DE3886032T2

DE3886032T2 - Hiv-1-verwandte polypeptide, diagnosesysteme und testverfahren.

Info

Publication number: DE3886032T2
Application number: DE3886032T
Authority: DE
Inventors: John Gnann; Michael Oldstone
Original assignee: Scripps Clinic and Research Foundation
Current assignee: Scripps Research Institute
Priority date: 1987-08-21
Filing date: 1988-08-19
Publication date: 1994-06-16
Anticipated expiration: 2008-08-20
Also published as: WO1989001494A1; JP2902658B2; FI891898A0; AU2302188A; NO891635L; FI95274B; FI95274C; NO177536B; DK193189A; NO177536C; EP0329761A1; EP0329761A4; DK173905B1; DK193189D0; EP0329761B1; DE3886032D1; AU614543B2; JPH02500597A; NO891635D0; FI891898A

Description

Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Polypeptidantigene, die mit dem Human-Immundefizienzvirus Typ 1 (HIV-1) in Zusammenhang stehen, und ihre Verwendung in diagnostischen Systemen und Testverfahren.

Hintergrund

Das erworbene Immundefizienzsyndrom (AIDS) hat sich nun weltweit verbreitet und scheint ein akutes Problem der öffentlichen Gesundheit zu sein, insbesondere in Afrika. Es ist gezeigt worden, daß AIDS durch ein Retrovirus, das als Human- Immundefizienzvirus Typ 1 (HIV-1) bezeichnet wird, aber zuvor als LAV, HTLV-III oder ARV bekannt war, in den verschiedenen durch die Epidemien betroffenen Gebieten, einschließlich Nordamerika, Westeuropa und Zentralafrika, verursacht wird.
Die Untersuchungen von HIV auf molekularer Ebene haben einige Unterschiede in der Nukleotidsequenz von nordamerikanischen und afrikanischen Isolaten gezeigt. Die nordamerikanischen, westeuropäischen und zentralafrikanischen Isolate scheinen jedoch ähnliche biologische Eigenschaften und antigenisch kreuzreaktive Proteine mit den gleichen relativen Molekularmassen zu haben.
Mit HIV-1-infizierte Individuen entwickeln Antikörper gegen die vom gag-Gen kodierten viralen Kernproteine, die als p19 und p24 bezeichnet werden, und ihr Vorläuferprotein, das als p55 bezeichnet wird. Weiterhin werden Antikörper gegen die vom env-Gen kodierten Hüllglykoproteine gp120 (das extrazelluläre Glykoprotein oder EGP), gp41 (das Transmembranprotein oder TMP) und deren Vorläuferglykoprotein, das als gp160 bezeichnet wird, beobachtet.
Eine große Anzahl von AIDS-Patienten zeigt ein Verschwinden der Antikörper gegen die HIV-1-Kernproteine in einem fortgeschrittenen Krankheitsstadium, behält jedoch Antikörper, die mit den Hüllantigenen immunreaktiv sind. Diese Hüllprodukte werden von Antikörpern regelmäßig in den Seren von Patienten in verschiedenen Stadien der HIV-1-Infektion nachgewiesen. Obwohl nur wenige Berichte über die Serokonversion bei HIV-1 verfügbar sind, scheint das Auftauchen von Antikörpern gegen die Hüllproteine dem Auftauchen von Antikörpern gegen die Kernproteine kurz voranzugehen. Siehe Carlson et al., Lancet, i: 361-362, (1987). Aus diesem Grund ist die Verwendung von Antigenen, die env-Genprodukte darstellen, von erheblicher Bedeutung für die Diagnose, mit AIDS verwandten Retroviren ausgesetzt zu sein.
Da AIDS durch Blutprodukte übertragen werden kann, ist es von der ursprünglichen Erkennung dieser Krankheit an ein starkes Bestreben gewesen, diagnostische Tests für das Durchmustern von Blut auf Antikörper oder Antigene, die für das infizierende Virus spezifisch sind, zu entwickeln. Die Bemühungen auf diesem Gebiet haben Früchte getragen, und bis Ende 1985 haben 5 Firmen eine Zulassung zur Vermarktung von Tests zum Nachweis von Antikörpern gegen HIV-1-Virus erhalten. Diese Tests verlassen sich für den Nachweis solcher Antikörper alle auf die Verwendung viraler Proteine, die aus kultivierten HIV-infizierten T-Lymphozyten erhalten werden. Das aus den kultivierten Zellen erhaltene Virus wird aufgebrochen (z. B. mit Detergens) und eine Flüssigkeit ("virales Lysat" genannt) erhalten. Dieses Lysat (das eine Vielzahl von Fragmenten viraler und zellulärer Proteine enthält) wird dann typischerweise als Festphasenbestandteil eines Immuntests verwendet.
Obwohl die bestehenden Tests die Übertragung von HIV-1 über Blutprodukte signifikant verringert zu haben scheinen, haben die Tests auf der Grundlage viraler Lysate einige signifikante Nachteile, einschließlich von Ergebnissen, die auf eine hohe Rate falsch positiver Ergebnisse hinweisen. Es wird angenommen, daß die falsch positiven Ergebnisse zum Teil auf die Gegenwart nicht-viraler Proteine in den viralen Lysatzubereitungen, die im Festphasenbestandteil der gegenwärtigen Tests verwendet werden, zurückzuführen sind.
Bei dem Versuch, die Rate falsch positiver Ergebnisse zu verringern, ist begonnen worden, Stellen-gerichtete serologische Tests zu entwickeln, die synthetische Polypeptide verwenden, die die natürlich auftretenden antigenen Determinanten auf viralen Proteinen nachahmen. Siehe beispielsweise das US-Patent Nr. 4,629,783 (Cosand); Wang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83 : 6159-6163 (1986), und Kennedy et al., Science, 231 : 1556-1559 (1986) beschreiben verschiedene Polypeptide, von denen gesagt wird, sie seien in der Lage, die antigenen Determinanten nachzuahmen, die durch verschiedene HIV-1-Proteine, einschließlich TMP (gp41), gebildet werden.
Genauer beschreibt das Patent von Cosand ein als Polypeptid 39 bezeichnetes Polypeptid mit 26 Aminosäureresten, dessen Sequenz von der TMP-Sequenz des von Wain-Hobson et al., Cell, 40 : 9-15 (1985), beschriebenen HIV-1-Isolates abgeleitet wurde. Das Cosand-Patent enthält Daten, die nahelegen, daß das Polypeptid 39 durch HIV-1 TMP induzierte Antikörper in Seren eines nicht-identifizierten geographischen Ursprungs nachweisen kann.
Das Peptid Nr. 8, von dem Wang et al., siehe oben, berichten, enthält 21 Aminosäurereste, die hinsichtlich der Sequenz den TMP-Resten 586-606 der von Ratner et al., Nature, 313 : 277-284 (1985), mitgeteilten Sequenz entsprechen. Nach Wang et al., kann das Polypeptid 8 anti-HIV-1-TMP-Antikörper in von Individuen innerhalb der Vereinigten Staaten gewonnenen Seren nachweisen. Weiter berichteten Wang et al., daß Analoge des Polypeptids 8, die eine konservative Substitution von Isoleucin durch Valin an Position 587 und von Lysin durch Arginin an Position 596 enthalten, wie sie in bestimmten Virusisolaten gefunden wird, die Bindung von Human-Antikörpern an solche Analoge nicht stark beeinflußt.
Kürzlich haben Gnann et al., J. Infect. Dis., 156 : 261-267 (1987) mitgeteilt, daß ein von der TMP-Aminosäuresequenz von Wiley et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 83 : 5038 (1986) abgeleitetes Polypeptid anti-HIV-1-TMP-Antikörper in Seren von praktisch 100% amerikanischer AIDS-Patienten, jedoch in nur ungefähr 84% der AIDS-Patienten aus Zaire nachweisen kann.
Zusätzlich zu ihrer Verwendung als diagnostische Reagenzien haben Fischinger et al., Cancer Res., 45 : 46945-6995 (1985) vorgeschlagen, daß synthetische Polypeptide als Impfstoffbestandteile für HIV verwendet werden können. Dieser Ansatz zur AIDS-Prophylaxe und -Therapie wird durch den Bericht von Chanh et al., EMBO, 5 : 3065-71 (1986) gestützt, wonach ein Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz, die den TMP-Resten 503 bis 532 der von Muesing et al., Nature, 313 : 450 (1985), mitgeteilten Sequenz eines HIV-1-Isolates entspricht, HIV- neutralisierende Antikörper in Kaninchen induzieren konnte. Gnann et al., J. Virol., 61 : 2639-41 (1987) berichteten über ein ähnliches Ergebnis bei Verwenden eines Polypeptides, das den Resten 598 bis 609 des HIV-1-Isolates von Wain-Hobson et al., 5.0., entspricht.

Kurze Zusammenfassung der Erfindung

Es sind zwei spezifische Polypeptide mit einer verbesserten Fähigkeit zum Nachweis von anti-HIV-1-Antikörpern in Körperproben von Zentralafrikanern entdeckt worden. Die vorliegende Erfindung betrifft daher ein Polypeptid, bestehend im wesentlichen aus 12 Aminosäureresten mit einer Aminosäuresequenz, die durch die Formel:
LGZWGCSGKHIC
dargestellt wird, wobei Z entweder Isoleucin oder Methionin ist.
Die Erfindung betrifft weiterhin eine Zusammensetzung, umfassend eine Mischung von mindestens zwei Polypeptiden, worin ein erstes dieser Polypeptide eine Aminosäuresequenz der Formel:
LGZWGCSGKHIC
hat, wobei Z entweder Isoleucin oder Methionin ist, und ein zweites dieser Polypeptide mit durch ein Human-Immundefizienzvirus induzierten Antikörpern eine Immunreaktion eingehen kann.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zum Testen auf die Gegenwart von anti-HIV-1-Antikörpern in einer Körperflüssigkeitsprobe. Durch Mischen einer Körperflüssigkeitsprobe mit einem Polypeptid der Formel:
LGZWGCSGKHIC,
wobei Z entweder Isoleucin oder Methionin ist, wird eine Immunreaktionsmischung gebildet.
Die Immunreaktionsmischung wird unter biologischen Testbedingungen für einen Zeitraum aufbewahrt, der für jeden in der Probe vorhandenen anti-HIV-1-Antikörper ausreichend ist, eine Immunreaktion mit dem Polypeptid einzugehen und ein Polypeptid-haltiges Immunreaktionsprodukt zu bilden.
Die Gegenwart jedes Polypeptid-haltigen Immunreaktionsproduktes, das sich gebildet hat, wird dann bestimmt, und dadurch die Gegenwart von anti-HIV-1-Antikörpern in der Probe.
In einer weiteren Ausführungsform umfaßt ein Verfahren zum Testen auf die Gegenwart von anti-HIV-Antikörpern in einer Körperflüssigkeitsprobe das Bilden einer Immunreaktionsmischung durch Mischen einer flüssigen Körperprobe mit einer Zusammensetzung, die in Mischung mindestens zwei Polypeptide enthält, wobei ein erstes der Polypeptide eine durch die Formel:
LGZWGCSGKHIC
dargestellte Aminosäuresequenz hat, wobei Z entweder Isoleucin oder Methionin ist, und ein zweites dieser Polypeptide entweder
LGLWGCSGKLIC,
LGIWGCSGKLIC, oder
NSWGCAFRQVC
ist.
Die so gebildete Immunreaktionsmischung wird unter biologischen Testbedingungen für einen Zeitraum aufbewahrt, der für alle in der Probe vorhandenen anti-HIV-1-Antikörper ausreichend ist, eine Immunreaktion mit einem Polypeptid der Zusammensetzung einzugehen und ein Polypeptid-haltiges Immunreaktionsprodukt zu bilden.
Die Gegenwart von Polypeptid-haltigem Immunreaktionsprodukt, das sich gebildet hat, wird dann bestimmt, und dadurch die Gegenwart von anti-HIV-Antikörpern in der Probe.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein diagnostisches System in Kit-Form zum Testen auf die Gegenwart von anti-HIV-1-Antikörpern in einer Körperflüssigkeitsprobe, umfassend eine Packung, die ein Polypeptid der Formel:
LGZWGCSGKHIC
enthält, wobei Z entweder Isoleucin oder Methionin ist.
In einer weiteren Ausführungsform umfaßt das diagnostische System in Kit-Form zum Testen auf die Gegenwart von anti- HIV-Antikörpern in einer Körperflüssigkeitsprobe eine Packung, die mindestens zwei Polypeptide enthält, wobei ein erstes der Polypeptide die Formel:
LGZWGCSGKHIC
hat, wobei Z entweder Isoleucin oder Methionin ist; und ein zweites der Polypeptide entweder
LGLWGCSGKLIC,
LGIWGCSGKLIC, oder
NSWGCAFRQVC
ist.

Eingehende Beschreibung der Erfindung

A. Definitionen

Aminosäure: Alle hier erwähnten Aminosäurereste liegen in der natürlichen L-Konfiguration vor. Im Einklang mit der Standardnomenklatur für Polypeptide, J. Biol. Chem., 243: 3557-59 (1969), sind die Abkürzungen für Aminosäurereste die in der folgenden Konkordanztabelle gezeigten: KONKORDANZTABELLE SYMBOL AMINOSÄURE 1-Buchstaben-Code 3-Buchstaben-Code Tyr L-Tyrosin Gly Glycin Phe L-Phenylalanin Met L-Methionin Ala L-Alanin Ser L-Serin Ile L-Isoleucin Leu L-Leucin Thr L-Threonin Val L-Valin Pro L-Prolin Lys L-Lysin His L-Histidin GIn L-Glutamin Glu L-Glutaminsäure Trp L-Tryptophan Arg L-Arginin Asp L-Asparaginsäure Asn L-Asparagin Cys L-Cystein
Es sollte beachtet werden, daß alle Aminosäuresequenzen hier durch Formeln dargestellt werden, deren Links- nach Rechtsorientierung der konventionellen Richtung vom Aminoterminus zum Carboxyterminus entspricht. Weiter sollte beachtet werden, daß ein Gedankenstrich am Beginn oder am Ende einer Aminosäuresequenz eine Bindung an eine weitere Sequenz von einer oder mehreren Aminosäuren bis zu einer Gesamtzahl von ungefähr 50 Resten in der Polypeptidkette anzeigt.

Polypeptid und Peptid

Polypeptid und Peptid sind Ausdrücke, die hier austauschbar verwendet werden, um eine lineare Reihe von nicht mehr als ungefähr 50 Aminosäureresten zu bezeichnen, die miteinander durch Peptidbindungen zwischen den α-Amino- und Carboxygruppen benachbarter Reste verbunden sind.

Protein

Protein ist ein Ausdruck, der hier verwendet wird, um eine lineare Reihe von mehr als 50 Aminosäureresten zu bezeichnen, die miteinander wie in einem Polypeptid verbunden sind.

B. Polypeptide

Ein erfindungsgemäßes Polypeptid besteht im wesentlichen aus 12 Aminosäureresten mit einer durch die Formel
LGZWGCSGKHIC
dargestellten Sequenz, wobei Z entweder Isoleucin (I) oder Methionin (M) ist.
Die erfindungsgemäßen Peptide enthalten mindestens zwei Cysteinreste. Dementsprechend können die Peptide in verschiedenen oxidierten Formen existieren. Zusätzlich zu der monomeren Form, in der die Sulfhydrylgruppe der Cysteinreste reduziert ist, können dimere oder polymere Formen existieren, in denen die Sufhydrylgruppen von zwei oder mehr Peptidmolekülen oxidiert werden und Inter- und Intrapeptiddisulfidbindungen bilden. Weil die erfindungsgemäßen Polypeptide zwei Cysteinreste besitzen, können sie zyklische Monomere oder lineare oder zyklische Dimere und lineare Polymere verschiedener Längen bilden. Diese verschiedenen oxidierten Formen werden als Teil der Erfindung betrachtet und sind in die Ausdrücke "Polypeptide" und "Peptide" einbezogen.
Ein erfindungsgemäßes Polypeptid kann durch jede der dem Polypeptid-Fachmann bekannten Techniken synthetisiert werden, einschließlich rekombinanter DNA-Techniken. Verfahren der synthetischen Chemie, so wie die Festphasensynthese vom Merrifield-Typ, sind aus der Gründen der Reinheit, der Antigenspezifität, Freiheit von unerwünschten Nebenprodukten, Leichtigkeit der Produktion und ähnlichem, bevorzugt. Eine ausgezeichnete Zusammenfassung der vielen verfügbaren Verfahren kann in J.M. Steward und J.D. Young, "Solid Phase Peptide Synthesis", W.H. Freeman Co., San Francisco, 1969; M. Bodanszky, et al., "Peptide Synthesis", John Wiley&Sons, 2. Ausgabe, 1976 und J. Meienhofer, "Hormonal Proteins and Peptides", Band 2, Seite 46, Academic Press (New York), 1965 für Festphasen-Peptidsynthese und E. Schroder und K. Kubke, "The Peptides", Band 1, Academic Press (New York), 1965 für klassische Lösungssynthesen gefunden werden. Geeignete Schutzgruppen, die für solche Synthesen verwendbar sind, sind in den oben genannten Texten und in J.F.W. McOmie, "Protective Groups in Organic Chemistry", Plenum Press, New York, 1973 beschrieben.
Im allgemeinen umfassen diese Methoden die aufeinanderfolgende Addition von einem oder mehreren Aminosäurerest(en) oder geeignet geschützten Aminosäureresten zu einer wachsenden Peptidkette. Normalerweise wird entweder die Amino- oder Carboxylgruppe des ersten Aminosäurerestes durch eine geeignete, selektiv entfernbare Schutzgruppe geschützt. Eine davon verschiedene selektiv entfernbare Schutzgruppe wird für Aminosäuren verwendet, die eine reaktive Seitenkette, beispielsweise Lysin, enthalten.
Bei Verwendung einer Festphasensynthese als Beispiel, wird die geschützte oder derivatisierte Aminosäure über ihre ungeschützte Carboxyl- oder Aminogruppe an einen inerten festen Träger angeheftet. Die Schutzgruppe der Amino- oder Carboxylgruppe wird dann selektiv entfernt und die nächste Aminosäure in der Sequenz, deren komplementäre (Amino- oder Carboxyl-) Gruppe geeignet geschützt ist, wird zugemischt und unter Bedingungen umgesetzt, die für die Bildung einer Amidbindung mit dem bereits an den festen Träger angehefteten Rest geeignet sind. Die Schutzgruppe der Amino- oder Carboxylgruppe wird dann von diesem neu zugefügten Aminosäurerest entfernt und die nächste Aminosäure wird (geeignet geschützt) zugesetzt, und so weiter. Nachdem alle die gewünschten Aminosäuren in richtiger Reihenfolge verbunden worden sind, werden alle verbleibenden terminalen und Seitengruppen-Schutzgruppen (und der feste Träger) nacheinander oder gleichzeitig entfernt, um das endgültige Polypeptid zu ergeben.
Die erfindungsgemäßen Polypeptide enthalten ungefähr 12 Aminosäurereste, ausgenommen solche, an denen zusätzliche Reste an einem Ende zum Zweck des Bereitstellen eines "Linkers", durch den die erfindungsgemäßen Polypeptide bequem an eine Markierung oder eine feste Matrix oder einen Träger befestigt werden können, zugefügt worden sind. Marker, feste Matrizen und Träger, die mit dem erfindungsgemäßen Polypeptid verwendet werden können, werden im Folgenden beschrieben.
Aminosäurelinker haben gewöhnlich mindestens einen Rest und können 40 oder mehr Reste haben, öfter 1 bis 10 Reste, und umfassen keine Sequenzen, die Epitope von AIDS-induzierenden Viren nachahmen. Typische für Linker verwendete Aminosäurereste sind Tyrosin, Cystein, Lysin, Glutamin- und Asparaginsäure oder ähnliche. Weiter kann eine erfindungsgemäße Polypeptidsequenz sich von der natürlichen Sequenz dadurch unterscheiden, daß die Sequenz durch eine terminale NH&sub2;-Acylierung, z. B. Acetylierung, oder Thioglykolsäure-Amidierung, durch terminale Carboxyl-Amidierung, z. B. mit Ammoniak, Methylamin und ähnlichem, modifiziert ist.
Wenn das erfindungsgemäße Polypeptid über einen Linker an einen Träger gekoppelt ist, um das, was in der Technik als Träger-Haptenkonjugat bekannt ist, zu bilden, kann es Antikörper induzieren, die eine Immunreaktion mit HIV-1 eingehen und HIV-1 neutralisieren.

C. Polypeptidmischungen

Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine Zusammensetzung, die eine Mischung von mindestens zwei Polypeptiden umfaßt, wobei eines der Polypeptide eine Aminosäuresequenz hat, die durch die Formel:
LGZWGCSGKHIC
dargestellt wird, wobei Z entweder Isoleucin oder Methionin ist (d. h., es wird ausgewählt aus der Gruppe von p3 und p4, deren entsprechende Aminosäuresequenzen in Tabelle 1 gezeigt sind). Ein zweites der in der Mischung vorhandenen Polypeptide hat typischerweise eine Aminosäuresequenz, die einem Teil eines Proteins eines Virus entspricht, das AIDS verursacht oder damit in Zusammenhang steht, z. B. HIV-1, HIV-2 und ähnliche, und fähig ist, eine Immunreaktion mit durch das Protein induzierten Antikörpern einzugehen. Bevorzugt enthält die Zusammensetzung weiter in Mischung mindestens eines der Polypeptide p1, p2 und/oder p5, deren Aminosäuresequenz ebenfalls in Tabelle 1 gezeigt ist. Typischerweise sind die verschiedenen vorhandenen Polypeptide in ungefähr äquimolaren Mengen vorhanden. Tabelle 1 Bezeichnung Aminosäureseguenz Virus

D. Inocula und Verfahren zum Induzieren von HIV-1 neutralisierenden Antikörpern

Das Wort "Inoculum" in seinen verschiedenen grammatikalischen Formen wird hier zur Beschreibung einer Zusammensetzung verwendet, die ein pharmazeutisch akzeptables wäßriges Verdünnungsmittel umfaßt, das als einen aktiven Bestandteil für die Induktion von HIV-1 neutralisierenden Antikörpern ein Polypeptid mit einer durch die Formel:
LGBWGCSGKJIC
dargestellten Aminosäuresequenz enthält, wobei B entweder Isoleucin (I), Leucin (L) oder Methionin (M) ist und J entweder Histidin (H) oder Leucin (L) ist. Bevorzugte Polypeptide mit Aminosäuresequenzen, die durch die obige Formel dargestellt werden, sind p1, p2, p3 und p4. Wenn das erfindungsgemäße Inoculum in einer immunologisch wirksamen Menge verabreicht wird, induziert es Antikörper, die mit HIV-1 immunreagieren und HIV-1 neutralisieren.
Wenn ein Polypeptid zur Induktion von Antikörpern verwendet wird, muß verstanden werden, daß das Polypeptid allein verwendet werden kann oder mit einem Träger verbunden als ein Konjugat oder als ein Polypeptidpolymer, aber der Einfachheit des Ausdrucks halber werden die verschiedenen Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Polypeptide insgesamt mit dem Ausdruck "Polypeptid" und seinen verschiedenen grammatikalischen Formen bezeichnet.
Bei einem Polypeptid, das weniger als ungefähr 35 Aminosäurereste enthält, ist es bevorzugt, das Peptid zum Zweck der Induktion der Produktion von Antikörpern an einen Träger gebunden zu verwenden, wie bereits angemerkt.
Wie ebenfalls bereits festgestellt, können eine oder mehrere zusätzliche Aminosäurereste an die Amino- oder Carboxytermini des Polypeptides angefügt werden, um die Bindung des Polypeptides an einen Träger zu unterstützen. Cysteinreste, die an die Amino- oder Carboxytermini der Polypeptide gebunden werden, haben sich als besonders nützlich zum Bilden von Konjugaten über Disulfidbindungen herausgestellt. Andere in der Technik bekannte Verfahren zum Herstellen von Konjugaten können ebenfalls verwendet werden. Beispielhafte weitere Verbindungsverfahren umfassen die Verwendung von Michael-Additions-Reaktionsprodukten, Dialdehyden, so wie Glutaraldehyd, Klipstein et al., J. Infect. Dis., 147, 318-326 (1983) und ähnliche, oder die Verwendung der Carbodiimid-Technologie wie bei der Verwendung von wasserlöslichem Carbodiimid zur Bildung von Amidbindungen an den Träger. Für einen Übersichtsartikel über Proteinkonjugation oder -kopplung durch aktivierte funktionelle Gruppen, siehe Aurameas, et al., Scand. J. Immunol., Band 8, Anhang 1, 7, 7-23 (1978).
Nützliche Träger sind in der Technik gut bekannt und sind im allgemeinen selbst Proteine. Beispiele solcher Träger sind das Keyhole-Limpet-Hämocyanin (KLH), Edestin, Thyroglobulin, Albumine, beispielsweise Rinderserumalbumin (BSA) oder Humanserumalbumin (HSA), rote Blutzellen, beispielsweise Schaferythrozyten (SRBC), Tetanustoxoid, Choleratoxoid, Hepatitis B-Virus Kernteilchen oder immunogene Fragmente davon sowie Polyaminosäuren, beispielsweise poly(D-Lysin: D-Glutaminsäure) und ähnliche.
Die Wahl des Trägers hängt stärker von der letztendlichen Verwendung des Inoculums ab und beruht auf Kriterien, die nicht notwendigerweise zur vorliegenden Erfindung gehören. Beispielsweise sollte ein Träger ausgewählt werden, der keine nachteilige Reaktion in dem besonderen für die Inoculation (Impfung) vorgesehenen Säugetier hervorruft.
Das erfindungsgemäße Inoculum enthält eine effektive immunogene Menge eines erfindungsgemäßen Polypeptides, typischerweise als ein an einen Träger gebundenes Konjugat. Die effektive Menge Polypeptid pro Dosiseinheit hängt neben anderen Dingen von der Art des geimpften Säugetieres, dem Körpergewicht des Säugetieres und dem gewählten Impfplan ab, wie in der Technik gut bekannt ist. Die Inocula enthalten typischerweise Polypeptidkonzentrationen von ungefähr 10 ug bis ungefähr 500 mg pro Inoculation (Dosis), bevorzugt ungefähr 50 ug bis ungefähr 50 mg pro Dosis.
Der Ausdruck "Dosiseinheit", wie er die erfindungsgemäßen Inocula betrifft, bezeichnet physikalisch diskrete Einheiten, die als Einzeldosen für Tiere geeignet sind, wobei jede Einheit eine vorbestimmte Menge aktiven Materials enthält, die so berechnet ist, daß sie den gewünschten immunogenen Effekt in Verbindung mit dem erforderlichen Verdünnungsmittel, d. h., einem Träger oder Vehikel, hervorruft. Die Spezifikation für die neue Dosiseinheit eines erfindungsgemäßen Inoculums werden diktiert von und sind direkt abhängig von (a) den einzigartigen Merkmalen des aktiven Materials und dem besonderen immunologischen Effekt, der erreicht werden soll, und (b) den inhärenten Beschränkungen der Technik der Formulierung solch eines aktiven Materials für die immunologische Verwendung in Tieren und menschlichen Subjekten, wie im Detail hier offenbart wird, wobei diese Merkmale der vorliegenden Erfindung sind.
Inocula werden typischerweise aus den getrockneten festen Polypeptid-Konjugat durch Dispersion des Polypeptid-Konjugates in einem physiologisch verträglichen (annehmbaren) Verdünnungsmittel, beispielsweise Wasser, Kochsalzlösung oder Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung hergestellt, um eine wäßrige Zusammensetzung zu bilden.
Inocula können außerdem ein Adjuvans als Teil des Verdünnungsmittels umfassen. Adjuvanzien wie vollständiges Freund'sches Adjuvans (CFA) , unvollständiges Freund'sches Adjuvans (IFA) und Alaun sind in der Technik gut bekannte Materialien und sind kommerziell aus verschiedenen Quellen erhältlich.
Um HIV-1-Virus neutralisierende Antikörper zu induzieren, wird einem Säugetier, beispielsweise einer Maus, einem Kaninchen, einer Ziege, einem Pferd, einem Menschen oder ähnlichem, eine immunogene Menge eines erfindungsgemäßen Inoculums verabreicht, typischerweise durch subkutane oder intramuskuläre Injektion. Das Säugetier, dem das Inoculum verabreicht wurde (geimpftes Säugetier) wird dann für einen Zeitraum aufbewahrt, der für das als aktiver Bestandteil in dem Inoculum vorhandenen Polypeptid ausreichend ist, neutralisierende anti-HIV-1-Antikörper zu induzieren. Wenn gewünscht, können die so induzierten Antikörper geerntet und für die Vorbereitung von passiven Immunisierungen gegen HIV-1 oder in diagnostischen Tests und Systemen zum Nachweis von HIV-1-TMP in Körperproben verwendet werden.

E. Antikörper und Antikörperzusammensetzungen

Der Ausdruck "Antikörper" in seinen verschiedenen grammatikalischen Formen wird hier verwendet, um Immunglobulinmoleküle und immunologisch aktive Teile von Immunglobulinmolekülen, d. h., Moleküle, die eine Antikörperbindungsstelle oder ein Paratop enthalten, zu bezeichnen. Beispielhaft Antikörpermoleküle sind intakte Immunglobulinmoleküle, im wesentlichen intakte Immunglobulinmoleküle und jene Teile eines Immunglobulinmoleküles, die das Paratop enthalten, einschließlich jener Teile, die in der Technik als Fab, Fab', F(ab')&sub2; und F(v) bezeichnet werden.
Eine erfindungsgemäße Antikörperzusammensetzung ist dadurch charakterisiert, daß sie HIV-1 neutralisierende Antikörpermoleküle enthält, die mit einem Polypeptid der Formel:
LGBWGCSGKJIC
immunreagieren, wobei B entweder Isoleucin, Leucin oder Methionin, und J entweder Histidin oder Leucin ist. Bevorzugt ist das Polypeptid p3 oder p4. Die Antikörperzusammensetzung ist weiter charakterisiert als im wesentlichen frei von Antikörpern, die mit HIV-1-TMP verwandten Polypeptiden der Formel:
RILAVERYLKDQQLL, und CTTAVPWNASWS
immunreagieren.
Eine erfindungsgemäße Antikörperzusammensetzung wird typischerweise erzeugt, indem ein Säugetier mit einem erfindungsgemäßen Inoculum immunisiert und dadurch in dem Säugetier Antikörpermoleküle induziert werden, die die geeignete Polypeptid-Immunspezifität haben. Die Antikörpermoleküle werden dann aus dem Säugetier gesammelt und mittels gut bekannter Verfahren, beispielsweise Immunaffinitätschromatographie, im gewünschten Ausmaß isoliert. Die so erzeugte Antikörperzusammensetzung kann unter anderem in dem erfindungsgemäßen diagnostischen Verfahren und Systemen zum Nachweis von HIV-1 in einer Körperprobe verwendet werden.
Die erfindungsgemäßen Antikörperzusammensetzungen können im Vergleich mit natürlich auftretenden polyklonalen Antikörpern als oligoklonal beschrieben werden, da sie Paratope enthalten, die gegen relativ wenige Epitope gerichtet sind verglichen mit den von einem intakten HIV-1-TMP-Molekül dargebotenen Epitopen. Folglich binden die erfindungsgemäßen Antikörper an relativ wenige Epitope, die durch das Polypeptid nachgeahmt werden, während natürlich auftretende Antikörper, die gegen das gesamte TMP-Molekül erzeugt werden, an Epitope über das gesamte TMP-Molekül binden und als polyklonal bezeichnet werden.
Monoklonale Antikörperzusammensetzungen sind von der vorliegenden Erfindung ebenfalls erfaßt. Eine monoklonale Antikörperzusammensetzung enthält innerhalb nachweisbarer Grenzen nur eine Art von Antikörperbindungsstelle, die HIV-1-TMP effektiv binden kann. Eine erfindungsgemäße monoklonale Antikörperzusammensetzung weist daher typischerweise eine einzelne Bindungsaffinität für HIV-1-TMP auf, selbst wenn sie Antikörper enthalten mag, die andere Proteine als HIV-1-TMP binden können.
Geeignete Antikörper in monoklonaler Form, typischerweise ganze Antikörper, können unter Verwendung der von Niman et al., Proc. Natl. Sci., U.S.A., 80 : 4949-4953 (1983), beschriebenen Hybridomtechnologie hergestellt werden. Kurz gesagt wird zur Bildung von Hybridomen, von denen die monoklonale Antikörperzusammensetzung erzeugt wird, eine Myelom- oder andere sich selbst erhaltende Zellinie mit Lymphozyten verschmolzen, die aus der Milz eines mit einem erfindungsgemäßen Polypeptid hyperimmunisierten Säugetieres erhalten werden.
Es ist bevorzugt, daß die Myelomzellinie aus der gleichen Art stammt wie die Lymphozyten. Typischerweise ist eine Maus des Stammes 129 GIX&spplus; das bevorzugte Säugetier. Geeignete Mausmyelome für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung umfassen die Hypoxanthin-Aminopterin-Thymidin-empfindlichen (HAT)Zellinien P3X63-Ag8.653 und Sp2/0-Ag14, die von der ATCC, Rockville, MD, unter den Bezeichnungen CRL 1580 und CRL 1581 erhältlich sind.
Splenozyten werden typischerweise mit Myelomzellen unter Verwendung von Polyethylenglykol (PEG) 1500 verschmolzen. Die verschmolzenen Hybride werden aufgrund ihrer Empfindlichkeit gegen HAT selektioniert. Die die erfindungsgemäßen Antikörpermoleküle ausscheidenden Hybridome werden unter Verwendung des Enzym-gebundenen Immunadsorptionstests (ELISA), der im Beispiel 2 beschrieben ist, identifiziert.
Eine erfindungsgemäße monoklonale Antikörperzusammensetzung kann erzeugt werden, indem eine monoklonale Hybridomkultur, die ein ein Hybridom enthaltendes Nährmedium umfaßt, das Antikörpermoleküle einer geeigneten Polypeptidspezifität ausscheidet, initiiert wird. Die Kultur wird unter Bedingungen und über einen Zeitraum aufbewahrt, der für das Hybridom ausreichend ist, die Antikörpermoleküle in das Medium auszuscheiden. Das Antikörper-haltige Medium wird dann gesammelt. Die Antikörpermoleküle können weiter durch gut bekannte Verfahren isoliert werden.
Die für die Herstellung dieser Zusammensetzung nützlichen Medien sind sowohl in der Technik gut bekannt als auch kommerziell erhältlich und umfassen synthetische Kulturmedien, Inzuchtmäuse und ähnliche. Ein beispielhaftes synthetisches Medium ist Dulbecco's minimal essential medium (DMEM; Dulbecco et al., Virol. 8 : 396 (1959)), das mit 4,5 g/l Glucose, 20 mM G1utamin und 20% fötalem Kälberserum supplementiert ist. Ein beispielhafter Inzucht-Mäusestamm ist Balb/c.
Die mit den oben angegebenen Verfahren hergestellten monoklonalen Antikörperzusammensetzungen können beispielsweise für diagnostische und therapeutische Zwecke verwendet werden, bei denen die Bildung eines HIV-1-TMP-haltigen Immunreaktionsproduktes gewünscht wird.

F. Diagnostische Systeme

Das erfindungsgemäße diagnostische System in Kit-Form umfaßt in einer Menge, die für mindestens einen Test ausreichend ist, ein erfindungsgemäßes Polypeptid, Polypeptidmischung, Antikörperzusammensetzung oder monoklonale Antikörperzusammensetzung als verpacktes Reagens. Instruktionen für die Verwendung der verpackten Reagenzien werden typischerweise ebenfalls beigefügt.
So wie er hier verwendet wird, bezeichnet der Ausdruck "Verpackung" eine feste Matrix oder ein Material, beispielsweise Glas, Kunststoff, Papier, Folie oder ähnliches, das ein erfindungsgemäßes Polypeptid, eine erfindungsgemäßen Antikörperzusammensetzung oder monoklonalen Antikörperzusammensetzung innerhalb fester Grenzen halten kann. Eine Verpackung kann daher beispielsweise ein Glasröhrchen sein, das verwendet wird, um Milligram-Mengen eines beabsichtigten Polypeptides zu enthalten, oder es kann eine Mikrotiterplattenvertiefung sein, an der Mikrogramm-Mengen eines vorgesehenen Polypeptides funktionell befestigt worden sind, d. h., so verbunden sind, daß sie von einem Antikörper immunologisch gebunden werden können.
Die Instruktionen für die Verwendung umfassen typischerweise einen greifbaren Ausdruck, der die Reagenskonzentration oder mindestens einen Parameter des Testverfahrens beschreibt, beispielsweise die relativen Mengen von Reagens und Probe, die gemischt werden sollen, die Aufbewahrungszeiträume oder die Reagens/Probenmischungen, Temperatur, Pufferbedingungen und ähnliches.
In bevorzugten Ausführungsformen enthält ein erfindungsgemäßes diagnostisches System Polypeptid p3 und/oder p4, bevorzugt p3 und p4 in Mischung.
Weiter ist ein diagnostisches System bevorzugt, das mindestens zwei Polypeptide enthält, wobei ein erstes dieser Polypeptide eine durch die Formel:
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dargestellte Aminosäuresequenz hat, wobei Z entweder Isoleucin oder Methionin ist. Ein zweites der Polypeptide kann mit durch einen HIV, beispielsweise HIV-1, HIV-2 oder ähnliche, induzierten Antikörpern immunreagieren und wird bevorzugt aus der p1, p2 und p5 umfassenden Gruppe ausgewählt. Jedes Polypeptid kann innerhalb des Kits getrennt verpackt sein, z. B. als Teil eines getrennten festen Trägers vorhanden sein. Bevorzugt sind die ersten und zweiten Polypeptide in Mischung vorhanden, bevorzugt in ungefähr äquimolarer Mischung.
Weiter bevorzugt ist ein diagnostisches System mit mindestens zwei festen Trägern, bevorzugt getrennt innerhalb des Kits verpackt. Ein erster fester Träger umfaßt eine feste Matrix mit einer funktionell daran gehefteten Mischung von mindestens zwei Polypeptiden. Ein erstes dieser Polypeptide hat eine Aminosäuresequenz, die durch die Formel:
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dargestellt wird, wobei Z entweder Isoleucin oder Methionin ist, und ein zweites der Polypeptide wird aus der p1 und p2 umfassenden Gruppe ausgewählt. Ein zweiter fester Träger umfaßt eine feste Matrix mit funktionell daran geheftetem Polypeptid p5.
In bevorzugten Ausführungsformen umfaßt ein erfindungsgemäßes diagnostisches System weiter einen Marker oder ein anzeigendes Mittel, das die Bildung eines Komplexes, der ein erfindungsgemäßes Polypeptid oder Antikörpermolekül enthält, signalisieren kann.
Das Wort "Komplex", so wie es hier verwendet wird, bezeichnet das Produkt einer spezifischen Bindungsreaktion, beispielsweise einer Antikörper-Antigen- oder Rezeptor-Ligandenreaktion. Beispielhafte Komplexe sind Immunreaktionsprodukte.
So wie er hier verwendet wird, bezeichnen die Ausdrücke "Marker" und "anzeigendes Mittel" in ihren verschiedenen grammatikalischen Formen einzelne Atome und Moleküle, die entweder direkt oder indirekt an der Erzeugung eines dedektierbaren Signales zum Anzeigen der Gegenwart eines Komplexes beteiligt sind. Jeder Marker oder jedes anzeigende Mittel kann verbunden sein mit oder eingebaut sein in ein exprimiertes Protein, Polypeptid, oder ein Antikörpermolekül, das Teil eines erfindungsgemäßen Antikörpers oder einer erfindungsgemäßen monoklonalen Antikörperzusammensetzung ist, oder er/es kann getrennt verwendet werden, und jene Atome oder Moleküle können alleine verwendet werden oder in Verbindung mit weiteren Reagenzien. Solche Marker sind in der klinischen diagnostischen Chemie selbst gut bekannt und stellen einen Teil dieser Erfindung nur insoweit dar, als sie mit ansonsten neuen Proteinen, Verfahren und/oder Systemen verwendet werden.
Das Markierungsmittel kann ein fluoreszierendes Markierungsmittel sein, das chemisch an Antikörper oder Antigene bindet, ohne sie zu denaturieren, und ein Fluorochrom einen Farbstoff bildet, der ein nützlicher immunfluoreszierender Indikator ist. Geeignete fluoreszierende Markierungsmittel sind Fluorochrome, beispielsweise Fluoresceinisocyanat (FIC), Fluoresceinisothiocyanat (FITC), 5-Dimethylamin-1-naphthalinsulfonylchlorid (DANSC), Tetramethylrhodaminisothiocyanat (TRITC), Lissamin, Rhodamin 8200 Sulfonylchlorid (RB 200 SC) und ähnliche. Eine Beschreibung von Immunfluoreszenz-Analyseverfahren kann in DeLuca, "Immunofluorescence Analysis", in Antibody As a Tool, Marchalonis, et al., Hrsg., John Wiley &Sons, Ltd., Seiten 189-231 (1982), gefunden werden.
In bevorzugten Ausführungsformen ist die anzeigende Gruppe ein Enzym, beispielsweise Meerrettichperoxidase (HRP), Glukoseoxidase oder ähnliches. In solchen Fällen, wo die hauptsächliche anzeigende Gruppe ein Enzym ist, beispielsweise HRP oder Glukoseoxidase, sind zusätzliche Reagenzien erforderlich, um die Tatsache zu visualisieren, daß ein Rezeptor- Ligandenkomplex (Immunreaktant) gebildet worden ist. Solche zusätzlichen Reagenzien für HRP umfassen Wasserstoffperoxid und einen Oxidationsfarbstoffvorläufer, beispielsweise Diaminobenzidin. Ein zusätzliches Reagens, das mit Glukoseoxidase nützlich ist, ist 2,2'-Azino-di-(3-ethyl-benzthiazolin-6-sulfonsäure) (ABTS).
Als Markierungsmittel sind ebenfalls radioaktive Elemente nützlich und sie werden hier zur Veranschaulichung verwendet. Ein beispielhaftes Radiomarkierungsmittel ist ein radioaktives Element, das Gammastrahlen-Emissionen erzeugt. Elemente, die selbst Gammastrahlen emittieren, beispielsweise ¹²&sup4;J, ¹²&sup5;J, ¹²&sup8;J, ¹³²J und &sup5;¹Cr, stellen eine Klasse Gammastrahlen-Emissions-produzierender anzeigender Gruppe mit radioaktivem Element dar. Besonders bevorzugt ist ¹²&sup5;J. Eine weitere Gruppe nützlicher Markierungsmittel sind Elemente wie ¹¹C, ¹&sup8;F, ¹&sup5;O und ¹³N, die selbst Positronen emittieren. Die so emittierten Positronen erzeugen Gammastrahlen nach Begegnung mit Elektronen, die im Tierkörper vorhanden sind. Weiter nützlich sind Betastrahler, beispielsweise ¹¹¹Indium oder ³H.
Die Verbindungen von Markern, d. h., das Markieren von Polypeptiden und Proteinen, ist in der Technik gut bekannt. Beispielsweise können von einem Hybridom erzeugte Antikörpermoleküle durch metabolischen Einbau von Radioisotop-haltigen Aminosäuren, die als Bestandteil des Kulturmediums zur Verfügung gestellt werden, markiert werden. Siehe beispielsweise Galfre et al., Meth. Enzymol., 73 : 3-46 (1981). Die Technik der Proteinkonjugation oder Kopplung durch aktivierte funktionelle Gruppen ist insbesondere anwendbar. Siehe beispielsweise Aurameas et al., Scand. J. Immunol., Band 8, Anhang 7: 7-23 (1978), Rodwell et al., Biotech., 3 : 889-894 (1984), und US-Patent Nr. 4,493,795.
Die diagnostischen Systeme können weiterhin ein spezifisches Bindungsmittel umfassen, bevorzugt als eine getrennte Packung. Ein "spezifisches Bindungsmittel" ist eine molekulare Einheit, die eine erfindungsgemäße Reagensart oder einen Komplex, der eine solche Art enthält, selektiv binden kann, aber selbst nicht ein erfindungsgemäßes Polypeptid oder eine Antikörpermolekülzusammensetzung ist. Beispielhafte spezifische Bindungsmittel sind zweite Antikörpermoleküle, Komplementproteine oder Fragmente davon, S. aureus Protein A und ähnliche. Bevorzugt bindet das spezifische Bindungsmittel an die Reagensart, wenn die Art als Teil eines Komplexes vorhanden ist.
In bevorzugten Ausführungsformen ist das spezifische Bindungsmittel markiert. Wenn das diagnostische System jedoch ein spezifisches Bindungsmittel enthält, das nicht markiert ist, wird das Mittel typischerweise als ein amplifizierendes Mittel oder Reagens verwendet. In diesen Ausführungsformen ist das markierte spezifische Bindungsmittel in der Lage, das amplifizierende Mittel spezifisch zu binden, wenn das amplifizierende Mittel an einen Reagensart-haltigen Komplex gebunden ist.
Die erfindungsgemäßen diagnostischen Kit können in einem "ELISA"-Format zum Nachweis der Gegenwart oder Menge von mindestens anti-HIV-1-Antikörpern in einer Körperflüssigkeitsprobe, beispielsweise Serum, Plasma oder Urin, verwendet werden. "ELISA" bezeichnet einen Enzym-gebundenen Immunadsorptionstest, der einen an eine Festphase gebundenen Antikörper oder ein Antigen und ein Enzym-Antigen- oder Enzym-Antikörper-Konjugat zum Nachweis und zur Quantifizierung der Menge eines in einer Probe vorhandenen Antigenes oder Antikörpers verwendet.
Eine Beschreibung der ELISA-Technik ist in Kapitel 22 der 4. Auflage von Basic and Clinical Immunology von D.P. Sites et al., publiziert von Lange Medical Publications, Los Altos, CA, 1982, und in den US-Patenten Nrn. 3,654,090; 3,850,752 und 4,016,043 zu finden.
In bevorzugten Ausführungsformen kann daher ein erfindungsgemäßes Polypeptid, eine erfindungsgemäße Antikörpermolekülzusammensetzung oder monoklonale Antikörpermolekülzusammensetzung an eine feste Matrix angeheftet werden, um einen festen Träger zu bilden, der eine Packung im betreffenden diagnostischen System umfaßt.
Das Reagens wird typischerweise durch Adsorption aus einem wäßrigen Medium an einer festen Matrix befestigt, obwohl andere Arten der Befestigung, die dem Fachmann gut bekannt sind, verwendet werden können.
Nützliche feste Matrizen sind in der Technik ebenso gut bekannt. Solche Materialien sind wasserunlöslich und umfassen das quervernetzte Dextran, das unter dem Warenzeichen SEPHADEX von Pharmacia Fine Chemicals (Piscataway, NJ) erhältlich ist, Agarose, Polystyrolkugeln von ungefähr 1 um bis ungefähr 5 mm Durchmesser, erhältlich von Abbott Laboratories (North Chicago, IL), Polyvinylchlorid, Polystyrol, quervernetztes Polyacrylamid, Gewebe auf Nitrozellulose- oder Nylonbasis, beispielsweise Blätter, Streifen oder Paddel, oder Röhrchen, Platten oder die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte, z. B. die aus Polystyrol oder Polyvinylchlorid hergestellten.
Die Reagensart, das markierte spezifische Bindungsmittel oder das amplifizierende Reagens jedes der hier beschriebenen diagnostischen Systeme kann in Lösung als eine flüssige Dispersion oder als ein im wesentlichen trockenes Pulver, z. B. in lyophilisierter Form, bereitgestellt werden. Wo das anzeigende Mittel ein Enzym ist, kann das Substrat des Enzymes ebenfalls in einer getrennten Packung eines Systemes zur Verfügung gestellt werden. Ein fester Träger, so wie die zuvor beschriebene Mikrotiterplatte, und ein oder mehrere Puffer können als getrennt verpackte Elemente ebenfalls in diesem diagnostischen Testsystem enthalten sein.
Die mit Bezug auf die diagnostischen Systeme diskutierten Packungsmaterialien sind solche, die gewöhnlich in diagnostischen Systemen verwendet werden. Solche Materialien umfassen Glas- und Kunststoff- (z. B. Polyethylen, Polypropylen und Polycarbonat) Flaschen, Röhrchen, Kunststoff- und Kunststoffolien laminierte Hüllen und ähnliches.

G. Testverfahren

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis der Gegenwart und bevorzugt der Menge von Antikörpern gegen HIV-1 in einer Körperflüssigkeitsprobe durch Erzeugen eines Komplexes, der ein erfindungsgemäßes Polypeptid und solche Antikörper enthält. Der Fachmann wird verstehen, daß es unzählige gut bekannte Verfahren der klinischen diagnostischen Chemie gibt, die verwendet werden können, um solche Komplexe zu bilden. Die Erfindung ist daher nicht auf die hier beschriebenen beispielhaften Testverfahren beschränkt.
Verschiedene heterogene und homogene Testprotokolle können zum Nachweis der Gegenwart und bevorzugt der Menge von Antikörpern gegen HIV-1-TMP in einer Körperflüssigkeitsprobe bei Verwenden eines erfindungsgemäßen Polypeptids angewendet werden, sowohl kompetitive als auch nicht kompetitive. Die vorliegende Erfindung betrifft beispielsweise ein Verfahren zum Testen einer Körperprobe auf die Gegenwart von anti-HIV-1- Antikörpern, umfassend die folgenden Schritte:
a) Das Bilden einer Immunreaktionsmischung durch Mischen einer Körperflüssigkeitsprobe mit einem Polypeptid mit der durch die Formel:
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dargestellten Animosäuresequenz, wobei Z entweder Isoleucin oder Methionin ist. Die Körperflüssigkeitsprobe wird bevorzugt als bekannte Menge von Blut oder eines von Blut abgeleiteten Produktes, beispielsweise Serum oder Plasma, zur Verfügung gestellt, obwohl Urin, Speichel, Samen, Vaginalsekret oder Rückenmarksflüssigkeit (CSF) ebenfalls verwendet werden können. Bevorzugt ist das Polypeptid als Teil eines festen Trägers vorhanden, z. B. ein erfindungsgemäßes Polypeptid an den inneren Wänden einer Mikrotiterplattenvertiefung befestigt, so daß die gebildete Immunreaktionsmischung eine feste und eine flüssige Phase hat.
b) Das Aufbewahren der Mischung unter biologischen Testbedingungen für einen vorbestimmten Zeitraum, beispielsweise ungefähr 10 min bis ungefähr 16-20 Std., bei einer Temperatur von ungefähr 4ºC bis ungefähr 45ºC, was für jeden anti-HIV-1-Antikörper, der in der Probe vorhanden ist, ausreichend ist, mit den Polypeptiden eine Immunreaktion einzugehen (immunologisch zu binden), um ein Polypeptid-haltiges Immunreaktionsprodukt zu bilden.
Biologische Testbedingungen sind solche, die die biologische Aktivität des erfindungsgemäßen Polypeptidmoleküles und der anti-HIV-1-Antikörper, die getestet werden sollen, erhalten, und umfassen einen Temperaturbereich von ungefähr 4ºC bis ungefähr 45ºC, einen pH-Wertbereich von ungefähr 5 bis ungefähr 9 und eine Ionenstärke, die zwischen der von destilliertem Wasser und der von ungefähr einmolarem Natriumchlorid variiert. Verfahren zum Optimieren solcher Bedingungen sind in der Technik gut bekannt.
c) Das Testen auf die Gegenwart eines Polypeptid-haltigen Immunreaktionsproduktes, das sich gebildet hat; dadurch wird die Gegenwart jedes anti-HIV-1-Antikörpers in der Immunreaktionsmischung ebenfalls bestimmt. Bevorzugt wird die Menge jedes gebildeten Polypeptid-haltigen Immunreaktionsproduktes bestimmt und dadurch die Menge von in der Probe vorhandenen anti-HIV-1-Antikörpern.
Das Testen auf die Gegenwart eines Polypeptid-haltigen (anti-HIV-1-Antikörper-haltigen) Immunreaktionsproduktes, entweder direkt oder indirekt, kann durch in der Technik gut bekannte Testverfahren erreicht werden. Beispielsweise wird in bevorzugten Ausführungsformen das Polypeptid-haltige Immunreaktionsprodukt von Schritt (b) weiter vorbereitet zum Testen gemäß Schritt (c) durch die folgenden Schritte:
i) Mischen eines biologisch aktiven markierten spezifischen Bindungsmittels mit dem Polypeptid-haltigen Immunreaktionsprodukt zur Bildung einer Markierungsreaktionsmischung. Das markierte spezifische Bindungsmittel kann an jedes in dem Polypeptid-haltigen Immunreaktionsprodukt vorhandene Immunglobulin zur Bildung eines markierten Komplexes binden. Bevorzugt enthält das markierte spezifische Bindungsmittel zweite Antikörpermoleküle, beispielsweise xenogene anti-Human-Fc-Antikörper. Besonders bevorzugt ist das markierte spezifische Bindungsreagens spezifisch für Immunglobulinklassen.
ii) Die so gebildete Markierungsreaktionsmischung wird unter biologischen Testbedingungen für einen vorbestimmten Zeitraum aufbewahrt, der für das markierte spezifische Bindungsmittel ausreichend ist, an jeden als Polypeptid-haltiges Immunreaktionsprodukt vorhandenen anti-HIV-1-Antikörper unter Bildung eines markierten Komplexes zu bilden.
Das Testen auf die Gegenwart des markierten Komplexes stellt einen Test auf die Gegenwart von anti-HIV-1-Antikörpern in der Probe zur Verfügung. In bevorzugten Ausführungsformen wird die Menge des markierten spezifischen Bindungsmittels, das als Teil des Komplexes gebunden ist, bestimmt, und dadurch kann die Gegenwart und Menge von anti-HIV-1-Antikörpern in der Probe bestimmt werden. Die Menge kann 0 sein, wodurch angezeigt wird, daß innerhalb der Grenzen, die nachgewiesen werden können, keine anti-HIV-1-Antikörper in der Probe vorhanden sind. Verfahren zum Testen auf die Gegenwart und Menge markierter spezifischer Bindungsmittel hängen von der verwendeten Markierung ab, wobei solche Markierungs- und Testverfahren in der Technik gut bekannt sind.
Alternativ können homogene Testverfahren, beispielsweise solche, die in den US-Patenten Nrn. 4,536,479, 4,233,401, 4,233,402 und 3,996,345 beschrieben sind, zum Nachweis der Polypeptid-haltigen Immunreaktionsprodukte aus Schritt (c) verwendet werden.

Beispiele

1. Polypeptidsynthese

Die Polypeptide p1, p2, p3, p4 und p5 wurden unter Verwendung des klassischen Festphasenverfahrens, beschrieben von Merrifield, Adv. Enzymol., 32 : 221-96 (1969), adaptiert für die Verwendung mit einem automatischen Peptidsynthesegerät Modell 430A (Applied Biosystems, Foster City, CA) synthetisiert. Die Polypeptidharze wurden durch Fluorwasserstoffsäure gespalten, extrahiert und auf Reinheit durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie unter Verwendung einer Umkehrphasen C18-Säule analysiert (Waters Associates, Milford, MA).
Die Aminosäuresequenz des Polypeptids p5, die von der Sequenz eines HIV-2-Isolates abgeleitet ist, ist in Tabelle 1 von Abschnitt C gezeigt. Zur Erleichterung eines Vergleiches werden die Aminosäuresequenzen der Polypeptide p1, p2, p3 und p4, die von 4 verschiedenen HIV-1-Isolaten abgeleitet sind, in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2 Peptidbezeichnung Aminosäuresequenz a a Die Aminosäuresequenz jedes Polypeptides entspricht einem Teil einer bekannten HIV-1 gp41-Aminosäuresequenz. b Ein Gedankenstrich weist darauf hin, daß der Aminosäurerest der gleiche ist wie der in der gleichen Position in der Polypeptid p2-Sequenz gefundene, während die Gegenwart einer Aminosäure, die von der in der p2 gefundenen abweicht, mit dem Buchstaben bezeichnet wird, die dem verschiedenen oder "substituierten" Rest entspricht. p1 hat daher eine Aminosäuresequenz, die der von p2 identisch ist, mit Ausnahme eines Leucins anstelle von Isoleucin an Position Nr. 3.

2. ELISA System und Verfahren

100 Mikroliter (ul) Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS), die 1 Mikrogramm (ug) der Polypeptide p1, p2, p3, p4 oder ps enthielt, wurden in die Vertiefungen von Polyvinyl-Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen gemischt (Mikrotest III, Falcon). Die Platten wurden dann ungefähr 16 Std. bei 37ºC aufbewahrt, um ein Verdampfen des PBS und die Adsorption der Polypeptide an die Wände der Vertiefungen (Beschichtung durch funktionelle Verbindung damit) zu erlauben. 150 ul ELISA-Verdünnungsmittel (PBS, enthaltend 0,2% Polyoxyethylen (20) Sorbitanmonolaurat (Tween® 20), 10% Hitze-inaktiviertes fötales Kälberserum (FCS) und 0,5 millimolar (mM) Thimerosal) wurden dann in jede Vertiefung gemischt, um überschüssige Proteinbindungsstellen zu blockieren.
Nach 1 Std. Aufbewahren der Verdünnungsmittel-haltigen Vertiefungen bei ungefähr 23ºC wurde das Verdünnungsmittel durch Schütteln oder Absaugen entfernt; so wurde das erfindungsgemäße diagnostische System, d. h., eine Mikrotiterplattenvertiefung mit einem erfindungsgemäßen Polypeptid, das funktionell an seiner inneren Wand befestigt ist (eine Polypeptid-beschichtete Vertiefung), gebildet.
100 ul jeden Serums, 1 : 64 verdünnt in ELISA-Verdünnungsmittel, wurden in eine Polypeptid-beschichtete Vertiefung gemischt. Die resultierende Fest-Flüssig-Phasen-Immunreaktionsmischung wurde 90 min bei ungefähr 23ºC aufbewahrt, um die Bildung eines Polypeptid-haltigen Immunreaktionsproduktes zu erlauben. Die verdünnten Seren wurden dann aus den Vertiefungen durch Absaugen unter Verwendung eines ELISA- Waschgerätes (Immuno Wash® 12, Nunc) entfernt. Jede Vertiefung wurde dann viermal mit ELISA-Waschlösung (PBS, enthaltend 0,2% Tween 20) gewaschen und trockengesaugt.
100 ul Meerrettichperoxidase-markiertes Ziegen-anti-Human- IgG, Affinitäts-gereinigt (Boehringer Mannheim Biochemicals), verdünnt 1 : 30000 in PBS, enthaltend 10% Hitze-inaktiviertes FCS und 0,5 mM Thimersol, wurden dann jeder Vertiefung zugemischt. Die resultierende Markierungsreaktionsmischung wurde 90 min bei ungefähr 23ºC aufbewahrt, um die Bildung von Polypeptid-haltigen markierten Komplexen zu erlauben. Die nicht umgesetzten markierten Antikörper wurden durch Schütteln entfernt und jede Vertiefung wurde wie zuvor beschrieben gewaschen und trockengesaugt.
Zur Bildung einer Entwicklungsreaktionsmischung wurden jeder Vertiefung 100 ul einer chromogenen Substratlösung [Citratpuffer (500 ml deionisiertes Wasser, enthaltend 5,0 g wasserfreie Citronensäure und 7,0 g Na&sub2;HPO&sub4;, pH 5) enthaltend 0,4 mg/ml O-Phenylendiamin (OPD) und 0,01% H&sub2;O&sub2;] zugemischt. Nach 30 min Aufbewahren der Entwicklungsreaktionsmischung bei ungefähr 23ºC wurden jeder Vertiefung 100 ul 1 M HCl zugemischt, um die Entwicklungsreaktion zu beenden. Die resultierenden Lösungen wurden auf ihre Absorption bei 492 Nanometern (OD&sub4;&sub9;&sub2;) unter Verwendung eines ELISA-Lesegerätes (Titertek Multiscan®, Flow Laboratories, Inglewood, CA) getestet. Seropositivität (HIV-Infektion) wurde als jeder OD&sub4;&sub9;&sub2;-Wert definiert, der größer war als der mittlere OD&sub4;&sub9;&sub2;-Wert plus drei Standardabweichungen von 24 normalen Kontrollseren (nicht-infizierten Seren). Alle Seren wurden mindestens dreimal getestet.
Die Seren von HIV-1-infizierten Patienten aus den Vereinigten Staaten wurden in San Diego, CA (n=84) und in den Häusern des Centers for Disease Control (CDC) in den gesamten Vereinigten Staaten (n=79) gesammelt. Die Reihe von 40 HIV-1-positiven Seren umfaßte Proben von 12 asymptomatischen seropositiven Patienten (CDC-Gruppe II), 13 Patienten mit generalisierter Lymphadenopathie (CDC-Gruppe III) oder dem AIDS-verwandten Komplex ARC (CDC-Gruppe IV-A) und 15 Patienten mit offensichtlichem AIDS (CDC-Gruppe IV-C oder IV-D). Siehe Centers for Disease Control, Morbid. Mortal Weekly Rep., 35 : 334 (1976).
Die Seren von zairischen HIV-1-infizierten Patienten und gesunde, normale zairische Kontrollen wurden in Kinshasa 1983 gesammelt und wurden von Brun-Vesinet et al., Science, 226: 453 (1984), charakterisiert.
Die HIV-2-positiven Seren wurden in Guinea Bissau 1980 gesammelt und durch Immunblotten und Immunfluoreszenz gegen HIV-1-, HIV-2- und STLV-Antigene charakterisiert. Fultz et al., Third International Conference on AIDS, Auszug MP.72, (1987)
Alle Serumproben wurden kodiert, in Aliquots aufgeteilt und bei -20ºC gelagert.
Die Ergebnisse der Tests der oben beschriebenen Seren auf Gegenwart von anti-HIV-Antikörpern unter Verwendung der Polypeptide p1, p2, p3, p4 und p5 sind in Tabelle 3 gezeigt.
Aus Tabelle 3 kann entnommen werden, daß Polypeptid p2, dessen Aminosäuresequenz den Carboxy-terminalen 12 Resten von Peptid 39, das im Cosand Patent beschrieben ist, homolog ist, mit 100% der HIV-1-infizierten Seren, die von Patienten aus den Vereinigten Staaten erhalten worden waren, reagierte, jedoch wurden nur 88,2% der zairischen HIV-1-infizierten Seren detektiert. Tabelle 3 Charakterisierung von Seren aus zairischen AIDS-Patienten Serum HIV-Kultur Western Blot Gesamtvirus ELISA Antigene a + = positiv; - = negativ (die Grenze zur Positivität für den Peptid-ELISA wurde als der mittlere OD&sub4;&sub9;&sub2;-Wert plus drei Standardabweichungen für eine Reihe von 24 negativen Kontrollseren definiert. Die Proben wurden als positiv oder negativ bei einer Serumverdünnung von 1 : 64 beurteilt). b ND = nicht durchgeführt, unzureichende Menge der Probe.
Ähnlich reagierte auch das Polypeptid p1, dessen Aminosäuresequenz einen Ersatz von Isoleucin durch Leucin enthält, mit 99,4% der HIV-1-infizierten Seren aus den Vereinigten Staaten, aber nur mit 86,8% der mit HIV-infizierten zairischen Seren.
Die in Tabelle 3 gezeigten Ergebnisse weisen darauf hin, daß die erfindungsgemäßen Polypeptide p3 und p4 im Gegensatz zu den Polypeptiden p1 und p2 anti-HIV-1-TMP-Antikörper in 94,1% bzw. 97,1% der getesteten zairischen AIDS-Seren detektierten. Der Unterschied im Ausmaß der Empfindlichkeit zwischen den erfindungsgemäßen Polypeptiden und den Polypeptiden p1 und p2 war unerwartet, weil erstens die Polypeptide p1 und p2 eine äquivalente Empfindlichkeit für HIV-1-TMP-Antikörper sowohl in Seren aus den Vereinigten Staaten als auch aus Zaire zu haben scheinen, und zweitens die Aminosäuresequenzen der Polypeptide p1, p3 und p4 alle von zairischen HIV-1-Isolaten abgeleitet sind, aber unerwartete Unterschiede in der Empfindlichkeit für anti-HIV-1-TMP-Antikörper haben.
Der Grund oder die Gründe für die oben beschriebenen Unterschiede bei der Empfindlichkeit sind unbekannt. Diese Unterschiede legen jedoch nahe, daß die Polypeptide p3 und/oder p4 mit Polypeptiden wie p1 und p2 verwendet werden können, um ein größeres Maß an Empfindlichkeit für eine Exposition gegen HIV zu erreichen. Zusätzlich weisen die in Tabelle 3 gezeigten Unterschiede der Empfindlichkeit darauf hin, daß ein erfindungsgemäßes Polypeptid in Kombination mit einem HIV-2- spezifischen Polypeptid, beispielsweise ps, verwendet werden kann, um einen höheren Grad der Empfindlichkeit für eine Exposition gegen HIV-1 oder HIV-2 zu erreichen, als der, der mit der Verwendung eines HIV-2-abgeleiteten Polypeptides alleine erreicht werden kann.
Fünf der zairischen AIDS-Seren, die nicht mit Polypeptid p1 reagierten, und die weder mit p3 oder mit p4 reagierten, und acht, die mit p1 und p4 reagierten, wurden auf die Gegenwart von infektiösem HIV-1 gemäß dem Kulturverfahren von McCormick et al., Am. J. Trop. Med. Hyg., 36 : 102 (1987) getestet. Zusätzlich wurden diese Seren auf die Gegenwart von anti-HIV-1- Antikörpern getestet, wobei ein kommerzielles diagnostisches ELISA-System verwendet wurde, das Gesamtvirus (virales Lysat) Antigene (Litton Bionetics, Kensington, MD) verwendet, und auf Antikörper gegen spezifische HIV-1-Proteine durch Western Immunblots unter Verwendung von CDC HIV-1 Stamm 451 als Antigenquelle. Die Ergebnisse dieser Tests, die in Tabelle 4 gezeigt sind, weisen darauf hin, daß die Polypeptide p3 und p4 mit allen fünf zairischen Viren reagierten, die mit Polypeptid p1 nicht reaktiv waren. Zusätzlich, da bei allen fünf der Polypeptid p1 negativen Seren festgestellt wurde, daß sie infektiöses HIV-1 enthielten, sie aber negativ oder nicht eindeutig im Westerblot-Test waren, stellen die erfindungsgemäßen diagnostischen Systeme Immuntestsysteme mit verbesserter Empfindlichkeit für anti-HIV-1-TMP-Antikörper dar.

3. Antikörperproduktion und Neutralisierungstest

Das Polypeptid p1 wurde über den Carboxy-terminalen Cysteinrest unter Verwendung des Quervernetzers m-Maleimidobenzoyl- N-hydroxysuccinimidester nach dem Verfahren von Lin et al., Biochem., 18 : 690-697 (1979) an Keyhole-Limpet-Hämocyanin (KLH)-Trägerprotein gekoppelt. Nach der Vorimmunisierung wurden Serumproben erhalten, und zwei Kaninchen wurden jeweils am Tag 0 an sechs subkutanen Stellen mit 250 ug gekoppeltem Polypeptid, emulgiert in 1 ml vollständigem Freund'schen Adjuvans, injiziert. Am Tag 14 wurden den Ratten 250 ug gekoppeltes Polypeptid in unvollständigem Freund'schen Adjuvans subkutan injiziert. Am Tag 21 wurden 250 ug gekoppeltes Polypeptid in 1 ml einer Alaunsuspension intraperitoneal injiziert. Die Kaninchenseren wurden 7 und 14 Tage nach der dritten Injektion gesammelt und bei -20ºC aufbewahrt. Die Antikörperspiegel wurden mit dem ELISA-Verfahren nach Beispiel 2 bestimmt.
Die Fähigkeit der Kaninchen-anti-Polypeptid p1-Seren, die HIV-1-Infektiösität zu neutralisieren, wurde über einen Reverse Transkriptase (RT)-Aktivitätstest, der dem von Chan et al., EMBO, 5 : 3065-71 (1986) beschriebenen ähnlich ist, bestimmt. Die Ergebnisse dieser Untersuchung, die in Tabelle 4 gezeigt sind, weisen darauf hin, daß die Immunisierung mit einem erfindungsgemäßen Inoculum HIV-1-neutralisierende Antikörper induziert. Tabelle 4 Kaninchen Anti-Polypeptidserum Nr. % Inhibitionb der RT-Aktivität Kontrollec a CPM = Counts (gezählte Zerfälle) pro min von (³H)TTP. b % Inhibition der RT-Aktivität (% Neutralisierung) = 1- [CPM RT-Test des anti-Polypeptid Antiserums/durchschnittlicher CPM RT-Test von Kontrollseren]·100% c Kontrolle = Präimmun-Kaninchenserum.
Die vorstehende Beschreibung einschließlich der speziellen Ausführungsformen und Beispiele soll die vorliegende Erfindung veranschaulichen und soll diese nicht beschränken. Unzählige weitere Variationen und Modifikationen können durchgeführt werden, ohne vom Geist und Umfang der vorliegenden Erfindung abzuweichen.

Claims

1. Polypeptid, bestehend im wesentlichen aus 12 Aminosäureresten mit einer Aminosäuresequenz, die durch die Formel:

LGZWGCSGKHIC

dargestellt wird, wobei Z entweder Isoleucin oder Methionin ist.

2. Zusammensetzung, umfassend eine Mischung von mindestens zwei Polypeptiden, worin ein erstes dieser Polypeptide im wesentlichen aus 12 Aminosäureresten besteht, deren Sequenz durch die Formel:

LGZWGCSGKHIC

dargestellt wird, wobei Z entweder Isoleucin oder Methionin ist, und ein zweites dieser Polypeptide mit durch ein Human-Immundefizienz-Virus induzierten Antikörpern immunreagieren kann.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 2, wobei ein zweites dieser Polypeptide eine Aminosäuresequenz hat, die durch eine Formel dargestellt wird, die aus der aus:

LGLWGCSGKLIC,

LGIWGCSGKLIC, und

NSWGCAFRQVC

bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

4. Verfahren zum Testen auf die Gegenwart von anti-HIV-1- Antikörpern in einer Körperflüssigkeitsprobe, umfassend die folgenden Schritte:

a) das Bilden einer Immunreaktionsmischung durch Mischen einer Körperflüssigkeitsprobe mit einem Polypeptid, das im wesentlichen aus 12 Aminosäureresten mit der durch die Formel:

LGZWGCSGKHIC

dargestellten Sequenz besteht, worin Z entweder Isoleucin oder Methionin ist;

b) das Aufbewahren der Immunreaktionsmischung unter biologischen Testbedingungen für einen Zeitraum, der für jeden in der Probe vorhandenen anti-HIV-Antikörper ausreichend ist, eine Immunreaktion mit dem Polypeptid einzugehen und ein Polypeptid-haltiges Immunreaktionsprodukt zu bilden; und

c) das Testen auf die Gegenwart eines Polypeptid-haltigen Immunreaktionsproduktes, das sich gebildet hat, und dadurch auf die Gegenwart jedes anti-HIV-1-Antikörpers in der Probe.

5. Verfahren nach Anspruch 4, worin das Polypeptid-haltige Immunreaktionsprodukt weiter für den Test gemäß Schritt (c) vorbereitet wird durch:

i) Bilden einer Markierungsreaktionsmischung durch Mischen von markierten Antikörpermolekülen, die an jedes Human-Immunglobulin, das in dem Immunreaktionsprodukt vorhanden ist, binden können, mit dem Polypeptid-haltigen Immunreaktionsprodukt, und

ii) Aufbewahren der so gebildeten Markierungsreaktionsmischung unter biologischen Testbedingungen für einen Zeitraum, der für die markierten Antikörper ausreichend ist, mit jedem als Polypeptid-haltiges Immunreaktionsprodukt vorhandenen anti-HIV-1-Antikörper unter Bildung eines markierten Komplexes eine Immunreaktion einzugehen.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Polypeptid vor dem Mischen gemäß Schritt (a) an eine feste Matrix angeheftet wird.

7. Verfahren zum Testen auf die Gegenwart von anti-HIV-Antikörpern in einer Körperflüssigkeitsprobe, umfassend die folgenden Schritte:

a) das Bilden einer Immunreaktionsmischung durch Mischen einer Körperflüssigkeitsprobe mit einer Zusammensetzung, die eine Mischung von mindestens zwei Polypeptiden umfaßt, wobei das erste der Polypeptide im wesentlichen aus 12 Aminosäureresten besteht und eine durch die Formel:

LGZWGCSGKHIC

dargestellte Sequenz hat, wobei Z entweder Isoleucin oder Methionin ist, und ein zweites der Polypeptide durch eine Formel dargestellt wird, die aus der aus:

LGLWGCSGKLIC,

LGIWGCSGKLIC, und

NSWGCAFRQVC

bestehenden Gruppe ausgewählt ist,

b) das Aufbewahren der Immunreaktionsmischung unter biologischen Testbedingungen für einen Zeitraum, der für jeden in der Probe vorhandenen anti-HIV- Antikörper ausreichend ist, mit dem Polypeptid eine Immunreaktion einzugehen und ein Polypeptid-haltiges Immunreaktionsprodukt zu bilden, und

c) das Testen auf die Gegenwart eines Polypeptid-haltigen Immunreaktionsproduktes, das sich gebildet hat, und dadurch auf die Gegenwart jedes anti-HIV-Antikörpers in der Probe.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Polypeptid-haltige Immunreaktionsprodukt weiter zum Test gemäß Schritt (c) vorbereitet wird durch:

i) Bilden einer Markierungsreaktionsmischung durch Mischen von markierten Antikörpermolekülen, die an jedes Human-Iminunglobulin, das als Immunreaktionsprodukt vorhanden ist, binden können,

ii) Aufbewahren der so gebildeten Markierungsreaktionsmischung unter biologischen Testbedingungen für einen Zeitraum, der für die markierten Antikörper ausreichend ist, mit jedem als Polypeptid-haltiges Immunreaktionsprodukt vorhandenen anti-HIV-Antikörper unter Bildung eines markierten Komplexes eine Immunreaktion einzugehen.

9. Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Polypeptid vor dem Mischen von Schritt (a) an eine feste Matrix fixiert wird.

10. Diagnostisches System in Kitform zum Testen auf die Gegenwart von anti-HIV-1-Antikörpern in einer Körperflüssigkeitsprobe, umfassend eine Packung, die ein Polypeptid mit einer durch die folgende Formel dargestellten Aminosäuresequenz enthält:

LGZWGCSGKHIC

wobei Z entweder Isoleucin oder Methionin ist.

11. Diagnostisches System in Kitform zum Testen auf die Gegenwart von anti-HIV-Antikörpern in einer Körperflüssigkeitsprobe, umfassend eine Packung, die mindestens zwei Polypeptide enthält, wobei ein erstes dieser Polypeptide eine durch die Formel:

LGZWGCSGKHIC

dargestellte Aminosäuresequenz hat, wobei Z entweder Isoleucin oder Methionin ist, und ein zweites der Polypeptide mit durch ein Human-Immundefizienz-Virus induzierten Antikörpern eine Immunreaktion eingehen kann.

12. Diagnostisches System nach Anspruch 11, wobei das zweite der Polypeptide eine Aminosäuresequenz hat, die durch eine Formel dargestellt wird, die aus der aus:

LGLWGCSGKLIC,

LGIWGCSGKLIC, und

NSWGCAFRQVC

bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

13. Diagnostisches System nach Anspruch 11, wobei das erste und zweite Polypeptid gemischt werden.

14. Diagnostisches System nach Anspruch 11, das weiter in einer getrennten Packung ein markiertes spezifisches Bindemittel für das Anzeigen der Gegenwart eines Polypeptid-haltigen Immunreaktionsproduktes enthält.

15. Diagnostisches System nach Anspruch 11, wobei das Polypeptid an eine feste Matrix fixiert ist.

16. Diagnostisches System in Kitform, umfassend:

a) einen ersten festen Träger, der eine feste Matrix mit funktionell daran gebundenem Polypeptid mit einer durch die Formel:

LGZWGCSGKHIC,

dargestellten Aminosäuresequenz umfaßt, wobei Z entweder Isoleucin oder Methionin ist, und

b) einen zweiten festen Träger, der eine feste Matrix mit funktionell daran gebundenem Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz umfaßt, die durch eine Formel dargestellt wird, die aus der aus:

LGLWGCSGKLIC,

LGIWGCSGKLIC, und

NSWGCAFRQVC

bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

17. Diagnostisches System in Kitform, umfassend:

a) einen ersten festen Träger, der eine feste Matrix mit einer funktionell daran gebundenen Mischung von mindestens zwei Polypeptiden umfaßt, wobei ein erstes dieser Polypeptide eine durch die Formel:

LGZWGCSGKHIC

dargestellte Aminosäuresequenz hat, wobei Z entweder Isoleucin oder Methionin ist, und ein zweites dieser Polypeptide eine Aminosäuresequenz hat, die durch eine Formel dargestellt wird, die aus der aus:

LGLWGCSGKLIC, und

LGIWGCSGKLIC

bestehenden Gruppe ausgewählt ist, und

b) einen zweiten festen Träger, der eine feste Matrix mit einem funktionell daran gebundenem Polypeptid mit einer durch die Formel:

NSWGCAFRQVC

dargestellten Aminosäuresequenz enthält.