DE3750088T2

DE3750088T2 - Synthetische Polypeptide und Antikörper bezogen auf Vorzeitig-Diffus-Antigene vom Epstein-Barr-Virus.

Info

Publication number: DE3750088T2
Application number: DE3750088T
Authority: DE
Inventors: Robert I Fox; Richard Houghton
Original assignee: Scripps Clinic and Research Foundation
Current assignee: Scripps Research Institute
Priority date: 1986-12-05
Filing date: 1987-12-02
Publication date: 1994-12-01
Anticipated expiration: 2007-12-03
Also published as: IL84690A0; JP2682959B2; EP0280813B1; DK638887A; US4879213A; NZ222794A; IE63368B1; DK173262B1; AU610099B2; ZA879025B; DK638887D0; IL84690A; DE3750088D1; JPS63225398A; EP0280813A3; IE873303L; CA1315481C; ATE107316T1; AU8207387A; ES2054692T3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Immunogene, Antigene, Inokula, Antikörper, Verfahren und Systeme, die bei der Behandlung und Diagnose von Erkrankungen brauchbar sind, an denen das Epstein-Barr-Virus und sein diffuses frühes Antigen beteiligt sind.

Hintergrund der Erfindung

Das Epstein-Barr-Virus (EBV) ist ein extrem häufig in der Umwelt vorkommendes Agens, welches 80-100% der Personen rund um die Welt infiziert. Es ist der Verursacher von infektiöser Mononukleose (IM) bei Menschen, EBV ist auch mit der Pathogenese von Burkitt's Lymphom (BL), nasopharyngealem Karzinom (NPC), und B-Lymphocyten-Neoplasmen, die bei immunsupprimierten Patienten auftreten, in Verbindung gebracht worden. Es gibt auch Indizien für eine mögliche Rolle, die dieses Virus bei menschlichen Autoimmunerkrankungen wie rheumatoider Arthritis und Sjogren's Syndrom spielt.
Die anfängliche oder primäre EBV-Infektion kann akut oder subklinisch sein. Eine akute Virusinfektion führt zur Erzeugung von spezifischen Kernantigenen (die EBNA-I und EBNA-II genannt werden), einem "frühen Antigen" (EA)-Komplex, Viruscapsid-Antigenen (VCA) und anderen virusassoziierten Molekülen. Daran schließt sich ein langer Zeitraum an, währenddessen die EBV-Infektion latent in B-Lymphocyten vorhanden ist, die sich im Blutkreislauf, den Lymphknoten, der Milz und den Speicheldrüsen befinden.
Eine latente Infektion ist eine, in der ein Virus intrazellulär in einem nichtexprimierten oder teilweise exprimierten Zustand vorhanden ist. Latente Virusinfektionen können reaktiviert werden. Obwohl die Wirtsfaktoren, welche den latenten Zustand in vivo kontrollieren, wenig verstanden werden, gibt es Hinweise darauf, daß das Versagen von einem oder mehreren Immunmechanismen ein wichtiger Faktor ist.
Die serologischen und zellvermittelten Immunantworten, die auf die Primärinfektion durch EBV folgen, sind gut dokumentiert und spiegeln die Antwort des Wirts auf die viralen immunogenen Determinanten wieder, die im Lauf der Infektion exprimiert werden. Im Zusammenhang mit natürlichen Virusproteinen sind immunogene Determinanten diejenigen Teile eines Proteins, welche die Antikörperreaktion hervorrufen, wenn das ganze natürliche Protein als Immunogen verwendet wird. Man glaubt, daß diese immunogenen Determinanten auf einige wenige Loci des Moleküls beschränkt sind.
Andererseits wird ein Bereich eines Proteinmoleküls, an den ein Antikörper binden kann, als antigene Determinante definiert. Der Nachweis von viralen antigenen Determinanten in Geweben wie auch das Profil der Antwort des Patienten auf virale immunogene Determinanten sind bei der Diagnose von EBV-assoziierten Erkrankungen von immer größerem Nutzen.
Der EA-Komplex weckt besonderes Interesse, da Antikörper gegen diesen Komplex regelmäßig in hohen Titern in Patienten mit EBV-assoziierten Erkrankungen vorhanden sind, was im Gegensatz zu latent infizierten, aber nicht erkrankten Kontrollpopulationen steht. Das heißt, Menschen, die akut mit dem Epstein-Barr-Virus infiziert sind, entwickeln Antikörper gegen ein diffuses frühes Antigen (EA-D). Im Anschluß daran verschwinden Anti-EA-D-Antikörper, wenn das Virus in eine Latenzphase eintritt, und sie treten nicht wieder auf, solange das Virus nicht reaktiviert ist.
Man weiß nun, daß der EA-Komplex aus zwei verschiedenen Protein-Antigenen besteht, die als diffus (D) und beschränkt (R) bezeichnet werden, was auf der Verteilung der Immunfluoreszenzfärbung in EBV-infizierten Zellen beruht. Antikörper gegen EA-D verursachen eine diffuse Färbung des Kerns und des Cytoplasmas sowohl in aceton- als auch methanolfixierten Zellen. Im Unterschied dazu ist die EA-R-Färbung auf das Cytoplasma in acetonfixierten Zellen beschränkt und ist in methanolfixierten Zellen nicht vorhanden.
Die Anti-EA-Aktivität von Seren von Patienten mit IM und NPC ist hauptsächlich gegen EA-D gerichtet, wogegen die Immunreaktivität in Seren von Patienten mit BL hauptsächlich gegen EA-R gerichtet ist. Dazu kommt, daß Antikörper gegen den EA-Komplex bei Patienten mit EBV-assoziierten malignen Erkrankungen von Bedeutung sind, da die Antikörpertiter dazu neigen, im Lauf der Erkrankung zu variieren.
Somit sind Tests zum Nachweisen der Anwesenheit von EA-D und Anti-EA-D-Antikörpern in verschiedenen häufig vorkommenden klinischen Situationen von Bedeutung.
Anti-EA-D-Antikörper sind bisher nachgewiesen worden unter Verwendung von EA-D-Antigen, das aus EBV-infizierten Zellen erhalten wurde. Die Immunfluoreszenzmethode von Henle et al., Science, 169, 188-190 (1970) verwendet Ganzzellpräparate ohne jede Reinigung des Antigens. Die Verwendung solcher rohen Präparate führt jedoch zu falsch positiven Ergebnissen bei Patienten, deren Serum auch Antikörper gegen Kern- und Cytoplasmaantigene von Säugetieren enthält.
Später berichtete Luka et al., J. Immunol. Meth. 67, 145-156 (1984) über die Entwicklung eines Enzymimmunsorbentassays (ELISA) für Anti-EA-D-Antikörper unter Verwendung eines EA-D-Zielantigens, das aus EBV-infizierten Zellen durch Immunaffinitäts-Chromatographie gereinigt wurde. Wenn auch das Verfahren von Luka et al. das Falsch-Positiv- Problem verringert, welches mit der Verwendung von Ganzzellpräparaten verbunden ist, erfordert es dennoch die Erzeugung und Handhabung von infektiösen Materialien.
Dementsprechend wäre es wünschenswert, verbesserte Reagenzien und Verfahren zum Nachweisen der Anwesenheit von EA-D und Anti-EA-D-Antikörpern in einer Körperflüssigkeitsprobe (body sample) zu entwickeln, um die Diagnose einer EBV-Beteiligung an einer Erkrankung wie auch die Diagnose des Stadiums einer Erkrankung wie infektiöser Mononukleose (IM) zu ermöglichen und die Handhabung von infizierten Zellkulturen einzuschränken oder zu vermeiden.
Neuere Studien haben gezeigt, daß chemisch synthetisierte Polypeptide, die kurzen linearen Segmenten der primären Aminosäurerestsequenz eines Proteins entsprechen, verwendet werden können, um Antikörper zu induzieren, die mit dem nativen Protein immun reagieren, Lerner et al., Nature, 299, 592 (1982) und Sutcliffe et al., Science 219, 260 (1983). Zusätzlich haben einige Studien gezeigt, daß synthetische Polypeptide mit Antikörpern eine Immunreaktion eingehen können, die von nativen Proteinen induziert wurden. Rhodes et al., J. Immunol. 134, 211 (1985). Somit können einige synthetische Polypeptide die immunogenen und antigenen Determinanten von nativen Proteinen immunologisch nachahmen.
Wie jedoch auf dem Fachgebiet bekannt ist, weist die Anwendung der synthetischen Peptid-Technologie noch mehrere Mängel auf. Zum Beispiel erfordert die Identifizierung von Peptiden, die antigene Determinanten auf einem nativen Protein nachahmen können, unter anderen die Kenntnis der Aminosäurerestsequenz des Proteins. Wenn auch die Aminosäurerestsequenz aus der Nukleinsäuresequenz des Gens vorhergesagt werden kann, das für das Protein codiert, kann eine solche Vorhersage nur gemacht werden, wenn das korrekte Leseraster des Gens bekannt ist.
Die Nukleinsäuresequenz des EBV-Genoms ist seit der Veröffentlichung des Artikels von Baer et al., Nature. 310, 207 (1984) bekannt. Jedoch ist vordem weder das EA-D-Protein-Gen noch sein Leseraster mit dem Virusgenom identifiziert worden.
Darüber hinaus sind, selbst wenn die Aminosäurerestsequenz eines Proteins bekannt ist, Verfahren zum Identifizieren der Loci in dem Protein, welche die immunogenen und antigenen Determinanten darstellen, von experimenteller Art und führen nicht zu vorhersagbaren Ergebnissen. Es gibt mindestens zwei Gründe dafür. Erstens gibt es ohne Kenntnis der dreidimensionalen Struktur eines Proteins kein verläßliches Verfahren zum Bestimmen, welche linearen Segmente des Proteins für das Immunsystem des Wirts zugänglich sind. Zweitens scheinen, ganz gleich, ob die dreidimensionale Struktur bekannt ist oder nicht, kurze lineare Polypeptide oftmals nicht die Fähigkeit zu haben, die erforderlichen sekundären und tertiären Konformationsstrukturen nachzuahmen, um geeignete immunogene und antigene Determinanten darzustellen, Tainer et al., Nature, 312, 127 (1984)

Kurze Zusammenfassung der Erfindung

Ein Aspekt dieser Erfindung befaßt sich mit einem synthetischen Polypeptid, welches als wesentliches Merkmal eine Aminosäuresequenz von 13 bis 40 Aminosäureresten und mehr bevorzugt 13 bis 25 Resten einschließlich der Sequenz, die der Aminosäurerestsequenz des EBV-EA-D-Proteins von Position 350 bis Position 362 von ihrem Aminoende her entspricht, besitzt. Das synthetische Polypeptid hat auch die Fähigkeit, Antikörper, die von EA-D induziert wurden, immunologisch zu binden.
Ein besonders bevorzugtes Polypeptid hat die von links nach rechts und vom aminoterminalen zum carboxyterminalen Ende hin gelesene Sequenz, die durch die Formel dargestellt ist:
H-PARPETSPAIPA-OH.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung befaßt sich mit einem synthetischen Polypeptidoligomer mit bis ungefähr 40 Aminosäureresten, das mehrere aneinandergefügte synthetische repetitive Polypeptideinheiten enthält, worin mindestens zwei dieser Einheiten synthetische Polypeptide sind, wie sie vorstehend beschrieben sind.
Noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung befaßt sich mit einem synthetischen Polypeptidpolymer, welches mehrere aneinandergefügte synthetische repetitive Polypeptideinheiten enthält, die nicht durch Peptidbindungen miteinander verbunden sind und mehr als ungefähr 100 Aminosäurereste enthalten. Die repetitiven Einheiten sind synthetische Polypeptide, wie sie vorstehend beschrieben sind.
Noch ein weiterer Aspekt dieser Erfindung ist ein Testverfahren zum Nachweis von Anti-EA-D-Antikörpern in einer Körperflüssigkeitsprobe, welches die Schritte der Bereitstellung einer Körperflüssigkeitsprobe für den Nachweis und eines synthetischen Polypeptids, wie es vorstehend beschrieben ist, umfaßt. Die Körperflüssigkeitsprobe und das Polypeptid werden vermischt, um eine Immunreaktionsmischung zu bilden. Die Mischung wird unter biologischen Testbedingungen über einen vorgegebenen Zeitraum belassen, der so bemessen ist, daß in der Probe gegebenenfalls vorhandene EA-D-Antikörper unter Bildung eines Immunreaktionsteilnehmers immunologisch an das Polypeptid binden. Ein gegebenenfalls in der Mischung gebildeter Immunreaktionsteilnehmer wird dann nachgewiesen.
Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung befaßt sich mit einem Verfahren zum Nachweis von EA-D in einer Körperflüssigkeitsprobe, das die Schritte der Bereitstellung einer Körperflüssigkeitsprobe für den Nachweis und von biologisch aktiven Rezeptormolekülen, die eine Antikörperbindungsstelle enthalten, welche durch ein synthetisches Polypeptid, wie es vorstehend beschrieben ist, induziert sind, umfaßt. Die Körperflüssigkeitsprobe wird mit den Rezeptoren vermischt, um eine Immunreaktionsmischung zu bilden. Die Mischung wird unter biologischen Testbedingungen über einen vorgegebenen Zeitraum belassen, der so bemessen ist, daß in der Probe gegebenenfalls vorhandene EA-D-Antikörper von den Rezeptoren immunologisch gebunden werden, um einen Immunreaktionsteilnehmer zu bilden. Der gegebenenfalls gebildete Immunreaktionsteilnehmer in der Mischung wird dann nachgewiesen.
Noch ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung befaßt sich mit einem Diagnosesystem zum Nachweis von Anti-EA-D- Antikörpern in einer Körperflüssigkeitsprobe. Das System umfaßt, vorzugsweise in getrennten Behältern, ein synthetisches Polypeptid, wie es vorstehend beschrieben ist, und ein markiertes spezifisches Bindungsmittel, um die Immunreaktion des Polypeptids mit den Anti-EA-D-Antikörpern anzuzeigen.
Ferner befaßt sich die Erfindung mit einem Inokulum, welches aus einem synthetischen Polypeptid, wie es vorstehend beschrieben ist, besteht, welches an einen festen Träger gebunden ist und in einem physiologisch unbedenklichen Verdünnungsmittel dispergiert ist.
Sie befaßt sich auch mit einem Rezeptor, der gegen ein synthetisches Polypeptid, wie es vorstehend beschrieben ist, erzeugt wurde, wobei der Rezeptor zu einer Immunreaktion mit dem EA-D-Protein fähig ist.
In einem weiteren Aspekt befaßt sich die vorliegende Erfindung mit einem Verfahren zum Nachweis von EA-D in einer Körperflüssigkeitsprobe, die im wesentlichen aus lysierten peripheren Blutlymphocyten besteht. Die Körperflüssigkeitsprobe wird mit den oben beschriebenen Rezeptoren vermischt, um eine Immunreaktionsmischung zu bilden. Die Mischung wird unter biologischen Testbedingungen über einen vorgegebenen Zeitraum belassen, der so bemessen ist, daß gegebenenfalls in der Probe vorhandenes EA-D mit den Rezeptoren unter Bildung eines Immunreaktionsteilnehmers eine Immunreaktion eingeht. Ein gegebenenfalls in der Mischung gebildeter Immunreaktionsteilnehmer wird dann nachgewiesen.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ist ein Diagnosesystem zum Nachweis von EA-A in einer Körperflüssigkeitsprobe. Das System umfaßt vorzugsweise folgende getrennt verpackte Bestandteile: Rezeptoren wie vorstehend beschrieben und ein markiertes spezifisches Bindungsmittel, das die Immunreaktion der Rezeptoren mit dem EA-D-Protein anzeigt.
Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung ist die Fähigkeit, Antigene und Rezeptoren, die mit EBV-EA-D in Beziehung stehen, zu erzeugen, ohne mit infektiösem Material umzugehen.
Die vorliegende Erfindung ist auch vorteilhaft, da sie Antigene und Rezeptoren mit hoher immunologischer Spezifität bereitstellt, die im wesentlichen nicht zu falsch positiven Ergebnissen führen, die von natürlich vorkommenden Kern- und Cytoplasma-Antigenen verursacht werden.
Ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, daß sie einen frühen Nachweis einer reaktivierten latenten EBV-Infektion ermöglicht.
Noch weitere Vorteile der vorliegenden Erfindung werden für Fachleute aus der folgenden Beschreibung offensichtlich.

Kurze Beschreibung der Abbildungen

In den Figuren, die einen Teil der Offenbarung dieser Erfindung bilden:
Fig. 1 veranschaulicht die vollständige Aminosäurerestsequenz des EA-D-Proteins, welches von links nach rechts und vom aminoterminalen zum carboxyterminalen Ende hin gelesen wird, wie es aus der Nukleinsäuresequenz des EA-D-Gens [Nukleinsäurereste 79899-81110) des EBV-Genoms), veröffentlicht von Baer et al., Nature, 310, 207 (1984)] translatiert wird, wobei aus einem Buchstaben bestehende Abkürzungen für die Aminosäurereste verwendet werden. Die Lage der Aminosäurerestsequenzen der in der vorliegenden Studie verwendeten Polypeptide ist durch gestrichelte Linien unter der Sequenz angegeben, wobei die terminalen Reste durch "+"-Zeichen direkt unter den terminalen Resten angegeben sind. Die gestrichelten Linien sind durch die Bezeichnungen K5, K6, K7, K8 und K9 unterbrochen, die hier verwendet werden, um auf diese Polypeptide Bezug zu nehmen.
Fig. 2 enthält drei graphische Darstellungen, welche die Ergebnisse des Nachweises von Anti-EA-D-IgM-, -IgG- bzw. -IgA-Antikörpern in Seren von normalen Personen (Normal) und Patienten mit infektiöser Mononukleose (akute IM) unter Verwendung des Anti-EA-D-Antikörper ELISA mit Polypeptid K7 als Festphasenzielverbindung, wie es in Beispiel 5 beschrieben ist, veranschaulichen. Serumproben wurden von 44 Patienten mit akuter IM (dunkle Balken) und von 194 gesunden normalen Personen (helle Balken) einschließlich von 40 Personen ohne vorherige Berührung mit EBV (VCA-) erhalten. Die optische Dichte bei 490 Nanometer (nm) (OD 490), die jede Probe in dem Test ergab, wurde auf die nächste 1/10-Einheit gerundet und ist die Abszisse jeder graphischen Darstellung. Jeder Balken gibt die Anzahl von Proben wieder, welche die angegebene OD 490 ergaben.
Die Daten von Darstellung A zeigen, daß die Häufigkeit der immunologischen IgM-Antikörperbindung (Immunreaktionsteilnehmerbildung) an EA-D-Epitope, die durch das Polypeptid K7 nachgeahmt werden, bei Patienten mit akuter IM größer ist als bei normalen Personen. Die Daten der Darstellungen B und C zeigen ähnliche Ergebnisse für die IgG- bzw. IgA-Antikörperreaktionen.
Fig. 3 ist ein Histogramm, welches die Ergebnisse veranschaulicht, die erhalten wurden, wenn der Polypeptid K7-ELISA von Beispiel 5 verwendet wurde, um Seren von Patienten mit nasopharyngealem Karzinom (NPC), Sjogren's Syndrom (SS), Cytomegalievirus- (CMV) -Infektion und normalen Spendern zu testen. Die Menge an Anti-EA-D-Antikörpern in jeder Serumprobe, welche mit Polypeptid K7 eine Immunreaktion eingingen, wird als OD 490-Wert ausgedrückt und durch einen Punkt in dem Histogramm wiedergegeben.
Fig. 4 enthält zwei graphische Darstellungen, welche die Ergebnisse des Nachweises von Anti-EA-D-Antikörpern in einer Reihe von Serumproben von 4 Patienten mit akuter IM unter Verwendung des Anti-EA-D-Antikörper- ELISA mit Polypeptid K7 als Festphasenzielverbindung, wie es in Beispiel 5 beschrieben ist, veranschaulichen. Daten von den Seren eines jeden Patienten werden durch ein unterschiedliches Symbol dargestellt, wobei das gleiche Symbol für den gleichen Patienten in jeder graphischen Darstellung verwendet wird. Die Daten von Darstellung A zeigen, daß Anti-EA-D-IgM-Antikörper bei IM-Patienten eine Woche nach dem Auftreten von Symptomen nachgewiesen werden können. Die Daten von Darstellung B zeigen die Bestätigung der IM-Diagnose bei den gleichen Patienten durch Nachweis der Zunahme von Anti-EBNA- 1-Antikörpern in den Serumproben unter Verwendung des Anti-EBNA-1-ELISA, der in Rhodes et al., J. Immunol., 134, 211 (1985) beschrieben ist.
Fig. 5 enthält zwei graphische Darstellungen, welche die Wirkung der Verdünnung des Serums und der Polypeptidkonzentration auf die Ergebnisse zeigen, die mit dem Anti-EA-D-IgM-Antikörper-ELISA unter Verwendung von K7 als Festphasenzielverbindung erhalten werden.
Die Daten von Darstellung A veranschaulichen die Wirkung, welche das Variieren der Menge des an die Mikrotiterplattenvertiefungen angebrachten K7-Polypeptids auf die Fähigkeit des Anti-EA-D- Antikörper-ELISA zum Nachweisen von Anti-EA-D-IgM- Antikörpern in einer Serumprobe von IM-Patienten (IM) und normalen Personen, deren Seren frei von Antikörpern gegen EBV-Capsidprotein-Antigene waren (VCA-), bzw. von Patienten, deren Seren Antikörper gegen diese Antigene enthielten (VCA&supmin;), hat. Die Mikrotiterplattenvertiefungen wurden mit Polypeptid K7 wie in Beispiel 5 beschrieben überzogen, außer daß die Konzentrationen der Polypeptid K7-haltigen Lösung, die verwendet wurde, um K7 an die Wände der Vertiefungen anzubringen, wie gezeigt variierten, wobei sie in Mikrogramm pro Milliliter (ug/ml) angegeben sind. Die untersuchten Seren wurden alle vor der Verwendung 1 : 20 verdünnt.
Die Daten von Darstellung B veranschaulichen die Wirkung der Verdünnung des Serums auf den Nachweis von humanen IgM-Antikörpern, die mit dem synthetischen Polypeptid K7 eine Immunreaktion eingehen. Die Wände von Mikrotiterplattenvertiefungen wurden mit K7 überzogen, wobei eine 10 ug/ml-Lösung, wie in Beispiel 5 beschrieben, verwendet wurde. Seren von Patienten mit IM, NPC und SS sowie von VCA&supmin; und VCA&spplus; normalen Personen wurden dann in dem Anti-EA-D-ELISA mit den gezeigten Verdünnungen getestet.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

A. Definitionen

Der Ausdruck "Antikörper" bezieht sich auf ein Molekül, welches ein Mitglied einer Familie von glycosylierten Proteinen ist, die Immunglobuline genannt werden, welche spezifisch an ein Antigen binden können.
Eine "Antikörperbindungsstelle" ist der Strukturbereich eines Antikörpermoleküls, der variable Regionen schwerer und leichter Ketten umfaßt, welcher spezifisch Antigen bindet.
Das Wort "Antigen" ist historisch verwendet worden, um ein Gebilde zu bezeichnen, das von einem Antikörper gebunden wird und auch um das Gebilde zu bezeichnen, welches die Produktion des Antikörpers induziert. In letzter Zeit wird die Bedeutung von Antigen auf das Gebilde beschränkt, welches von einem Antikörper gebunden ist, wogegen das Wort "Immunogen" für das Gebilde verwendet wird, welches die Erzeugung von Antikörpern induziert. Wenn ein hierin erörtertes Gebilde sowohl immunogen als auch antigen ist, wird es im allgemeinen als Antigen bezeichnet.
"Antigene Determinante" bezieht sich auf den tatsächlichen Strukturbereich des Antigens, der immunologisch durch eine Antikörperbindungsstelle gebunden ist. Der Ausdruck wird auch gleichbedeutend mit "Epitop" verwendet.
Der Ausdruck "antigenisch verwandte Varianten" wird hierin verwendet, um Polypeptide mit einer insgesamt abweichenden Aminosäurerestsequenz zu bezeichnen, die mindestens einen Teil einer antigenen Determinante gemeinsam haben und deshalb immunologisch kreuzreaktiv sind. Das heißt, die Polypeptidsequenzen von antigenisch verwandten Varianten sind verschieden, aber Antikörper, die gegen eine Variante erzeugt wurden, gehen mit der anderen eine Immunreaktion ein.
Der Ausdruck "biologisch aktiv" bezieht sich mindestens auf die Fähigkeit eines Rezeptors, mindestens spezifisch einen geeigneten Liganden zu binden, obwohl andere allgemeine oder Effektorfähigkeiten ebenfalls vorhanden sein können.
Das Wort "Komplex", so wie es hier verwendet wird, bezieht sich auf das Produkt, das gebildet wird, wenn ein spezifisches Bindungsmittel an einen Zielliganden bindet. Als Beispiel dienende Komplexe sind Immunreaktionsteilnehmer, Protein A, das an einen Antikörper gebunden ist und dergleichen.
Der Ausdruck "konservativer Austausch" so wie er hierin verwendet wird, gibt an, daß ein Aminosäurerest durch einen anderen biologisch ähnlichen Rest ersetzt worden ist. Beispiele für einen konservativen Austausch schließen den Austausch eines hydrophoben Rests wie Isoleucin, Valin, Leucin oder Methionin anstelle eines anderen oder den Austausch eines polaren Rests anstelle eines anderen, wie etwa zwischen Arginin und Lysin, zwischen Glutaminsäure und Asparaginsäure oder zwischen Glutamin und Asparagin und dergleichen ein. Der Ausdruck "konservativer Austausch" schließt auch die Verwendung einer substituierten Aminosäure anstelle einer unsubstituierten Ausgangs-Aminosäure ein, vorausgesetzt, daß Antikörper, die gegen ein solches Polypeptid erzeugt wurden, auch mit dem entsprechenden Polypeptid mit der unsubstituierten Aminosäure eine Immunreaktion eingehen.
Der Ausdruck "entsprechen" in seinen verschiedenen grammatikalischen Formen, wenn er in Zusammenhang mit Peptidsequenzen verwendet wird, bedeutet die beschriebene Peptidsequenz plus oder minus bis zu drei Aminosäureresten an einem oder beiden aminoterminalen und carboxyterminalen Enden, welche nur einen konservativen Austausch von einzelnen Aminosäureresten entlang der Polypeptidsequenz enthält.
"ELISA" bezieht sich auf einen Enzymimmunosorbentassay, der einen Antikörper oder ein Antigen, welcher oder welches an eine feste Phase gebunden ist und ein Enzym-Antigen- oder Enzym-Antikörper-Konjugat zum Nachweisen und Quantifizieren der Menge des in einer Probe vorhandenen Antigens oder Antikörpers einsetzt. Eine Beschreibung der ELISA-Methode findet sich in Kapitel 22 der 4. Ausgabe von Basic and Clinical Immunology von D.P. Sites et al., veröffentlicht von Lange Medical Publications in Los Altos, CA im Jahr 1982 und in den U.S. Patenten 3,654,090; 3,850,752 und 4,016,043, die allesamt hierin durch Bezugnahme mitaufgenommen sind.
"Enzym" bezieht sich auf ein Protein, das eine Veränderung eines Substrats, für welches es oft spezifisch ist, beschleunigen oder durch katalytische Wirkung hervorrufen kann.
"Epitop" bezieht sich auf den Teil eines Moleküls, der spezifisch von einer Antikörperbindungsstelle gebunden wird, um einen Immunreaktionsteilnehmer zu bilden. Es wird auch als die Determinante oder antigene Determinante bezeichnet.
Der Ausdruck "ahmt immunologisch nach" wird hierin so verwendet, daß er bedeutet, daß ein Polypeptid dieser Erfindung: 1) von Antikörpern, die durch natives Protein induziert sind, immunologisch gebunden werden kann; und 2) die Produktion von Antikörpern, die an das induzierende Polypeptid und auch an das native Protein binden, induzieren kann.
Der Ausdruck "eine Immunreaktion eingehen" bedeutet in seinen verschiedenen Formen die Bindung zwischen einem Antigen als Liganden und einem Molekül, welches eine Antikörperbindungsstelle enthält, wie einem Teil oder einem ganzen Antikörper als Rezeptor.
"Immunreaktionsteilnehmer", so wie es hier verwendet wird, bezieht sich auf das Produkt einer immunologischen Reaktion; d. h. das Gebilde, das erzeugt wird, wenn ein Ligand von einem Rezeptormolekül immunologisch gebunden wird.
Die Ausdrücke "Markierungsmittel", "anzeigende Gruppe" oder "Markierung" werden hier gegeneinander austauschbar verwendet, um einzelne Atome und Moleküle einzuschließen, die entweder direkt oder indirekt an der Erzeugung eines nachweisbaren Signals zum Anzeigen der Anwesenheit eines Immunreaktionsteilnehmers beteiligt sind. Jedes Markierungsmittel kann mit einem Rezeptor verknüpft oder ihm einverleibt sein oder getrennt davon verwendet werden und diese Atome oder Moleküle können allein oder in Verbindung mit zusätzlichen Reagenzien verwendet werden. Solche anzeigenden Gruppen oder Markierungen sind in der Immunchemie selbst gut bekannt und stellen nur insofern einen Teil dieser Erfindung dar, als sie mit ansonsten neuen Rezeptoren, Verfahren und/oder Systemen verwendet werden.
"Ligand" bezieht sich auf ein Molekül, welches einen Strukturteil enthält, der von einem spezifischen Rezeptor gebunden wird.
Die Worte "Peptid" und "Polypeptid" werden hier gegeneinander austauschbar für eine bekannte Sequenz von Aminosäureresten verwendet, die durch Peptidbindungen miteinander verknüpft sind.
Der Ausdruck "pharmazeutisch annehmbare Salze", so wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf ungiftige Alkalimetall-, Erdalkalimetall- und Ammoniumsalze, die in der pharmazeutischen Industrie verwendet werden, einschließlich der Natrium-, Kalium-, Lithium-, Calcium-, Magnesium- und Ammoniumsalze und dergleichen, die durch im Stand der Technik bekannte Methoden hergestellt werden. Der Ausdruck schließt auch ungiftige Säure-Additionssalze ein, die im allgemeinen durch Umsetzen der Verbindungen dieser Erfindung mit einer geeigneten organischen oder anorganischen Säure hergestellt werden. Repräsentative Beispiele für diese Salze schließen das Hydrochlorid, Hydrobromid, Sulfat, Bisulfat, Acetat, Oxalat, Valerat, Oleat, Laurat, Vorat, Benzoat, Lactat, Phosphat, Tosylat, Citrat, Maleat, Fumarat, Succinat, Tartrat und dergleichen ein.
Der Ausdruck "Rezeptor" wird hier verwendet, um ein biologisch aktives Molekül anzugeben, welches eine Antikörperbindungsstelle umfaßt, die immunologisch an ein Antigen bindet (oder sich mit ihm verbindet). Eine solche Bindung tritt typischerweise mit einer Affinität von ungefähr 10&sup5; bis ungefähr 1010 Litern pro Mol auf und ist eine spezifische Wechselwirkung des Epitops des Antigens mit der Antikörperbindungsstelle des Rezeptors.
Die biologische Aktivität eines Rezeptormoleküls wird durch die immunologische Reaktion des Rezeptors mit seinem antigenen Liganden bei ihrer Vermischung in einem wäßrigen Medium unter Bildung eines Immunreaktionsteilnehmers, zumindest bei physiologischen pH-Werten und Ionenstärken, unter Beweis gestellt. Vorzugsweise stellt sich die biologische Aktivität unter biologischen Testbedingungen ein, d. h. denjenigen, worin die Rezeptoren dieser Erfindung an den antigenen Liganden innerhalb eines pH-Wert-Bereichs von ungefähr 5 bis ungefähr 9 und bei Ionenstärken wie denen von destilliertem Wasser bis zu denen von ungefähr einmolarem Natriumchlorid binden.
Rezeptoren umfassen eine Antikörperbindungsstelle, die in der Lage ist, spezifisch ein Antigen zu binden. Rezeptoren schließen die Fab, FAb', F(ab')&sub2; und F(v) Polypeptidbereiche von Antikörpern ebenso wie Antikörper und im wesentlichen ganze Antikörper ein. Die Fab- und F(ab')&sub2;-Bereiche von Antikörpern sind im Fachgebiet gut bekannt und werden durch die proteolytische Reaktion von Papain bzw. Pepsin auf im wesentlichen intakte Antikörper durch gut bekannte Verfahren hergestellt. Siehe z. B. das U.S. Patent Nr. 4,342,566 von Theofilopolous und Dixon. Fab'-Antikörperbereiche sind auch gut bekannt und werden aus F(ab')&sub2;-Bereichen, gefolgt von der Reduktion der Disulfidbindungen, welche die zwei schweren Kettenteile verknüpfen, z. B. mit Mercaptoethanol, und dann Alkylieren des resultierenden Proteinmercaptans mit einem Reagenz wie Iodacetamid hergestellt. Intakte ganze Antikörper sind bevorzugt und werden zur Veranschaulichung der monoklonalen und anderen Rezeptormoleküle dieser Erfindung verwendet.
Die Worte "Sezernieren" und "Erzeugen" werden oftmals gegeneinander austauschbar im Fachgebiet im Hinblick auf Zellen verwendet, von denen Antikörpermoleküle erhalten werden. Zellen, die Antikörper erzeugen, können jedoch diese Moleküle nicht in ihre Umgebung sezernieren. Die hier in Frage kommenden Hybridomzellen sezernieren monoklonale Antikörper in ihre Umgebung. Nichtsdestoweniger werden solche Zellen hier oftmals als "Antikörper erzeugende" Zellen bezeichnet und ihre Antikörper werden als "erzeugt" bezeichnet, um beim Sprachgebrauch des Fachgebiets zu bleiben.
Der Ausdruck "synthetisch", so wie er hier verwendet wird, bedeutet, daß das Polypeptidmolekül oder die repetitive Polypeptideinheit durch chemische Mittel aufgebaut, d. h. chemisch synthetisiert, statt durch biologische Mittel, wie durch gentechnologische Methoden, hergestellt worden ist. Somit sind die synthetischen Polypeptide, welche die vorliegende Erfindung ausführen, frei von natürlich vorkommenden Proteinen und Fragmenten davon.

B. Synthetische Polypeptide

Ein synthetisches Polypeptid der vorliegenden Erfindung besteht im wesentlichen aus ungefähr 6 bis ungefähr 40 Aminosäureresten und mehr bevorzugt ungefähr 10 bis ungefähr 24 Resten, die eine Aminosäurerestsequenz haben, die einer Aminosäurerestsequenz des EBV-EA-D-Proteins von ungefähr Position 350 bis ungefähr Position 362 von ihrem aminoterminalen Ende her entspricht, wobei die in Fig. 1 zugewiesenen Positionen und die Genomsequenz von Baer et al., Nature, 310, 207 (1984) verwendet werden. Das synthetische Polypeptid hat die Fähigkeit, immunologisch durch EA-D induzierte Antikörper zu binden.
In der bevorzugten Praxis kann das Polypeptid, wenn es mit einem immunogenen Träger wie KLH (keyhole limpet hemocyanin) als Konjugat verknüpft und in einer wirksamen Menge in einem wäßrigen Verdünnungsmittel in einen Säugetierwirt wie eine Ratte, Maus, Kaninchen oder Meerschweinchen eingeführt wird, die Sekretion von Antikörpern induzieren, die nicht nur mit dem Polypeptid des Konjugats eine Immunreaktion eingehen, sondern auch mit EA-D im denaturierten Zustand eine Immunreaktion eingehen. Noch mehr bevorzugt gehen diese induzierten Antikörper ferner eine Immunreaktion mit EA-D im nativen Zustand ein. Somit kann in bevorzugten Ausführungsformen ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung immunogene und antigene Determinanten des nativen EA-D-Proteins immunologisch nachahmen.
Als Beispiel für EA-D im nativen Zustand steht das Protein, wie es in Körperflüssigkeiten wie Blutplasma von Patienten mit akuter IM gefunden wird. Als Beispiel für EA-D im denaturierten Zustand steht das Protein nach Reduktion mit 2-Mercaptoethanol, wie es in SDS-PAGE und Western-Blotting- Analysen verwendet wird.
Bevorzugte Aminosäurerestsequenzen schließen die Sequenz, die von links nach rechts und in Richtung vom aminoterminalen zum carboxyterminalen Ende hin gelesen wird, welche durch die Formel dargestellt ist:
-PARPETPSPAIPS-;
pharmazeutisch annehmbare Salze davon und antigenisch verwandte Varianten davon ein.
Es wird darauf hingewiesen, daß ein Strich am Beginn oder Ende einer Aminosäurerestsequenz eine Bindung zu einem Rest wie H und OH an den Amino- bzw. Carboxyenden oder eine weitere Sequenz von einer oder mehreren Aminosäureresten bis zu einer Gesamtzahl von 40 Aminosäureresten in der Polypeptidkette angibt.
Es wird ferner darauf hingewiesen, daß die Sequenz der Aminosäurereste, die in dem Polypeptid zusätzlich zu der aus mindestens 13 Aminosäureresten bestehenden Sequenz, die einer Aminosäurerestsequenz des EA-D-Proteins von Position 350 bis Position 362 vom aminoterminalen Ende her entspricht, vorhanden sein kann, unerheblich ist, solange der grundlegende Charakter des Polypeptids bei der immunologischen Bindung an durch EA-D induzierte Antikörper nicht wesentlich beeinträchtigt wird. Noch mehr bevorzugt wird die charakteristische Immunogenizität beim Induzieren von Antikörpern, die mit dem Polypeptid und mindestens denaturiertem EA-D wie zuvor erörtert eine Immunreaktion eingehen, ebenfalls nicht wesentlich beeinträchtigt.
Am meisten bevorzugt besteht das Polypeptid im wesentlichen aus einer oder mehreren Aminosäurerestsequenzen, die mit den vorstehend erörterten Positionen des EA-D-Proteinmoleküls identisch sind. Diese am meisten bevorzugten Polypeptide, die mehrere Aminosäurerestsequenzen enthalten, die mit der Sequenz von EA-D, wie sie vorstehend beschrieben wurde, identisch sind, sind in einer Gruppe von Verbindungen, die hierin als "Polypeptidoligomere" bezeichnet und im folgenden erörtert werden.
Ein besonders bevorzugtes Polypeptid hat eine Aminosäurerestsequenz, die der von links nach rechts und in Richtung vom aminoterminalen zum carboxyterminalen Ende hin gelesenen, durch die Formel:
H-PARPETPSPAIPS-OH
dargestellten Sequenz; pharmazeutisch annehmbaren Salzen davon und antigenisch verwandten Varianten davon entspricht.
Wie unter Bezugnahme auf Fig. 1 ersichtlich ist, hat das vorstehende Polypeptid eine Aminosäurerestsequenz, die mit derjenigen der Positionen 350 bis 362 von EA-D, auf der Basis der Genomsequenz von Baer et al., identisch ist.
Ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung kann durch jede Methode synthetisiert werden, die Fachleuten auf dem Polypeptidgebiet bekannt sind. Eine ausgezeichnete Zusammenfassung der vielen so verfügbaren Methoden findet sich in J.M. Steward und J.D. Young, "Solid Phase Peptide Synthesis", W.H. Freeman Co., San Francisco, 1969; J. Meienhofer, "Hormonal Proteins and Peptides", Band 2, S. 46, Academic Press (New York), 1973, was die Festphasenpeptidsynthese betrifft; und E. Schroder und Kubke, "The Peptides", Band 1, Academic Press (New York), 1965, was die klassische Synthese in Lösung angeht.
Im allgemeinen umfassen diese Verfahren die sequentielle Addition von einer oder mehreren Aminosäuren oder in geeigneter Weise geschützten Aminosäuren an eine wachsende Peptidkette. Normalerweise wird entweder die Amino- oder Carboxylgruppe des ersten Aminosäurerests durch eine geeignete, selektiv entfernbare Schutzgruppe geschützt. Eine davon verschiedene, selektiv entfernbare Schutzgruppe wird für Aminosäuren, die eine reaktive Seitengruppe enthalten, wie etwa Lysin, verwendet.
Wenn eine Festphasensynthese als Beispiel verwendet wird, wird die geschützte oder derivatisierte Aminosäure an einen inerten festen Träger über ihre ungeschützte Carboxyl- oder Aminogruppe angehängt. Die Schutzgruppe der Amino- oder Carboxylgruppe wird dann selektiv entfernt und die nächste Aminosäure in der Sequenz mit der komplementären (Amino- oder Carboxyl-) Gruppe, die in geeigneter Weise geschützt ist, wird zugemischt und unter Bedingungen umgesetzt, die zum Bilden der Amidbindung mit dem bereits an den festen Träger angehängten Rest geeignet sind. Die Schutzgruppe der Amino- oder Carboxylgruppe wird dann von diesem neu addierten Aminosäurerest entfernt und dann wird die nächste (in geeigneter Weise geschützte) Aminosäure addiert usw. Nachdem alle gewünschten Aminosäuren in der richtigen Sequenz verknüpft worden sind, werden alle restlichen terminalen und Seitengruppen-Schutzgruppen (und der feste Träger) nacheinander oder gleichzeitig entfernt, um das endgültige Polypeptid zu ergeben.
Alle hierin identifizierten Aminosäurereste haben die natürliche L-Konfiguration. In Übereinstimmung mit der normalen Polypeptid-Nomenklatur [J. Biol. Chem., 243, 3557-59 (1969)] sind die Abkürzungen für Aminosäurereste wie in der folgenden Tabelle gezeigt: TABELLE DER ABKÜRZUNGEN SYMBOL AMINOSÄURE 1-Buchstaben-Schreibweise 2-Buchstaben-Schreibweise L-Tyrosin L-Glycin L-Phenylalanin L-Methionin L-Alanin L-Serin L-Isoleucin L-Leucin L-Threonin L-Valin L-Prolin L-Lysin L-Histidin L-Glutamin L-Glutaminsäure oder L-Glutamin L-Trypotophan L-Arginin L-Asparaginsäure oder L-Asparagin L-Cystein

C. Polypeptidoligomere

Die vorliegende Erfindung befaßt sich auch mit einem synthetischen Polypeptidoligomer, das mehrere aneinandergefügte synthetische repetitive Polypeptideinheiten enthält, worin mindestens zwei der repetitiven Einheiten Polypeptide dieser Erfindung, wie sie vorstehend erörtert wurden, sind. Ein solches Oligomer enthält eine Gesamtzahl von bis zu ungefähr 40 Aminosäureresten. Wie vorstehend erwähnt wurde, sind mehr bevorzugt alle repetitiven Einheiten nicht nur Polypeptide dieser Erfindung, sondern Polypeptide, deren Aminosäurerestsequenzen identisch mit der Sequenz von EA-D sind.
Ein Polypeptidoligomer dieser Erfindung ist auch dadurch gekennzeichnet, daß es die Fähigkeit hat, immunologisch an durch EA-D induzierte Antikörper zu binden. Mehr bevorzugt ist ein Polypeptidoligomer ferner dadurch gekennzeichnet, daß es die Fähigkeit hat, die Sekretion von Antikörpern, die immunologisch an EA-D binden, zu induzieren, wenn es an einen immunogenen Träger wie KLH gebunden ist und in einer wäßrigen Verdünnungsmittelzusammensetzung in einen Säugetierwirt, wie vorstehend beschrieben, eingeführt wird.
Ein besonders bevorzugtes Polypeptidoligomer enthält mehrere der besonders bevorzugten synthetischen Polypeptide dieser Erfindung mit der von links nach rechts und vom aminoterminalen zum carboxyterminalen Ende gelesenen Aminosäurerestsequenz, die durch die Formel dargestellt ist:
-PARPETPSPAIPS-.
Unter Verwendung der drei-Buchstaben-Abkürzungen aus der Tabelle der Abkürzungen kann das vorstehende Polypeptid auch durch die Formel dargestellt werden:
-ProAlaArgProGluThrProSerProAlsIleProSer-.
Somit sind die oligomeren Polypeptide dieser Erfindung genau wie die sie aufbauenden Polypeptide antigen gegen humane Anti-EA-D-Antikörper und sind noch mehr bevorzugt immunogen, wie vorstehend erörtert wurde. Diese oligomeren Polypeptide können deshalb verwendet werden, um die Erzeugung von Anti- EA-D-Antikörpern zu induzieren, die in den diagnostischen Verfahren und Systemen, die im folgenden erörtert werden, brauchbar sind, und sie können auch als Antigen in geeigneten diagnostischen Verfahren und Systemen verwendet werden.
Oligomere, die weniger als ungefähr 35 Aminosäurereste in dem gesamten oligomeren Polypeptid enthalten, werden typischerweise an einen immunogenen Träger wie KLH gebunden, um als Immunogen verwendet zu werden. Die oligomeren Polypeptide, die mehr als eine Gesamtzahl von ungefähr 35 Aminosäureresten enthalten, sind typischerweise ausreichend immunogen, um ohne einen Träger verwendet zu werden.
Ein oligomeres Polypeptid kann durch Aneinanderbinden der synthetisierten Polypeptidmonomere in einer Kopf-Schwanz- Weise unter Verwendung des obenerwähnten Festphasenverfahrens hergestellt werden, d. h., eine vollständige Polypeptidsequenz kann auf dem Harz hergestellt werden, gefolgt von einer oder mehreren der gleichen oder verschiedenen Polypeptidsequenzen, wobei die gesamte oligomere Einheit danach von dem Harz abgespalten und wie hierin beschrieben verwendet wird.
Alternativ dazu können Polypeptidoligomere als Polymer aus synthetischen Polypeptiden, die als Monomere, d. h. repetitive Einheiten, verwendet werden, hergestellt werden, wie im folgenden hier ausführlich beschrieben ist. Beispiele für ein Kettenabbruchsreagenz für einen solchen Zweck ist 2-Mercaptoethanol, Thioglycolsäure und Thiopropionsäure.

D. Polypeptidpolymere

So wie er hier verwendet wird ist der Ausdruck "Polypeptidpolymer" in seinen verschiedenen grammatikalischen Formen als Molekül definiert, welches mehrere synthetische Polypeptide dieser Erfindung als repetitive Einheiten enthält. Diese repetitiven Polypeptideinheiten sind nicht durch Polypeptidbindungen aneinandergefügt und das Polymer schließt mehr als ungefähr 100 Aminosäurereste ein. Somit hat ein Polymer dieser Erfindung eine scheinbare Molekülmasse Mr von ungefähr 10000 oder mehr, solange es in einer wäßrigen Zusammensetzung bei einem pH-Wert von ungefähr 5 bis ungefähr 9 und vorzugsweise bei einem pH-Wert von ungefähr 6,5 bis etwa 7,5 dispergierbar ist. Die repetitiven Polypeptideinheiten können gleich oder verschieden sein und können eine oder mehrere zusätzliche Sequenzen, die keine Aminosäurerestsequenz der vorliegenden Erfindung sind, einschließen, solang ein gegebenenfalls zusätzlich in dem Polymer vorhandenes Polypeptid nicht wesentlich d+e Immunreaktion der durch EA-D induzierten Antikörper mit dem Polymer stört oder anderweitig hemmt, d. h. die Antigenizität des Polymers stört. Das Vorhandensein eines Polypeptids, das kein Polypeptid der Erfindung ist, in dem Polymer hemmt vorzugsweise nicht wesentlich die Immunogenizität des Polymers.
Polypeptidpolymere (synthetische Multimere) haben typischerweise den Vorteil einer erhöhten Immunogenizität und Antigenizität. Hinzu kommt, daß ein Träger typischerweise nicht erforderlich ist, wenn ein polymeres Immunogen verwendet wird. Wenn verschiedene Polypeptidmonomere verwendet werden, um das Polymer aufzubauen, wird die Fähigkeit erhalten, mit Antikörpern gegen verschiedene antigene EA-D-Determinanten eine Immunreaktion einzugehen. Noch ein weiterer Vorteil ist die Fähigkeit eines solchen Polymers, Antikörper zu induzieren, die mit verschiedenen antigenen Determinanten von EA-D eine Immunreaktion eingehen, wenn es als Inokulum verwendet wird.
Ein beispielhaftes Polymer dieser Erfindung kann synthetisiert werden unter Verwendung der Polypeptidmonomere dieser Erfindung, die sowohl am amino- als auch carboxyterminalen Ende addierte Cysteinreste enthalten (diCys-Polypeptid). Die diCys-Polypeptidmonomere können durch intramolekulare, Interpolypeptid-Cysteindisulfidbindungen aneinander gebunden sein, wobei ein Oxidationsarbeitsschritt verwendet wird, um ein immunogenes, antigenes Polymer zu bilden. Das so hergestellte Polypeptidpolymer enthält mehrere synthetische Polypeptide dieser Erfindung als repetitive Einheiten. Diese repetitiven Einheiten sind durch die oben erörterten oxidierten Cystein (Cystin)-Reste aneinandergebunden.
Die Anwesenheit von einem oder zwei terminalen Cys-Resten in einem Polypeptid dieser Erfindung zum Zweck des Bindens des Polypeptids an einen Träger oder zum Herstellen eines Polypeptidpolymers, soll nicht so verstanden werden, daß die Aminosäurerestsequenz eines Polypeptids dieser Erfindung geändert wird.
Ein besonders bevorzugtes Polypeptidpolymer enthält eine Vielzahl der besonders bevorzugten synthetischen Polypeptide dieser Erfindung mit der von links nach rechts und vom aminoterminalen Ende zum carboxyterminalen Ende hin gelesenen Aminosäurerestsequenz, die durch die Formel dargestellt ist:
-PARPETPSPAIPS-.
Somit sind die synthetischen multimeren Polypeptide dieser Erfindung wie die sie auf bauenden Polypeptide gegen humane Anti-EA-D-Antikörper antigen und sind noch mehr bevorzugt immunogen, wie vorstehend erörtert wurde. Diese synthetischen multimeren Polypeptide können deshalb verwendet werden, um die Erzeugung von Anti-EA-D-Antikörpern zu induzieren, die in den im folgenden erörterten diagnostischen Verfahren und Systemen brauchbar sind, und können auch als Antigen in geeigneten diagnostischen Verfahren und Systemen verwendet werden.

E. Inokula

In einer weiteren Ausführungsform wird ein Polypeptid dieser Erfindung in einer pharmazeutisch annehmbaren wäßrigen Verdünnungsmittelzusammensetzung verwendet, um ein Inokulum zu bilden, welches, wenn es in einer wirksamen Menge verabreicht wird, in der Lage ist, Antikörper zu induzieren, die mit EA-D eine Immunreaktion eingehen.
Das Wort "Inokulum" in seinen verschiedenen grammatikalischen Formen wird hierin verwendet, um eine Zusammensetzung zu beschreiben, die ein Polypeptid dieser Erfindung als aktiven Bestandteil enthält, welcher zur Erzeugung von Antikörpern gegen EA-D verwendet wird. Wenn ein Polypeptid verwendet wird, um Antikörper zu induzieren, versteht sich, daß das Polypeptid mit einem immunogenen Träger verknüpft, als oligomeres Polypeptid frei oder mit einem Träger verknüpft als Konjugat oder als Polypeptidpolymer verwendet werden kann, aber zur Vereinfachung der Ausdrucksweise werden die verschiedenen Ausführungsformen der Polypeptide dieser Erfindung kollektiv hierin durch den Ausdruck "Polypeptid" und seine verschiedenen grammatikalischen Formen bezeichnet.
Für Polypeptide, die weniger als etwa 35 Aminosäurereste enthalten, ist es vorzuziehen, einen immunogenen Träger zum Zweck des Induzierens der Erzeugung von Antikörpern zu verwenden, wie bereits festgestellt wurde.
Wie ebenfalls bereits erwähnt wurde, können ein oder mehrere zusätzliche Aminosäurereste an die amino- oder carboxyterminalen Enden des synthetischen Polypeptids addiert werden, um die Bindung des Polypeptids an einen Träger zu unterstützen. Cysteinreste, die an die amino- oder carboxyterminalen Enden des synthetischen Polypeptids addiert sind, haben sich als besonders nützlich zum Bilden von Polymeren über Disulfidbindungen erwiesen. Es können jedoch auch andere auf dem Fachgebiet gut bekannte Verfahren zum Herstellen von Konjugaten verwendet werden. Beispiele für zusätzliche Verknüpfungsschritte schließen die Verwendung von Michael-Additions-Reaktionsprodukten, Dialdehyden wie Glutaraldehyd, Klipstein et al., J. Infect. Dis., 147, 318326 (1983) und dergleichen oder die Verwendung einer Carbodiimidtechnologie wie bei der Verwendung eines wasserlöslichen Carbodiimids unter Bildung von Amidverknüpfungen mit dem immunogenen Träger, wie sie vorstehend erörtert wurden, zum Verknüpfen einer Vielzahl von Polypeptiden unter Bildung eines synthetischen Multimers ein.
Brauchbare immunogene Träger sind auf dem Fachgebiet wohl bekannt und sind im allgemeinen selbst Proteine. Beispiele für solche Träger sind KLH (keyhole hemocyanin), Edestin, Thyroglobulin, Albumine wie Rinderserumalbumin (BSA) oder humanes Serumalbumin (HSA), rote Blutkörperchen wie Schaferythrocyten (SRBC), Tetanustoxoid, Choleratoxoid sowie Polyaminosäuren wie Poly(D-Lysin: D-Glutaminsäure) und dergleichen.
Wie ebenfalls auf dem Fachgebiet wohl bekannt ist, ist es oftmals vorteilhaft, ein synthetisches Polypeptid an seinen Träger durch eine dazwischenliegende Verknüpfungsgruppe zu binden. Wie bereits festgestellt wurde, ist Glutaraldehyd eine solche Verknüpfungsgruppe. Wenn jedoch Cystein verwendet wird, ist die dazwischenliegende Verknüpfungsgruppe vorzugsweise ein m-Maleimidobenxoyl-N- hydroxysuccinimid (MBS), welches hierin verwendet wurde.
Zusätzlich kann MBS zuerst an den Träger durch eine Ester- Amid-Austauschreaktion addiert werden, wie von Liu et al., Biochem., 80, 690 (1979) offenbart ist.
Danach kann auf die Addition eine Addition einer geschützten Mercaptogruppe wie Thiolessigsäure (CH&sub3;COSH) über die Maleimidodoppelbindung erfolgen. Nach der Spaltung der Acylschutzgruppe wird eine Disulfidbindung zwischen dem ungeschützten Mercaptan der Verknüpfungsgruppe und dem Mercaptan des zugegebenen Cysteinrests des synthetischen Polypeptids gebildet.
Die Wahl des Trägers hängt mehr von der letztendlichen Verwendung des Immunogens als von dem Determinanten-Bereich des Immunogens ab und beruht auf Kriterien, die nicht besonders mit der vorliegenden Erfindung in Zusammenhang stehen. Zum Beispiel sollte ein Träger ausgewählt werden, der keine abträgliche Reaktion in dem speziellen nichtmenschlichen Wirtstier (Empfänger) erzeugt.
Das vorliegende Inokulum enthält eine wirksame immunogene Menge eines Polypeptids dieser Erfindung als ein oligomeres Polypeptid oder als ein Polypeptidpolymer aus einzelnen Polypeptiden, die miteinander durch oxidierte Polypeptidterminale Cysteinreste verknüpft sind, oder als Konjugat, das an einen Träger gebunden ist. Die wirksame Menge des Polypeptids pro Dosiseinheit hängt u. a. von der angeimpften Tierart, dem Körpergewicht des Tieres und dem gewählten Inokulationszeitplan ab, was auf dem Fachgebiet wohl bekannt ist. Inokula enthalten typischerweise Polypeptidkonzentrationen von ungefähr 10 Mikrogramm bis ungefähr 500 Milligramm pro Inokulation (Dosis). Die angegebenen Mengen an Polypeptid beziehen sich auf das Gewicht des Polypeptids ohne das Gewicht eines Trägers, wenn ein Träger verwendet wird. Spezifische beispielhafte Inokula werden im folgenden beschrieben, wobei das Gewicht des Trägers plus des Polypeptids (Konjugat) angegeben ist.
Der Ausdruck "Dosiseinheit" bezieht sich auf physikalisch unterscheidbare Einheiten, die sich als Einzeldosen für Tiere eignen, wobei jede Einheit eine vorgegebene Menge von aktivem Material enthält, die so berechnet ist, daß sie die gewünschte therapeutische Wirkung in Verbindung mit dem erforderlichen Verdünnungsmittel, d. h. Träger oder der Grundlage ergibt. Die genauen Angaben für die neue Dosiseinheit dieser Erfindung werden festgelegt und sind direkt abhängig von (a) den einzigartigen Merkmalen des aktiven Materials und der speziellen immunologischen Wirkung, die erreicht werden soll, und (b) den Beschränkungen, welche die Vermischungsverfahren für ein solches aktives Material zur immunologischen Verwendung in Tieren auferlegen, wie sie ausführlich in der Beschreibung offenbart sind, wobei dieses Merkmale der vorliegenden Erfindung sind.
Inokula werden typischerweise aus dem getrockneten festen Polypeptid-Konjugat, dem oligomeren Polypeptid oder Polypeptidpolymer durch Dispergieren des Polypeptid- Konjugats oder Polypeptidpolymers in einem physiologisch unbedenklichen (annehmbaren) Verdünnungsmittel wie Wasser, Saline, phosphat-gepufferter Saline und dergleichen, welche wohl bekannt sind, unter Bildung einer wäßrigen Zusammensetzung hergestellt.
Inokula können auch ein Adjuvans als Teil des Verdünnungsmittels enthalten. Adjuvantien wie vollständiges Freundsches Adjuvans (CFA), unvollständiges Freundsches Adjuvans (IFA) und Alaun sind Materialien, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind, und sind im Handel aus verschiedenen Quellen erhältlich.

F. Rezeptoren

Antikörper und im wesentlichen ganze Antikörper, die durch die Polypeptide dieser Erfindung induziert sind (gegen diese erzeugt wurden) sowie Antikörperbindungsstellen, die aus solchen Antikörpern hergestellt wurden, stellen noch eine weitere Ausführungsform dieser Erfindung dar. Diese Moleküle werden hier kollektiv als Rezeptoren bezeichnet. Rezeptoren werden in Säugetierwirten wie Mäusen, Kaninchen, Ziegen, Meerschweinchen, Pferden und dergleichen durch Immunisierung unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Inokula erzeugt.
Geeignete Rezeptoren in monoklonaler Form, typischerweise ganze Antikörper, können auch unter Verwendung der von Niman et al., Proc. Natl. Sci., U.S.A., 80, 4949-4953 (1983) beschriebenen Hybridomtechnik hergestellt werden, wobei diese Beschreibung hierin durch Bezugnahme mitaufgenommen ist. Kurz gesagt wird zum Bilden des Hybridoms, von dem der monoklonale Rezeptor erzeugt wird, ein Myelom oder eine andere immortalisierte Zellinie mit Lymphocyten fusioniert, die aus der Milz eines mit einem Polypeptid dieser Erfindung hyperimmunisierten Säugetiers erhalten wurden.
Es ist bevorzugt, daß die Myelomzellinie von der gleichen Art wie die Lymphocyten stammt. Typischerweise ist eine Maus des Stammes 129 GlX' das bevorzugte Säugetier. Zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignete Mausmyelome schließen die hypoxanthin-aminopterin-thymidin-empfindlichen (HAT) Zellinien P3X63-Ag8.653 und Sp2/0-Ag14 ein, die von der American Type Culture Collection, Rockville, MD, unter den Bezeichnungen CRL 1580 bzw. CRL 1581 erhältlich sind.
Splenocyten werden typischerweise mit Myelomzellen fusioniert, wobei Polyethylenglycol (PEG) 1500 verwendet wird. Fusionierte Hybride werden durch ihre Empfindlichkeit gegenüber HAT selektiert. Hybridome, die Rezeptormoleküle dieser Erfindung sezernieren, werden unter Verwendung eines Enzymimmunosorbentassays (ELISA), wie hierin beschrieben, identifiziert.
Monoklonale Antikörper als Rezeptoren müssen nicht unbedingt von Hybridomüberständen erhalten werden, sondern können auch im allgemeinen in konzentrierterer Form aus der Aszitesflüssigkeit von Säugetieren erhalten werden, in die das gewünschte Hybridom eingeführt worden ist. Die Herstellung von monoklonalen Antikörpern unter Verwendung von Aszitesflüssigkeit ist gut bekannt und wird hierin nicht weiter abgehandelt.
Ein Rezeptor dieser Erfindung bindet sowohl an das Polypeptid, gegen das er erzeugt wurde, als auch an die entsprechende antigene EA-D-Determinantenstelle, welche das Polypeptid dieser Erfindung immunologisch nachahmt. Somit kann ein Polypeptid dieser Erfindung sowohl ein Immunogen als auch ein Antigen sein.
Die Rezeptoren dieser Erfindung, die durch ein Polypeptid dieser Erfindung induziert werden, einschließlich eines oligomeren Polypeptids und eines Polypeptidpolymers, können als oligoklonal im Vergleich zu natürlich vorkommenden polyklonalen Antikörpern beschrieben werden, da sie gegen ein Immunogen (das relativ kleine Polypeptid) erzeugt werden, welches relativ wenige Epitope hat im Vergleich zu den Epitopen, die von einem intakten EA-D-Molekül nachgeahmt werden. Folglich binden Rezeptoren dieser Erfindung an Epitope des Polypeptids, wogegen natürlich vorkommende Antikörper, die gegen das ganze EA-D-Molekül erzeugt wurden, an Epitope in dem gesamten EA-D-Molekül binden und als polyklonal bezeichnet werden.

F. Nachweisverfahren und -Systeme

1. Nachweis von Anti-EA-D-Antikörpern

Das synthetische Polypeptid der vorliegenden Erfindung ist besonders brauchbar zum Nachweisen des Vorhandenseins und der Menge von Anti-EA-D-Antikörpern in einer Körperflüssigkeitsprobe wie Blut, Serum oder Plasma.
In einer Ausführungsform befaßt sich die vorliegende Erfindung mit einem Verfahren zum Nachweis von Anti-EA- D-Antikörpern in einer Körperflüssigkeitsprobe, umfassend die Schritte:
(a) Bereitstellung einer Körperflüssigkeitsprobe für den Nachweis. Typischerweise wird eine solche Probe als bekannte Menge Blut und mehr bevorzugt als Serum oder Plasma bereitgestellt. Verfahren zum Bereitstellen von Proben von Blut, Plasma und Serum sind auf dem Fachgebiet gut bekannt und werden hier nicht weiter erörtert.
(b) Bereitstellung eines synthetischen Polypeptids, das im wesentlichen aus ungefähr 6 bis ungefähr 40 Aminosäureresten besteht, die eine Aminosäurerestsequenz haben, die im wesentlichen einer Aminosäurerestsequenz des EA-D-Proteins von ungefähr Position 350 bis ungefähr Position 362 vom aminoterminalen Ende her entspricht, wobei das synthetische Polypeptid die Fähigkeit hat, von durch EA-D induzierten Antikörpern immunologisch gebunden zu werden.
(c) Vermischen der Körperflüssigkeitsprobe mit dem Polypeptid unter Bildung einer Immunreaktionsmischung.
(d) Belassen der Mischung unter biologischen Testbedingungen und zwar über einen vorgegebenen Zeitraum, wie ungefähr 10 Minuten bis ungefähr 16-20 Stunden bei einer Temperatur von ungefähr 4ºC bis ungefähr 45ºC, der so bemessen ist, daß gegebenenfalls in der Probe vorhandene Anti-EA-D-Antikörper unter Bildung eines ersten Immunreaktionsteilnehmers an das Polypeptid immunologisch binden.
Biologische Testbedingungen sind solche, die die biologische Aktivität der Polypeptidmoleküle dieser Erfindung und der Anti-EA-D-Antikörper, die nachgewiesen werden sollen, aufrechterhalten, und sie schließen einen Temperaturbereich von ungefähr 4ºC bis ungefähr 45ºC, einen pH-Wert-Bereich von ungefähr 5 bis ungefähr 9 und eine Ionenstärke, die von der von destilliertem Wasser bis zu der von ungefähr ein-molarem Natriumchlorid reicht, ein. Verfahren zum Optimieren solcher Bedingungen sind im Fachgebiet wohl bekannt.
(e) Nachweis des gegebenenfalls gebildeten Immunreaktionsteilnehmers und daher der in der Immunreaktionsmischung gegebenenfalls vorhandenen Anti-EA-D-Antikörper.
Der Nachweis von Anti-EA-D-Antikörper enthaltenden Immunreaktionsteilnehmern, entweder direkt oder indirekt, kann durch im Fachgebiet gut bekannte Nachweismethoden durchgeführt werden. Zum Beispiel kann ein homogenes Nachweissystem verwendet werden, wie es in den U.S. Patenten 4,536,479; 4,233,401; 4,233,402 und 3,996,345 beschrieben ist, deren Offenbarungen hierin durch Bezugnahme mitaufgenommen sind.
In bevorzugten Ausführungsformen wird der erste Immunreaktionsteilnehmer von Schritt (d) weiter für den Nachweis nach Schritt (e) durch die folgenden Schritte vorbereitet:
(i) Zumischen eines biologisch aktiven, markierten spezifischen Bindungsmittels, vorzugsweise eines Rezeptors, der an in dem ersten Immunreaktionsteilnehmer gegebenenfalls vorhandenes Humanimmunglobulin bindet unter Bildung eines Komplexes, vorzugsweise eines markierten zweiten Immunreaktionsteilnehmers. Mehr bevorzugt ist das markierte spezifische Bindungsmittel spezifisch für die Immunglobulinklasse; d. h. das Bindungsmittel kann spezifisch mit einem Immunglobulin der IgG-, IgM- oder IgA-Klassen eine Immunreaktion eingehen, wie im folgenden erläutert ist. Das markierte spezifische Bindungsmittel ist zum Anzeigen des Vorhandenseins des spezifischen Bindungsmittels in einem Komplex fähig.
(ii) Die so gebildete Mischung aus markiertem spezifischen Bindungsmittel/erstem Immunreaktionsteilnehmer wird unter biologischen Testbedingungen belassen und zwar über einen vorgegebenen Zeitraum, der so bemessen ist, daß das markierte spezifische Bindungsmittel mit gegebenenfalls als erster Immunreaktionsteilnehmer vorhandenen Anti-EA-D- Antikörpern einen Komplex bildet.
Der Nachweis des Vorhandenseins des markierten spezifischen Bindungsmittels, das als Teil des zweiten Immunreaktionsteilnehmers gebunden ist, welcher Anti-EA- D-Antikörper enthält, ergibt einen Nachweis des Vorhandenseins von Anti-EA-D-Antikörpern in der Probe. In bevorzugten Ausführungsformen wird die Menge des markierten zweiten spezifischen Bindungsmittels, das als Teil des Komplexes gebunden ist, und dadurch die Menge der Anti-EA-D-Antikörper in der Probe bestimmt. Diese Menge kann Null sein, wodurch angezeigt wird, daß keine Anti-EA-D-Antikörper innerhalb der Nachweisgrenzen in der Probe vorhanden sind. Verfahren zum Nachweis des Vorhandenseins und der Menge eines markierten spezifischen Bindungsmittels hängen von der verwendeten Markierung ab, wobei solche Markierungen und Nachweisverfahren auf dem Fachgebiet gut bekannt sind.
Das Markieren von proteinartigen spezifischen Bindungsmitteln wie Rezeptoren in Form von ganzen Antikörpern ist auf dem Fachgebiet gut bekannt. Zum Beispiel können Rezeptoren, die von Hybridomen erzeugt wurden, durch metabolischen Einbau von Radioisotopenhaltigen Aminosäuren markiert werden, welche als Komponente in dem Gewebekulturmedium bereitgestellt werden. Siehe z. B. Galfre et al., Meth. Enzymol. 73, 3-46 (1981). Die Methoden der Proteinkonjugation oder Kupplung durch aktivierte funktionelle Gruppen sind besonders anwendbar. Siehe z. B. Aurameas et al., Scand. J. Immunol. Band 8, Suppl. 7, 7-23 (1978) und U.S. Patent 4,493,795, deren Offenbarungen hierin durch Bezugnahme mitaufgenommen sind. Zusätzlich kann eine positionsgerichtete Kupplungsreaktion durchgeführt werden, so daß die Markierung im wesentlichen nicht die Immunreaktion des zweiten Rezeptors mit seinem Zielantigen stört. Siehe z. B. Rodwell et al., Biotech. 3, 889-894 (1985)
Das Markierungsmittel kann ein fluoreszierendes Markierungsmittel sein, das chemisch an Antikörper oder Antigene bindet, ohne sie zu denaturieren, unter Bildung eines Fluorochroms (Farbstoffs), der als Immunfluoreszenztracer brauchbar ist. Geeignete Immunfluoreszenzmarkierungsmittel sind Fluorochrome wie Fluoresceinisocyanat (FIC), Fluoresceinisothiocyanat (FITC), 5-Dimethylamin-1-naphthalinsulfonylchlorid (DANSC), Tetramethylrhodaminisothiocyanat (TRITC), Lissamin, Rhodamin 8200 Sulphonylchlorid (RB 200 SC) und dergleichen. Eine Beschreibung von Immunfluoreszenzanalysemethoden findet sich bei DeLuca, "Immunofluorescence Analysis", in Antibody As A Tool, Marchalonis, et al., Hrsg., John Wiley & Sons, Ltd., Seiten 189-231 (1982), welches hierin durch Bezugnahme aufgenommen ist.
In bevorzugten Ausführungsformen ist die anzeigende Gruppe ein Enzym wie Meerrettichperoxidase (HRP), Glucoseoxidase oder dergleichen. In solchen Fällen, wo die hauptsächliche anzeigende Gruppe ein Enzym wie HRP oder Glucoseoxidase ist, sind zusätzliche Reagenzien erforderlich, um die Tatsache sichtbar zu machen, daß ein Rezeptor-Ligand-Komplex (Immunreaktionsteilnehmer) gebildet worden ist. Solche zusätzlichen Reagenzien für HRP schließen Wasserstoffperoxid und einen Oxidationsfarbstoffvorläufer wie Diaminobenzidin ein. Ein zusätzliches Reagenz, das zusammen mit Glucoseoxidase brauchbar ist, ist 2,2'-Azinodi-(3-ethylbenzthiazolin-G-sulfonsäure) (ABTS). Radioaktive Elemente sind ebenfalls brauchbare Markierungsmittel und werden zur Veranschaulichung hierin verwendet.
Ein Beispiel für ein radioaktives Markierungsmittel ist ein radioaktives Element, das Gammastrahlenemissionen ergibt. Elemente, die selbst Gammastrahlen emittieren, wie ¹²&sup4;I, ¹²&sup5;I, ¹²&sup8;I, ¹³¹I, ¹³²I und &sup5;¹Cr stellen eine Klasse von anzeigenden Gruppen aus Gammastrahlenemission ergebenden radioaktiven Elementen dar. Besonders bevorzugt ist ¹²&sup5;I. Eine weitere Gruppe von brauchbaren Markierungsmitteln sind diejenigen Elemente wie ¹¹C, ¹&sup8;F, 150 und ¹³N, die selbst Positronen emittieren. Die so emittierten Positronen erzeugen Gammastrahlen beim Zusammentreffen mit Elektronen, die in dem Körper des Tieres vorhanden sind. Brauchbar ist auch ein Beta- Strahler wie ¹¹¹Indium oder 3H.
Die Nachweisverfahren und -Systeme der vorliegenden Erfindung können ein Antigen oder einen Rezeptor dieser Erfindung verwenden, der an einer festen Matrix als fester Träger angebracht ist.
Das Antigen oder der Rezeptor ist typischerweise an der festen Matrix durch Adsorption aus einem wäßrigen Medium angebracht, obwohl verschiedene Arten der Adsorption, ebenso wie andere Arten des Anbringens, die Fachleuten gut bekannt sind, verwendet werden können. Beispiele für solche Arten sind die Reaktion des Rezeptors oder Antigens mit der reaktiven Carboxylfunktion, die durch die Reaktion von Cyanogenbromid mit glucosehaltigen Matrizes wie vernetzter Dextrose oder Cellulose erzeugt wird, Glutaraldehydverknüpfung, wie im folgenden in Verbindung mit Latexpartikeln erörtert wird, und dergleichen.
Brauchbare feste Matrizes sind auf dem Fachgebiet gut bekannt. Solche Materialien schließen das vernetzte Dextran, welches unter dem Warenzeichen SEPHADEX von Pharmacia Fine Chemicals (Piscataway, NJ) im Handel erhältlich ist; Agarose; Kugeln aus Polystyrolkugeln, die ungefähr 1 um bis ungefähr 5 mm Durchmesser haben, die von Abbott Laboratories of North Chicago, IL erhältlich sind; Polyvinylchlorid, Polystyrol, vernetztes Polyacrylamid, Nitrocellulose oder Gewebe auf Nylonbasis wie Bögen, Streifen oder Kissen (paddles); Glas; oder Röhrchen, Platten oder die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte wie z. B. solche, die aus Polystyrol oder Polyvinylchlorid gemacht sind, ein.
Latexpartikel, die in Nachweisverfahren vom Agglutinierungs-Typ brauchbar sind, sind auch brauchbare feste Matrizes. Solche Materialien werden von der Japan Synthetic Rubber Company in Tokyo, Japan, geliefert und werden als Carboxy-funktionelle Partikel beschrieben, die in einer anionischen Seife dispergiert sind. Typische Chargen von solchen Partikeln haben einen mittleren Durchmesser von 0,308 um und haben eine durchschnittliche Verteilung der Carboxy-funktionellen Gruppe von etwa 15 bis 30 Quadrat-Ångström pro Carboxygruppe.
Vor der Verwendung werden die Partikel mit einem Diamin wie 1,3-Diamino-3-propanol umgesetzt, um eine Vielzahl von Amidbindungen mit den Carboxygruppen des Partikels zu bilden, wobei freie Aminogruppen beibehalten werden. Die freien Amine werden danach mit Dialdehyd wie Glutaraldehyd und dem Rezeptor oder Antigen unter Bildung von Schiff'schen Basen als Reaktionsprodukten umgesetzt. Die Schiff'schen Basen als Reaktionsprodukte werden danach mit einem wasserlöslichen Reduktionsmittel wie Natriumborhydrid reduziert, um einen brauchbaren festen Träger zu ergeben.
Für Fachleute ist klar, daß es zahlreiche Immunassayverfahren gibt, die hier verwendet werden können. Es wird jedoch jedes Verfahren in Erwägung gezogen, welches zu einer Anzeige führt, die durch die Reaktion eines Anti- EA-D-Antikörpers mit einem Polypeptid dieser Erfindung hervorgerufen wird. Darüber hinaus ist, wenn auch die speziell beschriebenen Nachweissysteme und -Verfahren eine feste Phase verwenden, die Erfindung nicht derart beschränkt. Jedes dieser Nachweisverfahren kann Einzel- oder Doppelantikörpermethoden einsetzen, in denen ein anzeigendes Mittel verwendet wird, um die Immunreaktion und dadurch die Bindung eines Antikörpers, der mit einem Polypeptid dieser Erfindung nachgewiesen werden soll, anzuzeigen. Beispielhafte Methoden werden erklärt in Maggio, Enzyme Immunoassay, CRC Press, Cleveland, OH (1981); und in Goldman, Fluorescent Antibody Methods, Academic Press, New York, NY (1980).

2. Diagnosesystem zum Nachweis von Anti-EA-D-Antikörpern

Ein Diagnosesystem, vorzugsweise in Kit-Form, welches zum Ausführen der Anti-EA-D-Antikörper-Nachweisverfahren dieser Erfindung brauchbar ist, schließt, als getrennt verpackte Bestandteile, ein: (a) ein synthetisches Polypeptid, das im wesentlichen aus ungefähr 6 bis ungefähr 40 Aminosäureresten mit einer Aminosäurerestsequenz, die im wesentlichen einer Aminosäurerestsequenz des EBV-EA-D-Proteins von ungefähr Position 350 bis ungefähr Position 362 vom aminoterminalen Ende her entspricht, besteht, wobei das Polypeptid die Fähigkeit hat, von Antikörpern, die durch EA-D induziert sind, immunologisch gebunden zu werden, und (b) ein markiertes spezifisches Bindungsmittel, um die Immunrektion von Anti-EA-D-Antikörpern mit dem Polypeptid anzuzeigen. Vorzugsweise ist das markierte spezifische Bindungsmittel ein Rezeptor, der mit einem Enzym verknüpft ist.
In bevorzugten Ausführungsformen schließt das System ferner eine feste Matrix als festen Träger ein, an die das Polypeptid angebracht werden kann. Brauchbare feste Matrizes sind bereits beschrieben worden. Vorzugsweise ist jedoch die feste Matrix die Vertiefung einer Mikrotiterplatte. Am meisten bevorzugt wird der feste Träger mit einer bekannten Menge Polypeptid versehen, die an der festen Matrix angebracht wird.
In bevorzugten Ausführungsformen schließt das System auch Antikörper, die gegen ein Polypeptid der Erfindung erzeugt wurden, zur Verwendung als positive Kontrolle ein.
Bekannte Mengen des Polypeptids und des markierten spezifischen Bindungsmittels werden bereitgestellt. Diese Mengen sind zumindest ausreichend, um einen Assay durchzuführen. Das Polypeptid und das markierte spezifische Bindungsmittel werden typischerweise in einer Form und Menge bereitgestellt, die dazu bestimmt ist, bis zu einem vorgeschriebenen Volumen mit Wasser, Saline oder einem Puffer, wie im folgenden beschrieben, verdünnt zu werden.
Es können auch zusätzliche verpackte Bestandteile in dem System enthalten sein. Solche verpackten Bestandteile können (i) Puffersalze in trockener oder flüssiger Form, (ii) Enzymsubstrate wie o-Phenylendiamin und dergleichen enthalten.

3. Nachweisverfahren für EA-D

Ein Verfahren zum Nachweisen des Vorhandenseins von EA-D in einer Körperflüssigkeitsprobe wird ebenfalls hierin in Erwägung gezogen. Im allgemeinen wird eine zu untersuchende Körperflüssigkeitsprobe, wie lysierte periphere Blutlymphocyten (PBL), die durch Aceton- oder Methanolfixierung lysiert sind, bereitgestellt. Die Probe wird mit Rezeptormolekülen vermischt, die eine Antikörperbindungsstelle enthalten, die durch ein synthetisches Polypeptid dieser Erfindung induziert ist. Die Mischung wird unter biologischen Testbedingungen belassen und zwar über einen vorgegebenen Zeitraum, der so bemessen ist, daß in der Körperflüssigkeitsprobe vorhandenes EA-D mit den Rezeptormolekülen eine Immunreaktion eingeht; die Menge dieser Immunreaktion (d. h. die Menge des gebildeten Immunreaktionsteilnehmers) wird dann gemessen, um zu bestimmen, ob EA-D- Moleküle in der untersuchten Körperflüssigkeitsprobe vorhanden oder nicht vorhanden waren.

4. Diagnosesystem zum Nachweis von EA-D

Ein Diagnosesystem, vorzugsweise in Kit-Form, welches zum Ausführen des vorstehenden Nachweisverfahrens brauchbar ist, enthält als getrennt verpackte Bestandteile (a) Rezeptoren dieser Erfindung, die mit EA-D eine Immunreaktion eingehen, (b) ein markiertes spezifisches Bindungsmittel zum Anzeigen der Immunrektion der Rezeptoren dieser Erfindung mit EA-D.
In bevorzugten Ausführungsformen enthält der Kit ferner als getrennt verpackte Bestandteile ein amplifizierendes Reagenz wie etwa Komplement, wie Meerschweinchen- Komplement, Anti-Immunglobulin-Antikörper oder S. aureus cowan-Stamm-Protein A, welches mit den Rezeptoren reagiert. In diesen Ausführungsformen ist das markierte spezifische Bindungsmittel in der Lage, spezifisch das amplifizierende Mittel zu binden, wenn das amplifizierende Mittel an einen Rezeptor dieser Erfindung gebunden ist.
Rezeptormoleküle und getrennte anzeigende Mittel von irgendeinem hierin beschriebenen Diagnosesystem wie auch das oben beschriebene amplifizierende Reagenz können in Lösung, als flüssige Dispersion oder als im wesentlichen trockenes Pulver, z. B. in lyophilisierter Form, bereitgestellt werden. Wenn das anzeigende Mittel ein von dem amplifizierenden Reagenz getrenntes Molekül ist, ist es bevorzugt, daß das anzeigende Mittel getrennt verpackt ist. Wenn das anzeigende Mittel ein Enzym ist, kann das Substrat des Enzyms ebenfalls in einem getrennt verpackten Bestandteil des Systems bereitgestellt werden. Eine feste Matrix wie der vorstehend beschriebene Mikroskopobjektträger, ein oder mehrere Puffer und Aceton können ebenfalls als getrennt verpackte Elemente in diesem Diagnosetestsystem enthalten sein.
Die hier in Verbindung mit Diagnosesystemen erörterten Packungen sind die herkömmlicherweise bei Diagnosesystemen verwendeten. Solche Packungen schließen Glas- und Kunststoff- (z. B. Polyethylen, Polypropylen und Polycarbonat) Flaschen, Gläschen, aus Kunststoff und Kunststoffolien laminierte Hüllen und dergleichen ein.

Beste Form der Ausführung der Erfindung

Die folgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung erläutern, aber nicht beschränken.

Beispiel 1: Synthese der Polypeptide

Um das EA-D-Gen zu lokalisieren und sein Leseraster zu bestimmen, wurde ein Teil des aminoterminalen Endes des EA-D-Proteins sequenziert, wobei affinitätsgereinigtes EA-D verwendet wurde. Die Aminosäurerestsequenz, die so erhalten wurde, wurde mit möglichen Aminosäurerestsequenz-Translationen des EBV-Genoms verglichen, bis eine Übereinstimmung gefunden wurde, wodurch das mutmaßliche EA-D-Gen und sein Leseraster identifiziert wurden. Auf der Basis dieses Leserasters ist die translatierte Aminosäurerestsequenz des EA-D-Proteingens in Fig. 1 für den EBV-Stamm gezeigt, der von Baer et al., Nature 310, 207 (1984) verwendet wurde.
Unter Verwendung der oben erhaltenen Aminosäurerestsequenz wurde eine Reihe von kurzen synthetischen Polypeptiden, die Teilen dieses translatierten Gens entsprachen, synthetisiert und auf ihre Fähigkeit zum Nachahmen von antigenen Determinanten von nativem EA-D hin untersucht. Die Aminosäurerestsequenzen dieser Polypeptide und die Lage ihrer Sequenzen in dem EA-D- Protein vom aminoterminalen Ende her sind, von links nach rechts und vom aminoterminalen zum carboxyterminalen Ende her gelesen, in Tabelle 1 unten gezeigt. Tabelle 1 Synthetische Polypeptide, die vom EA-D-Molekül abgeleitet sind Bezeichnung Sequenz Lage
¹ Lage vom aminoterminalen Ende des EA-D-Moleküls her, wie es translatiert und aus den Genomsequenzdaten vorhergesagt wurde, die in Baer et al., Nature, 310, 207 (1984) beschrieben sind.
² Das carboxyterminale Cystein, das zum Zweck der Verknüpfung addiert wurde, ist in der verwandten EA-D-Protein-Aminosäurerestsequenz nicht vorhanden.
Die in Tabelle 1 oben gezeigten Polypeptide wurden chemisch durch Festphasenverfahren, wie sie bei Merrifield et al., J. Am. Chem. Soc., 85, 2149-2154 (1963) und Houghten, et al., Int. J. Pest. Prot. Res. 16, 311-320 (1980) beschrieben sind, synthetisiert. Das Festphasenverfahren der Polypeptid-Synthese wurde unter Verwendung eines Vega Model 250C Polypeptid- Synthesegeräts durchgeführt, welches von Vega Biotechnologies, Inc., Tucson, AZ im Handel erhältlich ist.
Mit Ausnahme von K9 wurde an die Polypeptide ein Cysteinrest an das carboxylterminale Ende addiert, um das Verknüpfen mit einem Proteinträger, wie unten beschrieben, zu unterstützen. Die Zusammensetzung aller Polypeptide wurde durch Aminosäureanalyse bestätigt.
Beim Herstellen eines synthetischen Polypeptids dieser Erfindung durch das vorstehende Festphasenverfahren wurden die Aminosäurereste an ein Harz (feste Phase) über eine Esterbindung vom carboxyterminalen Rest her angeknüpft. Wenn das Polypeptid an einen Träger über einen Cys-Rest gebunden werden soll oder über terminale Cys-Reste polymerisiert werden soll, ist es günstig, diesen Cys-Rest als carboxyterminalen Rest zu verwenden, der an das Harz über eine Esterbindung gebunden wird.
Die alpha-Aminogruppe jeder zugegebenen Aminosäure wurde typischerweise durch eine tertiär-Butoxycarbonyl (t-BOC)-Gruppe geschützt, bevor die Aminosäure an die wachsende Polypeptidkette addiert wurde. Die t-BOC-Gruppe wurde dann vor der Addition der nächsten Aminosäure an die wachsende Polypeptidkette entfernt.
Reaktive Aminosäurenseitenketten wurden ebenfalls während der Synthese der Polypeptide geschützt. Gebräuchliche Seitenkettenschutzgruppen wurden für die verbliebenen Aminosäurereste wie folgt verwendet: O-(p-brombenzyloxycarbonyl) für Tyrosin; O-Benzyl für Threonin, Serin, Asparaginsäure und Glutaminsäure; S-Methoxybenzyl für Cystein, Dinitrophenyl für Histidin; 2-Chlorbenzoxycarbonyl für Lysin und Tosyl für Arginin.
Vor der Verwendung wurden die geschützten Aminosäuren aus geeigneten Lösungsmitteln umkristallisiert, so daß sie in der Dünnschicht-Chromatographie einzelne Punkte ergaben. Die Verknüpfungen wurden typischerweise unter Verwendung eines zehnfachen molaren Überschusses der geschützten Aminosäure und von Dicyclohexyl-Carbodiimid gegenüber der Anzahl der Milliäquivalente der ursprünglichen N-terminalen Aminosäure durchgeführt. Ein zweimolarer Überschuß beider Reagenzien kann ebenfalls verwendet werden. Für Asparagin wurde eine gleiche molare Menge N-Hydroxy-benzotriazol zu der geschützten Aminosäure zugegeben und Dimethylformamid wurde als Lösungsmittel verwendet. Alle Verknüpfungsreaktionen liefen zu mehr als 99% vollständig ab, wenn sie durch den Picrinsäuretest von Gisin, Anal. Chem. Acta. 58, 248-249 (1972), getestet wurden.
Nach der Herstellung eines gewünschten Polypeptids wurde ein Teil des daraus hervorgehenden geschützten Polypeptids (etwa 1 g) mit 2 ml Anisol behandelt und etwa 20 ml wasserfreier Fluorwasserstoff wurde in das Reaktionsgefäß bei Trockeneistemperatur kondensiert. Das daraus hervorgehende Gemisch wurde bei ungefähr 4ºC ungefähr 1 Stunde lang gerührt, um die Schutzgruppen abzuspalten und das Polypeptid von dem Harz zu entfernen. Nach dem Verdampfen des Fluorwasserstoffs bei einer Temperatur von 4ºC mit einem N&sub2;-Strom wurde der Rückstand mit wasserfreiem Diethylether dreimal extrahiert, um das Anisol zu entfernen, und der Rückstand wurde in vacuo getrocknet.
Das vakuumgetrocknete Material wurde mit 5%iger wäßriger Essigsäure (3 · 50 ml) extrahiert, um das freie Polypeptid von dem Harz zu trennen. Die extrakthaltige Lösung wurde lyophilisiert, um ein monomeres nichtoxidiertes Polypeptid zu ergeben.

Beispiel 2: Herstellung von Oligomeren

Ein synthetisches Oligomer dieser Erfindung kann durch die Festphasensynthese aus einer Vielzahl der Polypeptide dieser Erfindung hergestellt werden, die Ende an Ende (Kopf an Schwanz) durch eine Amidbindung zwischen dem carboxylterminalen Rest des einen Polypeptids und dem aminoterminalen Rest eines zweiten Polypeptids miteinander verknüpft sind. Solche synthetischen Oligomere werden vorzugsweise als einzelnes langes Polypeptid-Oligomer synthetisiert, aber sie können auch als individuelle Polypeptide hergestellt werden, die im Anschluß an ihre individuelle Synthese miteinander verknüpft werden, wobei ein Carbodiimidreagenz wie 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3- ethyl-carbodiimid-hydrochlorid in Wasser verwendet wird.

Beispiel 3: Herstellung von Polymeren

Ein Polypeptidpolymer (synthetisches Multimer) dieser Erfindung kann durch Synthetisieren eines Polypeptids dieser Erfindung, wie in Beispiel A erörtert, und durch Einschluß eines Cysteinrests sowohl am aminoterminalen als auch am carboxyterminalen Ende unter Bildung eines an beiden Seiten mit Cys-Enden versehenen Polypeptids in einer nicht-oxidierten, reduzierten Form, hergestellt werden. Nach der Synthese gemäß einer typischen laborüblichen Herstellungsweise werden 10 Milligramm des diCys-Polypeptids (welches Cysteinreste in nichtoxidierter Form enthält) in 250 Millilitern (ml) eines 0,1 molaren (M) Ammonium-bicarbonatpuffers gelöst. Das gelöste beidseitig mit Cys-Enden versehene Polypeptid wird dann an der Luft oxidiert, indem die resultierende Lösung über einen Zeitraum von ungefähr 18 Stunden in der Luft bei normaler Umgebungstemperatur oder solange, bis kein durch den Ellman-Test nachweisbares freies Mercaptan mehr vorhanden ist, vorsichtig gerührt wird. [Ellman, Arch. Biochem. Biophys., 82, 70-77 (1959).]
Das so hergestellte Polymer enthält eine Vielzahl der synthetischen repetitiven Polypeptideinheiten, die durch oxidierte Cystein(Cystin)-Reste aneinandergebunden sind. Solche Polymere enthalten typischerweise ihre repetitiven Polypeptideinheiten, die in einer Kopf-Schwanz-Weise wie auch in Kopf-Kopf- und Schwanz-Schwanz-Weise aneinandergebunden sind; d. h. die aminoterminalen Enden von zwei repetitiven Polypeptideinheiten können durch einen einzelnen Cystinrest ebenso aneinandergebunden sein wie zwei carboxylterminale Enden, da die Verknüpfungsgruppen an beiden Polypeptidenden identisch sind.

Beispiel 4: Verknüpfung mit Trägern

Die synthetischen Polypeptide wurden an KLH (keyhole limpet hemocyanin) als immunogenen Träger durch das in Liu et al., Biochem., 80, 690 (1979) beschriebene Verfahren geknüpft. Kurz zusammengefaßt wurden 4 Milligramm (mg) des Trägers mit 0,51 mg m-Maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimidester aktiviert und anschließend mit 5 mg des Polypeptids über ein amino- oder carboxyterminales Cystein reagieren gelassen, um ein Konjugat zu ergeben, welches ungefähr 10 bis ungefähr 35 Gew.-% Polypeptid enthielt.

Beispiel 5: ELISA-Assay für Anti-EA-D-Antikörper

Serumproben von Patienten mit einer Vielzahl von EBV-assoziierten klinischen Zuständen wurden auf das Vorhandensein von Anti-EA-D-Antikörpern unter Verwendung des im folgenden beschriebenen ELISA untersucht. Die untersuchten Seren waren von Patienten, bei denen akute infektiöse Mononukleose (IM) auf der Grundlage ihrer klinischen Merkmale und einer positiven Agglutinierung roter Blutkörperchen vom Schaf (d. h. heterophil) diagnostiziert wurde. Um die IM-Diagnose zu bestätigen, wurden rekonvaleszente Seren von diesen Patienten untersucht und es wurde gefunden, daß sie Anti-EBNA-1- und Anti-VCA (VCA')-Antikörper enthielten.
Normale Erwachsenenseren wurden von gesunden Personen erhalten, die für gegen heterophile, VCA und EBNA-1-Antigene gerichtete Antikörper negativ waren. Diese Gruppe, die als VCA-negativ (VCA-) bezeichnet wurde, hatte vermutlich keine primäre EBV-Infektion durchgemacht. Eine zweite Gruppe von gesunden normalen Spendern hatte positive Anti-VCA und Anti-EBNA-1- Antikörpertiter. Diese zweite Kontrollgruppe, die als VCA-positiv (VCA&spplus;) bezeichnet wurde, hatte vermutlich bereits zuvor Kontakt mit EBV gehabt.
Seren von Patienten mit akuter Cytomegalievirus- (CMV)-Infektion, die durch erhöhte rekonvaleszente Anti-CMV- Antikörpertiter bestimmt wurde, wurden ebenfalls untersucht. Die untersuchten Seren von Patienten mit Sjogren's Syndrom (SS), welche Keratokonjunktivitis sicca, Xerostomie, und eine positive Biopsie der Nebenspeicheldrüsen (Stufe IV auf einer Skala von I bis IV) aufwiesen, hatten erhöhte Autoantikörpertiter einschließlich Anti-Kern-Antigen und Rheumatoid-Faktor. Untersucht wurden auch Seren von Patienten mit rheumatoider Arthritis (RA), die aber keine damit verbundenen SS-Symptome aufwiesen.
Synthetisches Polypeptid wurde an die Wände von Mikrotiterplattenvertiefungen (Immunolon II; Dynatech Laboratories, Inc., Alexandria, VA) als Matrix angebracht, indem zu jeder Vertiefung 0,050 ml boratgepufferte Saline (BBS; 200 mM Natriumborat, 160 mM NaCl, pH 8,0) welche 10 Mikrogramm pro Milliliter (ug/ml) Polypeptid enthielt, zugemischt wurde. Die Mischung wurde ungefähr 16 Stunden lang bei ungefähr 4ºC belassen. Nichtgebundenes Polypeptid wurde von den Vertiefungen durch Umdrehen der Platten und Schütteln abgetrennt. Restliche nicht-spezifische Bindungsstellen wurden dann durch Zumischen von 0,200 ml Blockierungslösung [PBS (10 mM Natriumphosphat, 150 mM NaCl, pH 7,3), welches 10% normales Ziegenserum (NGS) enthielt] in jede Vertiefung blockiert. Die so gebildeten Mischungen wurden ungefähr 90 Minuten bei 37ºC in einer feuchtgehaltenen Kammer belassen. Die Blockierungslösung wurde dann aus den Vertiefungen durch Umdrehen und Schütteln entfernt und die so gebildeten festen Träger wurden an der Luft ungefähr 1 Stunde lang bei 37ºC trocknen gelassen.
Zu jeder der mit Polypeptid überzogenen Vertiefungen (festen Träger) wurden 0,200 ml Serum, das 1 : 20 in Blockierungslösung verdünnt war, zugegeben, um eine Fest-Flüssig-Phasen-Immunreaktionsmischung zu bilden. Die Mischungen wurden ungefähr 1 Stunde lang bei 25ºC belassen. Nichtgebundenes Material wurde dann von den Vertiefungen durch dreimaliges Waschen mit BBS, welche 0,05% Tween 20 [Polyoxyethylen-(30)-sorbitan-monolaurat] (Sigma) enthielt, abgetrennt.
Die Menge des gebildeten an der festen Phase angebrachten Immunreaktionsteilnehmers wurde durch Zumischen von 0,200 ml eines für die Humanimmunglobulinklasse spezifischen Antikörpers, der mit Meerrettichperoxidase (HRP) verknüpft war, der 1:1000 in BBS, welches 10% NGS enthielt, verdünnt war, unter Bildung einer zweiten Fest-Flüssig-Phasen-Mischung nachgewiesen. Um IgG- und IgM-Antikörper nachzuweisen, wurden HRP-verknüpfte monoklonale Mäuse-anti-human-IgG, bzw. Mäuse-anti-human- IgM-Antikörper verwendet (Ortho Diagnostics, Raritan, NJ). Um IgA-Antikörper nachzuweisen, wurde HRP-verknüpftes Ziegen-anti-human-IgA verwendet (Kiregaard und Perry, Gaithersburg, MD). Die zweiten Fest/Flüssig- Phasen-Mischungen wurden ungefähr eine Stunde lang bei ungefähr 25ºC belassen. Nicht-gebundenes Material wurde dann von dem an der festen Phase angebrachten Sandwich- (zweiten) Immunreaktionsteilnehmer durch fünfmaliges Waschen, wie oben beschrieben, abgetrennt.
Die Menge des an der festen Phase angebrachten Sandwich- (zweiten)-Immunreaktionsteilnehmers, der die HRP- Markierung enthielt, wurde dann durch Zumischen von 0,200 ml o-Phenylendiamin-Substratlösung (OPD, Sigma), die nach den Herstellerangaben frisch zubereitet wurde, nachgewiesen. Eine Färbung konnte sich über einen Zeitraum von ungefähr 15 bis ungefähr 30 Minuten bei ungefähr 25ºC entwickeln. Die Substratumwandlungsreaktion wurde dann durch Zumischen von 0,050 ml 4N H&sub2;SO&sub4; zu jeder Vertiefung beendet. Die optische Dichte (O.D.) der Mischungen wurde bei einer Wellenlänge von 490 Nanometern (nm) bestimmt, wobei ein Dynatech MR6000 (Dynatech Laboratories, Inc.) Mikrotiterplatten- Lesegerät verwendet wurde.
Die Ergebnisse der Untersuchung der IM-Seren und der normalen Seren auf Anti-EA-D-Antikörper sind in Fig. 2 gezeigt. Unter Verwendung von Polypeptid K7, das an die feste Matrix gebunden war, wurde eine signifikant höhere Bindung von IgG-, IgA- und IgM-Antikörpern aus IM- Patientenseren im Vergleich zu normalen Seren beobachtet. Im Gegensatz dazu wiesen die synthetischen Polypeptide K5, K8 und K9 keine erhöhte Immunreaktivität mit IM-Seren im Vergleich zu den normalen Seren auf. Es war jedoch eine niedrige Immunreaktivität gegen das Polypeptid K6 in einigen IM-Seren vorhanden.
Seren von Patienten mit nasopharyngealem Karzinom (NPC), einer mit EBV in Beziehung stehenden Erkrankung, und mit SS wiesen ebenfalls eine erhöhe Immunreaktivität mit dem Polypeptid K7 im Vergleich zu normalen Seren auf (Fig.
3). Im Gegensatz dazu zeigten Seren von Patienten mit RA, die keine Siccasymptome aufwiesen, keine signifikante Anti-Polypeptid-K7-Aktivität.
Eine zeitliche Verlaufsstudie wurde ebenfalls unter Verwendung des oben beschriebenen ELISA durchgeführt.
Reihenproben von vier IM-Patienten, die während eines Zeitraums erhalten wurden, in dem sie unter IM-Symptomen litten, wurden auf das Vorhandensein von Anti-K7- und Anti-EBNA-1-Antikörpern hin untersucht, wobei das Polypeptid K7 bzw. das Polypeptid von Rhodes et al., J. Immunol., 134, 211-16 (1985) an der festen Matrix angebracht wurden. Diese Ergebnisse, die in Fig. 4 gezeigt sind, zeigen an, daß Anti-EA-D-Polypeptid- Antikörper in höheren Konzentrationen zu Beginn der EBV-Infektion auftreten als Anti-EBNA-1-Antikörper.
Somit kann das Nachweisverfahren dieser Erfindung Antikörper nachweisen, die immunologisch an ein Polypeptid dieser Erfindung in den Seren von Patienten mit EBV-assoziierten Erkrankungen binden. Man nimmt an, daß diese polypeptid-reaktiven Antikörper durch entsprechende Bereiche des EA-D-Proteins infolge einer EBV-Infektion induziert wurden.

Beispiel 6: Polypeptidkonzentration

Die Auswirkungen einer Änderung der Konzentration der polypeptidhaltigen Lösung, die verwendet wurde, um die Wände von Mikrotiterplattenvertiefungen zu überziehen, um feste Träger zu bilden, wurden untersucht. Lösungen, die 0,1, 1,0, 10 und 100 ug/ml Polypeptid K7 in BBS enthielten, wurden verwendet, um das Polypeptid wie in Beispiel 5 beschrieben an die Wände der Vertiefungen anzubringen. Ein ELISA zum Nachweisen von Anti-EA-D-IgM- Antikörpern wurde gemäß Beispiel 5 durchgeführt, wobei Seren von normalen Personen (VCA+ und VCA-) und von einem IM-Patienten verwendet wurden. Alle Seren wurden in einer 1 : 20-Verdünnung verwendet.
Die Ergebnisse dieser Studie sind in Fig. 5A gezeigt. Diese Ergebnisse zeigen an, daß die Menge des in jedem der untersuchten Seren nachgewiesenen Anti-EA-D-IgM- Antikörpers über den Bereich der untersuchten Polypeptidkonzentrationen nicht wesentlich schwankte. Somit kann eine Polypeptidlösung mit einer Konzentration von nur 0,1 ug/ml Polypeptid verwendet werden, um ein Polypeptid dieser Erfindung an den Innenwänden einer Mikrotiterplattenvertiefung anzubringen, um einen festen Träger zu bilden.

Beispiel 7: Verdünnung der Probe

Die Auswirkung der Verdünnung der Körperflüssigkeitsprobe, die in dem ELISA von Beispiel 5 getestet werden sollte, wurde ebenfalls untersucht. Seren von normalen Personen (VCA- und VCA+) und von Patienten mit IM, NPC oder SS wurden 1 : 5, 1 : 20, 1 : 50 und 1 : 100 in der vorstehend erörterten Blockierungslösung verdünnt und wurden wie in Beispiel 5 beschrieben getestet.
Die Ergebnisse dieser Studie sind in Fig. 5B gezeigt. Diese Ergebnisse zeigen an, daß die Abnahme der Empfindlichkeit, die mit zunehmender Verdünnung der Probe einhergeht, bei einer Probenverdünnung von ungefähr 1 : 20 abzuflachen beginnt.

Beispiel 8: Nachweis der Anti-EA-D-Immunglobulinklasse

Die Fähigkeit der Nachweisverfahren der vorliegenden Erfindung, die in einer Probe vorhandenen Anti-EA-D- Immunglobulinklassen zu differenzieren, wurde untersucht. Dies wurde durchgeführt, indem jedes der in Tabelle 1 gezeigten Polypeptide als an der Festphase angebrachtes Antigen in dem ELISA von Beispiel 5 verwendet wurde.
Die Ergebnisse der Untersuchung der Polypeptide in Tabelle 1 bezüglich ihrer Fähigkeit, mit IgG-, IgM- und IgA-Antikörpern in Serumproben eine Immunreaktion einzugehen, sind in Tabelle 2 unten gezeigt. Tabelle 2 Bindung von ING-, IgM- und IgA-Antikörpern an verschiedene Polypeptide PEPTID Probe
¹ Die gezeigten Werte sind in Einheiten der optischen Dichte bezogen auf BBS bei einer Lichtwellenlänge von 490 Nanometern angegeben.
² Die Polypeptide K5, K6, K7, K8 und K9 haben die in Tabelle 1 gezeigten Aminosäurerestsequenzen.
³ Serum von einer klinisch normalen Person ohne vorhergehenden Kontakt mit EBV (VCA-).
&sup4; Serum von einem Patienten mit einer klinisch akuten EBV- Infektion (IM).
&sup5; Serum von einer klinisch normalen Person, die zuvor mit EBV in Kontakt gekommen war (VCA+).
&sup6; Serum von einer klinisch normalen Person, die zuvor mit EBV in Kontakt gekommen war (VCA+), aber einen erhöhten Anti- EA-IgM-Spiegel hatte (falsch positiv).
Die vorstehenden Ergebnisse zeigen an, daß das Polypeptid K7, das (z. B. durch Adsorption) an einer festen Matrix als fester Träger angebracht ist, die Fähigkeit hat, mit IgG-, IgM- und IgA-Antikörpern im Serum eines Patienten (Nr. 2241) mit einer akuten EBV-Infektion eine Immunreaktion einzugehen. Darüber hinaus gingen Seren von zwei klinisch normalen Personen, die Antikörper gegen das EBV-Capsid- Antigen enthielten (VCA&spplus;), keine Immunreaktion mit K7 ein, und ebenso wenig war dies der Fall bei einem Serum von einer klinisch normalen Person ohne vorherigen nachweisbaren Kontakt mit EBV (VCA&supmin;).
Die vorstehende Beschreibung einschließlich der spezifischen Ausführungsformen und Beispiele, soll die vorliegende Erfindung erläutern und nicht beschränken. Zahlreiche andere Abwandlungen und Modifikationen können ausgeführt werden, ohne vom Umfang der vorliegenden Erfindung, wie er in den Ansprüchen definiert ist, abzuweichen.

Claims

1. Synthetisches Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz von 13 bis 40 Aminosäureresten, die die Sequenz -PARPETPSPAIPS- beinhaltet, sowie der Fähigkeit, gegen das diffuse frühe Antigen (EA-D) des Epstein-Barr-Virus erzeugte Antikörper immunologisch zu binden, als wesentliche Merkmale.

2. Synthetische Polypeptid nach Anspruch 1 mit 13 bis 25 Aminosäureresten.

3. Synthetisches Polypeptid nach Anspruch 1, wobei die Aminosäurerestsequenz des Polypeptids der von links nach rechts und vom aminoterminalen zum carboxyterminalen Ende hin gelesenen, durch die Formel

H-PARPETPSPAIPS-OH

dargestellten Sequenz entspricht.

4. Synthetisches Polypeptidoligomer mit bis ungefähr 40 Aminosäureresten, das mehrere aneinander gefügte synthetische repetitive Polypeptideinheiten enthält, die im wesentlichen aus einem Polypeptid nach Anspruch 1 bestehen, wobei dieses Oligomer dazu fähig ist, EA-D-induzierte Antikörper zu binden.

5. Synthetisches Polypeptidpolymer, das mehrere synthetische repetitive Polypeptideinheiten enthält, die nicht durch Peptidbindungen miteinander verbunden sind und mehr als ungefähr 100 Aminosäurereste enthalten, wobei diese Einheiten eine Aminosäuresequenz von 13 bis 40 Aminosäureresten, die die Sequenz -PARPETPSPAIPS- beinhaltet, wobei dieses Polymer bei einem pH-Wert von ungefähr 5 bis ungefähr 9 in Wasser dispergierbar ist, sowie die Fähigkeit, mit EA-D-induzierten Antikörpern eine Immunreaktion einzugehen, als wesentliche Merkmale aufweisen.

6. In-vitro-Testverfahren zum Nachweis von Anti-EA-D-Antikörpern in einer Körperflüssigkeitsprobe, das folgende Schritte umfaßt:

(a) Bereitstellung einer Körperflüssigkeitsprobe für den Nachweis;

(b) Bereitstellung eines synthetischen Polypeptids mit einer Aminosäuresequenz von 13 bis 40 Aminosäureresten, die die Sequenz -PARPETPSPAIPS- beinhaltet, sowie der Fähigkeit, gegen EA-D erzeugte Antikörper immunologisch zu binden, als wesentliche Merkmale;

(c) Vermischen der Körperflüssigkeitsprobe mit dem Polypeptid, unter Bildung einer ersten Immunreaktionsmischung;

(d) Belassen der Mischung unter biologischen Testbedingungen, und zwar über einen vorgegebenen Zeitraum, der so bemessen ist, daß in der Probe gegebenenfalls vorhandene EA-D-Antikörper unter Bildung eines ersten Immunreaktionsteilnehmers immunologisch an das Polypeptid binden; und

(e) Nachweis eines gegebenenfalls in dieser Mischung gebildeten ersten Immunreaktionsteilnehmers.

7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei es sich bei der Körperflüssigkeitsprobe entweder um Serum oder um Plasma handelt.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Polypeptid an einer festen Matrix als fester Träger angebracht ist und der erste Immunreaktionsteilnehmer für den Nachweis nach Schritt (e) folgendermaßen vorbereitet wird;

(a) Zumischen eines biologisch aktiven, markierten Rezeptors, der an das im ersten Immunreaktionsteilnehmer vorhandene Humanimmunglobulin unter Bildung eines markierten, zweiten Immunreaktionsteilnehmers bindet, wobei der markierte Rezeptor dazu fähig ist, die Anwesenheit des markierten Rezeptors im zweiten Immunreaktionsteilnehmer anzuzeigen; und

(b) Belassen der so entstandenen Mischung unter biologischen Testbedingungen, und zwar über einen vorgegebenen Zeitraum, der so bemessen ist, daß der markierte Rezeptor mit gegebenenfalls als erster Immunreaktionsteilnehmer vorhandenen Anti-EA-D-Antikörpern einen zweiten Immunreaktionsteilnehmer bildet.

9. Diagnosesystem zum Nachweis von Anti-EA-D-Antikörpern in einer Körperflüssigkeitsprobe, das aus den folgenden, getrennt verpackten Bestandteilen besteht:

(a) ein synthetisches Polypeptid mit einer Aminosäurensequenz von 13 bis 40 Aminosäureresten, die die Sequenz

-PARPETPSPAIPS-

beinhaltet, als wesentliches Merkmal, wobei das Polypeptid fähig ist, durch EA-D-induzierte Antikörper immunologisch gebunden zu werden, und

(b) ein markiertes, spezifisches Bindungsmittel, um die Immunreaktion von Anti-EA-D-Antikörpern mit dem Polypeptid anzuzeigen.

10. Diagnosesystem nach Anspruch 9, wobei das Polypeptid an einer festen Matrix als fester Träger angebracht ist und es sich bei dem markierten spezifischen Bindungsmittel um einen Enzym-markierten Rezeptor handelt.

11. Diagnosesystem nach Anspruch 10, wobei der markierte Rezeptor spezifisch für die Klasse der Humanimmunoglobuline ist.

12. Inokulum bestehend aus einer wirksamen Menge eines synthetischen Polypeptids mit einer Aminosäurensequenz von 13 bis 40 Aminosäureresten, die die Sequenz

-PARPETPSPAIPS-

beinhaltet, als wesentliches Merkmal, wobei das Polypeptid an einen Träger gebunden ist und in einem physiologisch unbedenklichen Verdünnungsmittel dispergiert ist.

13. Rezeptor gegen ein synthetisches Polypeptid erzeugt, wobei das Polypeptid eine Aminosäuresequenz von 13 bis 40 Aminosäureresten, die die Sequenz

-PARPETPSPAIPS-

beinhaltet, als wesentliches Merkmal, wobei der Rezeptor zu einer Immunreaktion mit dem EA-D-Protein fähig ist.

14. Verfahren zum Nachweis von EA-D in einer Körperflüssigkeitsprobe, die im wesentlichen aus lysierten peripheren Blutlymphozyten besteht, wobei das Nachweisverfahren die folgenden Schritte umfaßt:

(a) Vermischen der Probe mit Rezeptoren unter Bildung einer Immunreaktionsmischung, wobei die Rezeptoren gegen ein synthetisches Polypeptid mit einer Aminosäurensequenz von 13 bis 40 Aminosäureresten, die die Sequenz

-PARPETPSPAIPS-

beinhaltet, als wesentliches Merkmal erzeugt wurden;

(b) Belassen der Mischung unter biologischen Testbedingungen, und zwar über einen vorgegebenen Zeitraum, der so bemessen ist, daß gegebenenfalls in der Probe vorhandenes EA-D mit den Rezeptoren unter Bildung eines Immunreaktionsteilnehmers eine Immunreaktion eingeht; und

(c) Nachweis eines gegebenenfalls in dieser Mischung gebildeten Immunreaktionsteilnehmers.

15. Diagnosesystem zum Nachweis von EA-D in einer Körperflüssigkeitsprobe mit folgenden, getrennt verpackten Bestandteilen:

(a) Rezeptoren gegen ein synthetisches Polypeptid mit einer Aminosäuresequenz von 13 bis 40 Aminosäureresten erzeugt, die die Sequenz

-PARPETPSPAIPS-

als wesentliches Merkmal beinhaltet, wobei die Rezeptoren zu einer Immunreaktion mit dem EA-D-Protein fähig sind; und

(b) ein markiertes, spezifisches Bindungsmittel, das die Immunreaktion der Rezeptoren mit dem EA-D-Protein anzeigt.

16. Verfahren für den quantitativen Nachweis von IgA-, IgM- oder IgG-Antikörpern gegen EA-D in einer Probe menschlicher Körperflüssigkeit, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfaßt:

(a) Bereitstellung einer Serum- oder Plasmaprobe für den Nachweis;

(b) Bereitstellung eines festen Trägers, der aus einer festen Matrix besteht, an der ein synthetisches Polypeptid angebracht ist, das über eine Aminosäurerestsequenz verfügt, die von links nach rechts und vom aminoterminalen zum carboxyterminalen Ende hin gelesen der Formel

H-PARPETPSPAIPS-OH

entspricht;

(c) Vermischen der Körperflüssigkeitsprobe mit dem festen Träger unter Bildung einer ersten Immunreaktionsmischung;

(d) Belassen der Immunreaktionsmischung unter biologischen Testbedingungen, und zwar über einen vorgegebenen Zeitraum, der so bemessen ist, daß gegebenenfalls in der Probe vorhandene Anti-EA-D-Antikörper mit dem Polypeptid des festen Trägers unter Bildung eines ersten Immunreaktionsteilnehmers eine immunologische Bindung eingehen;

(e) anschließendes Trennen des festen Trägers von der Körperflüssigkeitsprobe;

(f) Mischen des abgetrennten festen Trägers mit biologisch aktiven, markierten Rezeptoren unter Bildung einer zweiten Immunreaktionsmischung, wobei die markierten Rezeptoren spezifisch für die Immunglobulinklasse und zur Bindung an jegliches als erster Immunreaktionsteilnehmer vorhandenes menschliche Immunglobulin der Klasse IgA, IgM oder IgG fähig sind bzw. zum Anzeigen des Vorhandenseins dieser Immunglobuline fähig sind;

(g) Belassen der entstandenen zweiten Immunreaktionsmischung unter biologischen Testbedingungen, und zwar über einen vorgegebenen Zeitraum, der so bemessen ist, daß die markierten Rezeptoren mit gegebenenfalls als erster Immunreaktionsteilnehmer anwesenden IgA-, IgM oder IgG-Antikörpern gegen EA-D einen zweiten Immunreaktionsteilnehmer bilden können;

(h) Abtrennen des festen Trägers von nicht als zweiter Immunreaktionsteilnehmer gebundenen, markierten Rezeptoren, und

(i) quantitativer Nachweis der als zweiter Immunreaktionsteilnehmer vorhandenen markierten Rezeptoren und daher der in der Körperflüssigkeitsprobe vorhandenen IgA-, IgM- oder IgG-Antikörpern.