1980), Vol. 1, Gross und Meinenhofer, Hrsg., Academic Press, New York, Kapitel 1). Die Synthese ermöglicht es auch, eine oder zwei nicht der ursprünglichen Proteinsequenz entsprechende Aminosäuren der Amino- oder Carboxylendgruppe des Peptids zuzufügen. Solche zusätzlichen Aminosäuren eignen sich zum Koppeln des Peptides an ein anderes Peptid, ein größeres Trägerprotein oder einen Träger. Zu den für diese Zwecke geeigneten Aminosäuren gehören Tyrosin, Lysin, Glutaminsäure, Asparginsäure, Cystein und deren Derivate. Zusätzliche Protein-Modifikationstechniken können verwendet werden, z. B. NH&sub2;-Acetylierung oder COOH-Endgruppen-Amidierung, um zusätzliche Mittel zum Koppeln des Peptids an ein anderes Peptid oder Peptidmolekül oder an einen Träger bereitzustellen.
Die neue Peptidsequenz ist nachstehend aufgeführt:
worin X entweder ein H der Amino-NH&sub2;-Endgruppe des Peptids oder eine zusätzliche, an die Amino-NH&sub2;-Endgruppe des Peptids gebunden Aminosäure ist, wobei die zusätzliche Aminosäure ausgewählt wird, um die Kopplung des Peptids an ein Trägerprotein zu erleichtern; Y fehlt oder Cys ist; und Z OH oder NH&sub2; ist.
Das Peptid H2-41A5 wird durch die Nukleotidsequenz des HIV-2-Genoms codiert, die die Basispaare (bp) 7908 bis 7978 umfaßt (Numerierung nach Guyader et al., Nature (1987) 326: 662-669), wobei es sich um einen Bereich der env-Gencodierung für gp41 handelt. Besonders bevorzugt ist ein Peptid H2-41A5, bei dem X H, Y Cys und Z OH ist.
Das Peptid kann in Verfahren zum Nachweis von Antikörpern gegen HIV-2 oder HIV-2-assoziierte Antigene verwendet werden. Vorzugsweise gehört zu den Verfahren, bei denen das Peptid zum Nachweis der Anwesenheit von HIV-2-spezifischen Antikörpern in der Probe verwendet wird, das In-Kontakt-bringen der Probe mit dem Peptid unter Bedingungen, unter denen die Bildung eines immunologischen Komplexes zwischen dem Peptid-Antigen und etwaigen Antikörpern gegen HIV-2 möglich ist, die eventuell in der Probe vorhanden sind. Die gegebenenfalls erfolgte Bildung eines immunologischen Komplexes als Anzeichen für die Anwesenheit von Antikörpern gegen HIV-2 in der Probe wird anschließend nachgewiesen und mit geeigneten Mitteln gemessen.
Zu solchen Verfahren gehören u. a. homogene und heterogene Bindungsimmuntests, wie z. B. Radioimmuntests (RIA), ELISA- und Western-Blot-Analysen. Weiterhin gestatten es die das neue Peptid verwendenden Testprotokolle, Untersuchungen konkurrierender und nicht konkurrierender Bindungen durchzuführen.
Je nach verwendeter Testart kann das Peptid markiert (signalerzeugend) oder unmarkiert sein. Markierungen, die an die Peptide gekoppelt werden können, sind die bekannten Markierungen, wozu u. a. Enzyme, Radionukleide, fluorogene und chromogene Substrate, Cofaktoren, Biotin/Avidin, Kolloidgold und magnetisches Pulver gehören. Durch Modifikation des neuen Peptids wird eine durch bekannte Mittel erfolgende Kopplung an Trägerproteine oder -peptide oder an bekannte Träger möglich, z. B. Polystyren- oder Polyvinyl-Mikrotiterplatten, Glasröhren oder Glasperlen und chromatographische Träger, wie z. B. Papier, Cellulose und Cellulosederivate sowie Siliciumdioxid (Kieselerde).
Bevorzugte bekannte Testtechniken, besonders für klinische Massenuntersuchungen von Patientenseren und Blut sowie Blutderivaten sind ELISA- und Western-Blot-Techniken, wobei die ELISA-Tests besonders bevorzugt sind. Die ELISA-Tests unter Verwendung des vorstehend beschriebenen Peptids H2-41A5 beruhen auf den gegenwärtigen Tests, bei denen aus Humanzellen oder durch rekombinante DNS-Techniken gewonnene HIV-1- Proteine oder deren Abschnitte als Antigene verwendet werden.
Für die Verwendung als Reagenzien in diesen Tests läßt sich das Peptid H2-41A5 leicht an die Innenfläche von Mikrotiterlöchern binden. Das Peptid kann direkt an das Mikrotiterloch gebunden werden. Es wurde jedoch festgestellt, daß sich eine maximale Bindung des Peptids an die Löcher dadurch erzielen läßt, daß die Löcher vor der Peptidzugabe mit Polylysin vorbehandelt werden. Außerdem kann das Peptid H2-41A5 durch bekannte Mittel kovalent an ein Trägerprotein, wie z. B. BSA, angefügt werden, wobei das resultierende Konjugat zum Beschichten der Löcher verwendet wird. Im allgemeinen wurde das Peptid zum Beschichten in einer Konzentration von 10 bis 100 ug/ml verwendet.
Die auf Antikörper gegen HIV-2 zu testenden Proben werden dann in die peptidbeschichteten Löcher eingebracht, in denen sich ein immunologischer Komplex bildet, wenn Antikörper gegen HIV-2 in der Probe vorhanden sind. Ein signalerzeugendes Mittel kann zusätzlich verwendet werden, um den Nachweis der Komplexbildung zu vereinfachen. Es wird ein nachweisbares Signal erzeugt, wenn HIV-2-spezifische Antikörper in der Probe vorhanden sind.
Im weiteren wird die Erfindung näher anhand der nachfolgenden spezifischen Beispiele veranschaulicht, die jedoch keinesfalls den Schutzumfang der Erfindung einschränken sollen.

Beispiel 1

Für die Synthese des Peptids H2-42A5 wurde ein Peptid- Synthesegerät Modell 430 A der Firma Applied Biosystems eingesetzt. Bei der Synthese wurde ein p-Methylbenzylhydrylamin- Trägerharz in der Festphase verwendet (Peptides International, Louisville, Kentucky). Das Peptid H2-41A5 wurde entsprechend The Users Manual for Peptide Synthesizer Model 430A, Applied Biosystems, 1986, synthetisiert. Alle für die Synthese verwendeten Aminosäuren enthielten t-Butyl-Carbonylgruppen (t-Boc) zum Schutz der α-NH&sub2;-Gruppe und wurden von der Novabiochem AG, Schweiz, bezogen. Aminosäuren mit reaktiven Seitenkettengruppen enthielten zusätzliche Schutzgruppen, um unerwünschte und unwillkommene Seitenkettenreaktionen zu verhindern. Die für die Synthese des Peptids H2-41A5 verwendeten einzelnen geschützten Aminosäuren wurden aus den in Tabelle 1 aufgeführten ausgewählt. Boc-Glu(OBzl)- OH, Boc-Ile-OH 1/2 H&sub2;O, Boc-Lys(2-Cl-Z)-OH (cryst.), Boc-Met- OH und Boc-Tyr-(2-Br-Z-)-OH wurden bei der Synthese des Peptids H2-41A5 nicht eingesetzt. Tabelle 1 Bei der Peptidsynthese verwendete Aminosäuren Boc-Trp (Formyl)-OH Tos = Tosyl oder p-Toluen-Sulfonsäure OBzl = Benzyloxy pMeOBzl = p-Methylbenzyloxy 2-Cl-Z = Carbobenzoxychlorid 2-Br-Z = Carbobenzoxybromid
Nach Abschluß der Synthese wurden die Schutzgruppen aus dem synthetisierten Peptid entfernt, und das Peptid wurde vom Festträgerharz durch Behandlung mit nicht wäßriger Fluorwasserstoffsäure (HF) in Kombination mit 10 % Anisol und 10 % Dimethylsulfid als Spülmittel bei 0 ºC abgespalten. 2 % Thiocresol wurde als zusätzliches Spülmittel zugegeben, da H2-41A5 ein cysteinhaltiges Peptid ist. Nach der Abspaltung wurde die HF in der Probe in einem N&sub2;-Strom ausgespült, und etwaige Rest-HF wurde aus der Probe im Vakuum bei 0 ºC entfernt. Das Peptid wurde aus dem Harz durch Behandlung mit Trifluoressigsäure (TFA) extrahiert, die anschließend durch Verdampfen bei Raumtemperatur entfernt wurde. Nach dem Entfernen der TFA wurde das Peptid ausgefällt und mit wasserfreiem Ether ausgewaschen.
Vor der Verwendung in spezifischen Tests kann das Peptid bei Bedarf durch Hochleistungs-Flüssigchromatographie (HPLC) mit Phasenumkehr weiter gereinigt werden. Eine besonders geeignete Säule für diese Reindarstellung ist die Umkehrphasensäule Vydek C-18, bei der ein Wasser-(TFA)-Acetonitril- (TFA)-Gradient zum Eluieren des Peptids verwendet wird.

Beispiel 2

Das Peptid H2-41A5 mit der Aminosäuresequenz Asp-Gln- Ala-Arg-Leu-Asn-Ser-Trp-Gly-Cys-Ala-Phc-Nrg-Gln-Val-Cys-His- Thr-Thr-Val-Pro-Trp-Val-Asn-Cys-OH wurde gemäß der Beschreibung in Beispiel 1 synthetisiert und in einem ELISA-Test zur Messung seiner immunologischen Reaktivität verwendet.
Polylysin in einer Konzentration von 1 mg/ml wurde auf die Mikrotiterplatten gegeben und 30 Minuten einwirken gelassen. Danach wurde das Polylysin entfernt, und Peptid H2- 41A5 in einer Konzentration von 10 bis 100 ug wurde in die Plattenlöcher zum Beschichten eingebracht. Nachdem das Peptid im Loch ausreichend lange eingewirkt hatte, um die Bindung des Peptids an das Loch zu ermöglichen, wurde die Peptidlösung entfernt und eine Glutaraldehydlösung zur Stabilisierung der Peptidanbindung an den Löchern 15 Minuten lang zugegeben. Anschließend wurde die Glutaraldehydlösung entfernt, die Löcher wurden mit einem Puffer ausgewaschen, und ein Gemisch aus Glycin und Rinderserumalbumin (BSA) wurde zugefügt, um ungebundene Stellen in den Löchern zu blockieren und eine nicht spezifische Bindung von Antikörpern während des eigentlichen ELISA-Tests auf ein Mindestmaß zu beschränken. Nach einem abschließenden Waschvorgang waren die Platten einsatzbereit.
Eine praktische Variante der bekannten ELISA-Verfahren kam mit den Mikrotiterplatten zum Einsatz, die gemäß vorstehender Beschreibung vorbereitet wurden. Serumproben aus Individuen in 50-facher Verdünnung in PBS (phosphatgepufferter Salzlösung) mit 0,05 % Polyoxyethylensorbitanmonolaurat (Tween 20) und 1 % BSA wurden in jedes Loch eingebracht und 90 Minuten bei 37 ºC in feuchter Atmosphäre einwirken gelassen. Dann wurden die verdünnten Serumproben von den Platten entfernt, und die Löcher wurden drei mal mit 0,05 % Tween 20-haltiger PBS ausgewaschen. Anschließend wurde ein konjugierter Antihuman- Ig-Antikörper in die Löcher gegeben und 90 Minuten lang einwirken gelassen. Der konjugierte Antikörper wurde in einer Ziege oder einem Kaninchen erzeugt und war spezifisch für humanes IgG, IgM, Immunoglobulin-Leichtketten oder deren Kombinationen. Vorzugsweise wurde beim ELISA-Test an alkalischer Phosphatase konjugiertes Antihuman-IgG (der Firma Dakopatts) in 500-facher Verdünnung zum Einsatz in PBS mit 0,05 % Tween 20 und 1 % BSA verwendet. Nachdem das Konjugat ausreichend lange eingewirkt hatte, um mit gebundenen humanen Antikörpern zu reagieren, wurden die Platten wie oben drei mal ausgewaschen. Zum Nachweis von Antikörpern gegen HIV-2 im Humanserum, die mit dem als Antigen verwendeten Peptid H2- 41A5 reagieren (d. h. Positivreaktionen), wurde ein in einem Na-Carbonat/MgCl-Puffer aufgelöstes und auf eine Konzentration von 1 ug/ml eingestelltes, an alkalischer Phosphatase chromagenisch wirkendes Substrat (Tabletten Nr. 104 nach Sigma Kat.) zugegeben, das durch die am Antihuman-Ig angelagerten Enzyme zu einem farbigen Produkt aufgespalten wurde. Nach etwa 40 Minuten Einwirken bei Raumtemperatur zeigten Positivreaktionen die Anwesenheit von Antikörpern in der Probe an, die mit dem Antigen reagierten. Eine die Positivreaktion anzeigende gelbe bis orangene bis rötlichbraune Färbung in jedem Loch wurde in einem Spektrophotometer bei 405 nm zur Quantifizierung der Reaktion untersucht. Die spektrophotometrischen Werte wurden zwecks Kompensation von Hintergrundreaktionen korrigiert.
Das Peptid H2-41A5 wurde in parallelen ELISA-Tests mit 6 positiv auf Antikörper gegen HIV-2 reagierenden Serumproben (bezogen von Dr. G. Biberfelt, SBL, Stockholm, Schweden), 10 positiv auf Antikörper gegen HIV-1 reagierenden Serumproben und 6 HIV-1/HIV-2-negativen Seren eingesetzt. Wie aus Tabelle 2 hervorgeht, reagierten 6 von 6 der bestätigt positiven HIV- 2-Serumproben (100 %) mit dem Peptid H2-41A5. Die Tabelle zeigt außerdem, daß keine der HIV-1-positiven Serumproben und keines der negativen Seren mit H2-41A5 reagierte.
Aus den vorstehend aufgeführten Ergebnissen wird deutlich, daß das beschriebene, neue synthetische Peptid H2-41A5, das einem Bereich des durch das env-Gen codierten HIV-2-Glykoproteins gp41 entspricht, klar ein eindeutiges Reagens zum sensitiven und selektiven Test auf die Anwesenheit von Antikörpern gegen HIV-2 schafft. Tabelle 2 Anhand von ELISA-Tests bestimmte Immunoreaktivität des Peptids H2-41A5 auf HIV-2, positive HIV-1- sowie positive und negative Serumproben Bestätigtes HIV-2-positives Serum, Probe Nr. Optische Dichte bei 405 nm* Bestätigtes HIV-1-positives Serum, Probe Nr. Negatives Serum, Probe Nr. * Das Peptid H2-41A5 wurde in einer Konzentration von 10 ug/ml beschichtet.

Claims

1. Antigen-Peptid der Formel:

X-Asp-Gln-Ala-Arg-Leu-Asn-Ser-Trp-Gly-Cys-Ala-Phe-Arg- Gln-Val-Cys-His-Thr-Thr-Val-Pro-Trp-Val-Asn-Y-Z,

worin X entweder ein H der Amino-NH&sub2;-Endgruppe des Peptids oder eine zusätzliche, an die Amino-NH&sub2;-Endgruppe des Peptids gebundene Aminosäure ist, wobei die zusätzliche Aminosäure ausgewählt wird, um die Kopplung des Peptids an ein Trägerprotein zu erleichtern; Y fehlt oder Cys ist; und Z OH oder NH&sub2; ist.

2. Antigen-Peptid der Formel Asp-Gln-Ala-Arg-Leu-Asn-Ser- Trp-Gly-Cys-Ala-Phe-Arg-Gln-Val-Cys-His-Thr-Thr-Val-Pro- Trp-Val-Asn-Cys-OH.

3. Verfahren zum Nachweis von Antikörpern gegen HIV-2 in einer Probe, das aufweist:

In-Kontakt-bringen der Probe mit einem Peptid der Formel X-Asp-Gln-Ala-Arg-Leu-Asn-Ser-Trp-Gly-Cys-Ala-Phe-Arg- Gln-Val-Cys-His-Thr-Thr-Val-Pro-Trp-Val-Asn-Y-Z,

worin X entweder ein H der Amino-NH&sub2;-Endgruppe des Peptids oder eine zusätzliche, an die Amino-NH&sub2;-Endgruppe des Peptids gebundene Aminosäure ist, wobei die zusätzliche Aminosäure ausgewählt wird, um die Kopplung des Peptids an ein Trägerprotein zu erleichtern; Y fehlt oder Cys ist; und Z OH oder NH&sub2; ist, unter solchen Bedingungen, daß sich ein immunologischer Komplex zwischen dem Peptid und Antikörpern gegen HIV-2 bildet, wenn solche Antikörper in der Probe vorhanden sind, sowie

Messen der gegebenenfalls erfolgten Bildung des immunologischen Komplexes zum Bestimmen der Anwesenheit von Antikörpern gegen HIV-2 in der Probe.

4. Verfahren zum Nachweis von Antikörpern gegen HIV-2 in einer Probe, das aufweist:

In-Kontakt-bringen der Probe mit einem Peptid der Formel Asp-Gln-Ala-Arg-Leu-Asn-Ser-Trp-Gly-Cys-Ala-Phe-Arg-Gln- Val-Cys-His-Thr-Thr-Val-Pro-Trp-Val-Asn-Cys-OH, unter solchen Bedingungen, daß sich ein immunologischer Komplex zwischen dem Peptid und Antikörpern gegen HIV-2 bildet, wenn solche Antikörper in der Probe vorhanden sind, sowie

5. Stoffzusammensetzung zum Anregen der Produktion von Antikörpern gegen HIV-2 in Tieren einschließlich Menschen mit einer immunologisch wirksamen Menge eines Antigen- Peptids der Formel

worin X entweder ein H der Amino-NH&sub2;-Endgruppe des Peptids oder eine zusätzliche, an die Amino-NH&sub2;-Endgruppe des Peptids gebundene Aminosäure ist, wobei die zusätzliche Aminosäure ausgewählt wird, um die Kopplung des Peptids an ein Trägerprotein zu erleichtern; Y fehlt oder Cys ist; und Z OH oder NH&sub2; ist, sowie einem physiologisch verträglichen Träger.

6. Stoffzusammensetzung zum Anregen der Produktion von Antikörpern gegen HIV-2 in Tieren einschließlich Menschen mit einer immunologisch wirksamen Menge eines Antigen- Peptids der Formel

Asp-Gln-Ala-Arg-Leu-Asn-Ser-Trp-Gly-Cys-Ala-Phe-Arg-Gln- Val-Cys-His-Thr-Thr-Val-Pro-Trp-Val-Asn-Cys-OH sowie einem physiologisch verträglichen Träger.