JPS63225398A - エプスタイン・バーウイルス初期抗原（拡散）に関連する合成ポリペプチドおよび抗体 - Google Patents
エプスタイン・バーウイルス初期抗原（拡散）に関連する合成ポリペプチドおよび抗体Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
技術分野
本発明はエプスタイン・バーウィルスおよびその初期抗
原（拡散）の関連する疾患の治療および診断に有用な免
疫原、抗原、接種材料、抗体、方法および系に関する。 発明の背景 エプスタイン・バーウィルス（ＥＢＶ）は世界中で個体
の８０〜１００％に感染している非常に普通の環境因子
である。それはヒトにおける感染性単核症（ＩＭ）の原
因因子であり、ＥＢＶはまたバーキットリンパ腫（ＢＬ
）、鼻咽頭癌（ＮＰＣ）、および免疫抑制患者に生ずる
８９７８球腫瘍の病原論に関係づけられた。情況証拠は
またヒト自己免疫疾患例えば慢性関節リウマチふよびシ
エーグレン症候群中のこのウィルスの可能な役割を示し
た。 初期または一次ＥＢＶ感染は急性または潜在性であるこ
とができる。急性ウィルス感染は特異核抗原（ＥＢＮＡ
−ＩおよびＥＢＮＡ−ＩＩと称される）、「初期抗原Ｊ
（ＥＡ）複合体、ウィルスカプシド抗原（ＶＣＡ）
および他のウィルス関連分子の生成を生ずる。これは次
に長期間の間ＥＢＶ感染が循環血液、リンパ節、肺臓お
よび唾液腺中に存在するＢリンパ球中に潜伏する。 潜伏感染はウィルスが未発現または部分発現状態で細胞
内に存在するものである。潜伏性ウィルス感染は再活性
化することができる。生体内潜伏を制御する宿主因子は
十分は理解されていないけれども、１つまたはそれ以上
の免疫機構の不全が重要な因子であることを示唆する若
干の証拠がある。 ＥＢＶによる一次感染に続く血清学的および細胞仲介免
疫応答はよく示され、感染の過程中に発現されるウィル
スの免疫原決定基に対する宿主の応答を表わす、自生ウ
ィルスタンパク質の関係において、免疫原決定基は全自
生タンパク質が免疫原として使用されるときの抗体応答
を誘出するタンパク質の部分である。これらの免疫原決
定基は分子上の若干の部位に制限されると思われる。 一方、抗体が結合できるタンパク賞分子の領域は抗原決
定基として示される。組織中のウィルス抗原決定基の検
出並びにウィルス免疫原決定基に対する患者の応答のプ
ロフィルはＥＢＶ関連疾患の診断に非常に有用になって
いる。 ＥＡ複合体は、この複合体に対する抗体がしばしばＥＢ
Ｖ関連疾患を有する患者中に、潜在的に感染したがしか
し発病しない対照集団とは対照的に高い力価で存在する
ので重要である。すなわち、ニブスティン・バーウィル
ス（Ｅ Ｂ Ｖ）に急性感染したヒトは拡散初期抗原（
ＥＡ−Ｄ）に対する抗体を生ずる。次にウィルスが潜伏
期に入ると抗ＥＡ−Ｄ抗体が消滅し、ウィルスが再活性
化されるまで再び表われない。 ＥＡ錯体は現在ＥＢＶ感染細胞中の免疫螢光染色の分布
に基いて拡散（Ｄ）および制限（Ｒ）を示す２つの異な
るタンパク質抗原からなると知られている。ＥＡ−Ｄに
対する抗体はアセトン固定およびメタノール固定細胞の
両方において核および細胞質の拡散染色を生ずる。対照
的にＥＡ−Ｒ染色はアセトン固定細胞中の細胞質に制限
され、メタノール固体細胞中には存在しない。 １ＭおよびＮＰＣを存する患者の血清の抗ＥＡ活性は主
にＥＡ−Ｄを指向するが、ＢＬを有する患者の血清中の
免疫反応性は主にＥＡ−Ｒを指向する。さらに、ＥＡｔ
ｉ体に対する抗体は、抗体力価が疾患過程で変化する傾
向があるので、ＥＢＶ関連悪性を有する患者に重要であ
る。 従って、ＥＡ−ＤおよびＥＡ−Ｄ抗体の両方の存在につ
いての検定は若干の共通の臨床情況に重要である。 抗ＥＡ−Ｄ抗体はこれまでＥＢＶ感染細胞から得たＥＡ
−Ｄ抗原を用いて検定された。ヘレン（■ｅｎｌｅ）ほ
か、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ） 、１６９．１８８
〜１９０ （１９７０）の免疫螢光法は抗原精製のない
全細胞調製物を用いる。しかし、そのような粗調製物の
・使用は血清が哺乳動物の核および細胞質抗原に対する
抗体もまた含む患者に対し偽陽性結果を生ずる。 より最近にはルカ（Ｌｕｋａ）ほか、ジャーナル・オブ
・イムノロジカル・メソーズ（Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ。 Ｍｅｔｈ、）、６７．１４５〜１５６ （１９８４）
がイムノアフィニティークロマトグラフィーにより
ＥＢＶ惑染感染から精製したＥＡ−Ｄ標的抗原を用いる
抗ＥＡ−Ｄ抗体に対する酵素結合抗体免疫吸着検定（Ｅ
ＬＩＳＡ）の開発を報告した。ルカ（Ｌｕｋａ）ほかの
方法は全細胞調製物の使用に関連する偽陽性の問題を減
少するけれども、それはなお感染物質の生成および取扱
いを必要とする。 従って、疾患中のＥＢＶ連座の診断並びに伝染性単核症
（ＩＭ）のような疾患の段階の診断を可能になし、感染
細胞培養の取扱いを制限し、回避するために体試料中の
ＥＡ−Ｄおよび抗ＥＡ−Ｄ抗体の存在について検定する
改良された試薬および方法の開発が望まれる。 最近の研究はタンパク質の主アミノ酸残基配列の短線状
セグメントに相当する化学合成ポリペプチドを用いて自
生タンパク質と免疫反応する抗体を誘発できることが示
された、ラーナー（Ｌｅｒｎｅｒ）ほか、ネーチャー
（Ｎａｔｕｒｅ）、２９９．５９２（１９８２）および
ストクリフ（Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ）ほか、サイエンス（
Ｓｃｉｅｎｃｅ） 、２１９．２６０ （１９８３）。 さらに、若干の研究は、合成ポリペプチドが自生タンパ
ク質により誘発された抗体と免疫反応できることを示し
た、ロウズ（Ｒｈｏｄｅｓ）ほか、ジャーナル・オプ・
イムノロジー（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、）、１３４．２１
１ （１９８５）、従って、若干の合成ポリペプチド
は自生タンパク質の免疫原および抗原の決定基を免疫学
的に模擬できる。 しかしよく知られているように、合成ペプチド技術の適
用はなお若干の欠点に悩まされる０例えば自生タンパク
賞上の抗原決定基を模擬できるペプチドの確認は、中で
もタンパク質のアミノ酸残基配列を知ることを必要とす
る。アミノ酸残基配列がタンパク質をコードする遺伝子
の核酸配列から予想できるが、そのような予想はミ遺伝
子の正しい読み枠が知られれば行なうことができるにす
ぎない。 ＥＢＶゲノムの核酸配列はベール（Ｂａｅｒ）ほか、ネ
ーチ（−−（Ｎａｔｕｒｅ）、３１０．２０７ （１９
Ｂ４）の論文の公表以来知られてきた。しかし、ＥＡ−
Ｄタンパク質遺伝子もその読み枠もこれまでウィルスゲ
ノムで確認されなかった。さらに、タンパク質のアミノ
酸残基配列が知られたとしても、免疫原および抗原の決
定基を構成するタンパク質中の部位を確認する方法は事
実上経験的であり、予測できる結果を生じない、これに
は少くとも２つの理由がある。第１に、タンパク質の三
次元構造が知られなければタンパク質の線状セグメント
を宿主の免疫系に利用できる信顧できる測定法がない、
第２に、三次元構造が知られ、または知られなくても、
短線状ポリペプチドがしばしば適当な免疫原決定基およ
び抗原決定基の構成に必要な二次および三次配座構造を
模擬する能力を有しないと思われる、クイナー（Ｔａｉ
ｎｅｒ）ほか、ネーチャー（Ｎａ ｔｕｒｅ）、３１２
．１２７ （１９８４）。 発明の概要 本発明の１観点はＥＢＶ ＥＡ−Ｄタンパク質のアミ
ノ末端からおよそ位置３５０〜およそ位置３６２のアミ
ノ酸残基配列に相当するアミノ酸残基配列を有する約６
〜約４０個のアミノ酸残基、より好ましくは約１０〜約
２５個の残基、から実質的になる合成ポリペプチドを意
図する。核合成ポリペプチドはＥＡ−Ｄにより誘発され
た抗体を免疫結合する能力を有する。 殊に好ましいポリペプチドは、左から右へ、アミノ末端
からカルボキシ末端へ、式、 Ｈ−ＰＡＲＰＢＴＳＰＡＩＰＡ−ＯＨ により表わされる配列を有する。 本発明の他の観点は約１２〜約４０個のアミノ酸残基の
、少くとも２つの単位が前記合成ポリペプチドである複
数の結合した合成ポリペプチド反復単位を含む合成ポリ
ペプチドオリゴマーを意図する。 本発明のなお他の観点は、ポリペプチド結合以外により
互いに結合された複数の合成ポリペプチド反復単位を含
み、約１００個以上のアミノ酸残基を含む合成ポリペプ
チドポリマーを意図する。 反復単位は前記合成ポリペプチドである。 本発明のなお他の観点は、検定する体液試料および前記
合成ポリペプチドを準備する段階を含む体液試料をＥＡ
−Ｄに対する抗体の存在について検定する方法を意図す
る０体液試料およびポリペプチドを混合して免疫反応混
合物を形成する。混合物を生物検定条件下に、試料中に
存在する抗ＥＡ−Ｄ抗体がポリペプチドを免疫結合して
免疫反応体を形成する十分な予定時間維持する０次いで
混合物中に形成された免疫反応体の存在を測定する。 本発明の他の観点は、検定する体試料および前記合成ポ
リペプチドにより誘発された抗体結合部位を含む生物活
性受容体分子を準備する段階を含む体試料をＥＡ−Ｄの
存在について検定する方法を意図する０体試料を受容体
と混合して免疫反応混合物を形成する。その混合物を生
物検定条件下に、試料中に存在するＥＡＤが受容体によ
り免疫結合されて免疫反応体を形成する十分な予定時間
維持する０次いで混合物中に形成された免疫反応体の存
在を測定する。 本発明のなお他の観点は、体液試料中の抗ＥＡ−Ｄ抗体
の存在について検定する診断系を意図する。系は、好ま
しくは個々の容器中に、前記合成ポリペプチドおよびポ
リペプチドと抗ＥＡ−Ｄ抗体との免疫反応をシグナルす
る標識された特異結合剤を含む。 さらに、担体に結合させ、生理学的に許容できる希釈剤
中に分散された前記合成ポリペプチドにより構成された
接種材料が意図される。 前記合成ポリペプチドに対して生成され、ＥＡ−Ｄタン
パク質と免疫反応できる受容体もまた意図される。 他の観点において、本発明は体試料、好ましくは溶解末
梢血リンパ球、中のＥＡ−Ｄの存在について検定する方
法を意図する０体試料を前記受容体と混合して免疫反応
混合物を形成する。混合物を生物検定条件下に、試料中
に存在するＥＡ−Ｄが受容体と免疫反応して免疫反応体
を形成する十分な予定時間維持する。次いで混合物中に
形成された免疫反応体を測定する。 本発明の他の観点は、体試料中のＥＡ−Ｄの存在につい
て検定する診断系である。系は、好ましくは個々のパッ
ケージ中に、前記受容体および受容体とＥＡ−Ｄタンパ
ク質との免疫反応をシグナルする標識された特異結合剤
を含む。 本発明により提供される利点の１つはＥＢＶＥＡ−Ｄに
関連する抗原および受容体を感染性物質を扱うことなく
生成させる能力である。 本発明はまた、天然に存在する核および細胞質抗原によ
り生ずる偽陽性結果を実質的に含まない高免疫特異性を
有する抗原および受容体を提供するので有利である。 本発明の他の利点は再活性化した潜伏ＥＢＶ感染の早期
検出を与えることである。 本発明のなお他の利点は次の説明から当業者に明らかで
あろう。
原（拡散）の関連する疾患の治療および診断に有用な免
疫原、抗原、接種材料、抗体、方法および系に関する。 発明の背景 エプスタイン・バーウィルス（ＥＢＶ）は世界中で個体
の８０〜１００％に感染している非常に普通の環境因子
である。それはヒトにおける感染性単核症（ＩＭ）の原
因因子であり、ＥＢＶはまたバーキットリンパ腫（ＢＬ
）、鼻咽頭癌（ＮＰＣ）、および免疫抑制患者に生ずる
８９７８球腫瘍の病原論に関係づけられた。情況証拠は
またヒト自己免疫疾患例えば慢性関節リウマチふよびシ
エーグレン症候群中のこのウィルスの可能な役割を示し
た。 初期または一次ＥＢＶ感染は急性または潜在性であるこ
とができる。急性ウィルス感染は特異核抗原（ＥＢＮＡ
−ＩおよびＥＢＮＡ−ＩＩと称される）、「初期抗原Ｊ
（ＥＡ）複合体、ウィルスカプシド抗原（ＶＣＡ）
および他のウィルス関連分子の生成を生ずる。これは次
に長期間の間ＥＢＶ感染が循環血液、リンパ節、肺臓お
よび唾液腺中に存在するＢリンパ球中に潜伏する。 潜伏感染はウィルスが未発現または部分発現状態で細胞
内に存在するものである。潜伏性ウィルス感染は再活性
化することができる。生体内潜伏を制御する宿主因子は
十分は理解されていないけれども、１つまたはそれ以上
の免疫機構の不全が重要な因子であることを示唆する若
干の証拠がある。 ＥＢＶによる一次感染に続く血清学的および細胞仲介免
疫応答はよく示され、感染の過程中に発現されるウィル
スの免疫原決定基に対する宿主の応答を表わす、自生ウ
ィルスタンパク質の関係において、免疫原決定基は全自
生タンパク質が免疫原として使用されるときの抗体応答
を誘出するタンパク質の部分である。これらの免疫原決
定基は分子上の若干の部位に制限されると思われる。 一方、抗体が結合できるタンパク賞分子の領域は抗原決
定基として示される。組織中のウィルス抗原決定基の検
出並びにウィルス免疫原決定基に対する患者の応答のプ
ロフィルはＥＢＶ関連疾患の診断に非常に有用になって
いる。 ＥＡ複合体は、この複合体に対する抗体がしばしばＥＢ
Ｖ関連疾患を有する患者中に、潜在的に感染したがしか
し発病しない対照集団とは対照的に高い力価で存在する
ので重要である。すなわち、ニブスティン・バーウィル
ス（Ｅ Ｂ Ｖ）に急性感染したヒトは拡散初期抗原（
ＥＡ−Ｄ）に対する抗体を生ずる。次にウィルスが潜伏
期に入ると抗ＥＡ−Ｄ抗体が消滅し、ウィルスが再活性
化されるまで再び表われない。 ＥＡ錯体は現在ＥＢＶ感染細胞中の免疫螢光染色の分布
に基いて拡散（Ｄ）および制限（Ｒ）を示す２つの異な
るタンパク質抗原からなると知られている。ＥＡ−Ｄに
対する抗体はアセトン固定およびメタノール固定細胞の
両方において核および細胞質の拡散染色を生ずる。対照
的にＥＡ−Ｒ染色はアセトン固定細胞中の細胞質に制限
され、メタノール固体細胞中には存在しない。 １ＭおよびＮＰＣを存する患者の血清の抗ＥＡ活性は主
にＥＡ−Ｄを指向するが、ＢＬを有する患者の血清中の
免疫反応性は主にＥＡ−Ｒを指向する。さらに、ＥＡｔ
ｉ体に対する抗体は、抗体力価が疾患過程で変化する傾
向があるので、ＥＢＶ関連悪性を有する患者に重要であ
る。 従って、ＥＡ−ＤおよびＥＡ−Ｄ抗体の両方の存在につ
いての検定は若干の共通の臨床情況に重要である。 抗ＥＡ−Ｄ抗体はこれまでＥＢＶ感染細胞から得たＥＡ
−Ｄ抗原を用いて検定された。ヘレン（■ｅｎｌｅ）ほ
か、サイエンス（Ｓｃｉｅｎｃｅ） 、１６９．１８８
〜１９０ （１９７０）の免疫螢光法は抗原精製のない
全細胞調製物を用いる。しかし、そのような粗調製物の
・使用は血清が哺乳動物の核および細胞質抗原に対する
抗体もまた含む患者に対し偽陽性結果を生ずる。 より最近にはルカ（Ｌｕｋａ）ほか、ジャーナル・オブ
・イムノロジカル・メソーズ（Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ。 Ｍｅｔｈ、）、６７．１４５〜１５６ （１９８４）
がイムノアフィニティークロマトグラフィーにより
ＥＢＶ惑染感染から精製したＥＡ−Ｄ標的抗原を用いる
抗ＥＡ−Ｄ抗体に対する酵素結合抗体免疫吸着検定（Ｅ
ＬＩＳＡ）の開発を報告した。ルカ（Ｌｕｋａ）ほかの
方法は全細胞調製物の使用に関連する偽陽性の問題を減
少するけれども、それはなお感染物質の生成および取扱
いを必要とする。 従って、疾患中のＥＢＶ連座の診断並びに伝染性単核症
（ＩＭ）のような疾患の段階の診断を可能になし、感染
細胞培養の取扱いを制限し、回避するために体試料中の
ＥＡ−Ｄおよび抗ＥＡ−Ｄ抗体の存在について検定する
改良された試薬および方法の開発が望まれる。 最近の研究はタンパク質の主アミノ酸残基配列の短線状
セグメントに相当する化学合成ポリペプチドを用いて自
生タンパク質と免疫反応する抗体を誘発できることが示
された、ラーナー（Ｌｅｒｎｅｒ）ほか、ネーチャー
（Ｎａｔｕｒｅ）、２９９．５９２（１９８２）および
ストクリフ（Ｓｕｔｃｌｉｆｆｅ）ほか、サイエンス（
Ｓｃｉｅｎｃｅ） 、２１９．２６０ （１９８３）。 さらに、若干の研究は、合成ポリペプチドが自生タンパ
ク質により誘発された抗体と免疫反応できることを示し
た、ロウズ（Ｒｈｏｄｅｓ）ほか、ジャーナル・オプ・
イムノロジー（Ｊ、Ｉｍｍｕｎｏｌ、）、１３４．２１
１ （１９８５）、従って、若干の合成ポリペプチド
は自生タンパク質の免疫原および抗原の決定基を免疫学
的に模擬できる。 しかしよく知られているように、合成ペプチド技術の適
用はなお若干の欠点に悩まされる０例えば自生タンパク
賞上の抗原決定基を模擬できるペプチドの確認は、中で
もタンパク質のアミノ酸残基配列を知ることを必要とす
る。アミノ酸残基配列がタンパク質をコードする遺伝子
の核酸配列から予想できるが、そのような予想はミ遺伝
子の正しい読み枠が知られれば行なうことができるにす
ぎない。 ＥＢＶゲノムの核酸配列はベール（Ｂａｅｒ）ほか、ネ
ーチ（−−（Ｎａｔｕｒｅ）、３１０．２０７ （１９
Ｂ４）の論文の公表以来知られてきた。しかし、ＥＡ−
Ｄタンパク質遺伝子もその読み枠もこれまでウィルスゲ
ノムで確認されなかった。さらに、タンパク質のアミノ
酸残基配列が知られたとしても、免疫原および抗原の決
定基を構成するタンパク質中の部位を確認する方法は事
実上経験的であり、予測できる結果を生じない、これに
は少くとも２つの理由がある。第１に、タンパク質の三
次元構造が知られなければタンパク質の線状セグメント
を宿主の免疫系に利用できる信顧できる測定法がない、
第２に、三次元構造が知られ、または知られなくても、
短線状ポリペプチドがしばしば適当な免疫原決定基およ
び抗原決定基の構成に必要な二次および三次配座構造を
模擬する能力を有しないと思われる、クイナー（Ｔａｉ
ｎｅｒ）ほか、ネーチャー（Ｎａ ｔｕｒｅ）、３１２
．１２７ （１９８４）。 発明の概要 本発明の１観点はＥＢＶ ＥＡ−Ｄタンパク質のアミ
ノ末端からおよそ位置３５０〜およそ位置３６２のアミ
ノ酸残基配列に相当するアミノ酸残基配列を有する約６
〜約４０個のアミノ酸残基、より好ましくは約１０〜約
２５個の残基、から実質的になる合成ポリペプチドを意
図する。核合成ポリペプチドはＥＡ−Ｄにより誘発され
た抗体を免疫結合する能力を有する。 殊に好ましいポリペプチドは、左から右へ、アミノ末端
からカルボキシ末端へ、式、 Ｈ−ＰＡＲＰＢＴＳＰＡＩＰＡ−ＯＨ により表わされる配列を有する。 本発明の他の観点は約１２〜約４０個のアミノ酸残基の
、少くとも２つの単位が前記合成ポリペプチドである複
数の結合した合成ポリペプチド反復単位を含む合成ポリ
ペプチドオリゴマーを意図する。 本発明のなお他の観点は、ポリペプチド結合以外により
互いに結合された複数の合成ポリペプチド反復単位を含
み、約１００個以上のアミノ酸残基を含む合成ポリペプ
チドポリマーを意図する。 反復単位は前記合成ポリペプチドである。 本発明のなお他の観点は、検定する体液試料および前記
合成ポリペプチドを準備する段階を含む体液試料をＥＡ
−Ｄに対する抗体の存在について検定する方法を意図す
る０体液試料およびポリペプチドを混合して免疫反応混
合物を形成する。混合物を生物検定条件下に、試料中に
存在する抗ＥＡ−Ｄ抗体がポリペプチドを免疫結合して
免疫反応体を形成する十分な予定時間維持する０次いで
混合物中に形成された免疫反応体の存在を測定する。 本発明の他の観点は、検定する体試料および前記合成ポ
リペプチドにより誘発された抗体結合部位を含む生物活
性受容体分子を準備する段階を含む体試料をＥＡ−Ｄの
存在について検定する方法を意図する０体試料を受容体
と混合して免疫反応混合物を形成する。その混合物を生
物検定条件下に、試料中に存在するＥＡＤが受容体によ
り免疫結合されて免疫反応体を形成する十分な予定時間
維持する０次いで混合物中に形成された免疫反応体の存
在を測定する。 本発明のなお他の観点は、体液試料中の抗ＥＡ−Ｄ抗体
の存在について検定する診断系を意図する。系は、好ま
しくは個々の容器中に、前記合成ポリペプチドおよびポ
リペプチドと抗ＥＡ−Ｄ抗体との免疫反応をシグナルす
る標識された特異結合剤を含む。 さらに、担体に結合させ、生理学的に許容できる希釈剤
中に分散された前記合成ポリペプチドにより構成された
接種材料が意図される。 前記合成ポリペプチドに対して生成され、ＥＡ−Ｄタン
パク質と免疫反応できる受容体もまた意図される。 他の観点において、本発明は体試料、好ましくは溶解末
梢血リンパ球、中のＥＡ−Ｄの存在について検定する方
法を意図する０体試料を前記受容体と混合して免疫反応
混合物を形成する。混合物を生物検定条件下に、試料中
に存在するＥＡ−Ｄが受容体と免疫反応して免疫反応体
を形成する十分な予定時間維持する。次いで混合物中に
形成された免疫反応体を測定する。 本発明の他の観点は、体試料中のＥＡ−Ｄの存在につい
て検定する診断系である。系は、好ましくは個々のパッ
ケージ中に、前記受容体および受容体とＥＡ−Ｄタンパ
ク質との免疫反応をシグナルする標識された特異結合剤
を含む。 本発明により提供される利点の１つはＥＢＶＥＡ−Ｄに
関連する抗原および受容体を感染性物質を扱うことなく
生成させる能力である。 本発明はまた、天然に存在する核および細胞質抗原によ
り生ずる偽陽性結果を実質的に含まない高免疫特異性を
有する抗原および受容体を提供するので有利である。 本発明の他の利点は再活性化した潜伏ＥＢＶ感染の早期
検出を与えることである。 本発明のなお他の利点は次の説明から当業者に明らかで
あろう。
本発明の開示の一部を形成する図面中、第１図はＥＡ−
Ｄ遺伝子核酸配列〔ベール（Ｂａｅｒ）ほか、ネーチ＋
−（Ｎａｔｕｒｅ）、３１０，２０７（１９８４）に
より公表されたＥＢＶゲノム核酸残基７９８９９〜８１
１１０）から翻訳し、１文字アミノ酸残基路号を用いて
、左から右へ、アミノ末端からカルボキシ末端の方向に
ＥＡ−Ｄタンパク質の完全なアミノ酸残基配列を示す。 この研究に用いたポリペプチドのアミノ酸残基配列の位
置は配列の下の破線により示され、末端残基は末端残基
の直下の「＋」記号により示される。破線は表示に５、
Ｋ６、Ｋ７、Ｋ８およびに９により中断され、それらの
表示がそれらのポリペプチドの参照に利用される。 第２図には、実施例５に記載されるポリペプチドに７を
面相標的とした抗ＥＡ−Ｄ抗体ＢＬＩＳＡを用いた正常
個体（正常）および感染性単核症患者（急性ＩＭ）の血
清中の、それぞれ抗ＥＡ−ＤＩｇＭ、ＩｇＧおよびＩｇ
Ａ抗体に対する検定の結果を示す３つのグラフが含まれ
る。血清試料は急性ＩＭを有する４４患者（実バー）お
よびＥＢＶに対する先行暴露を有しない４０個体を含む
１９４健康正常個体（白抜きバー）から得た。検定中に
各試料により生じた４９０ナノメートル（ｎｍ）におけ
る光学濃度（ＯＤ４９０）は最も近い１７１０単位に丸
められ、各グラフの横軸であある。各バーは示した０Ｄ
４９０を生じた試料の数を表わす。 パネルＡのデータはポリペプチドに７により模擬された
Ｅ Ａ−Ｄエピトープに免疫結合する（免疫反応体形成
）ＩｇＭ抗体の頻度が正常個体中より急性ＩＭ患者中で
大きいことを示す。パネルＢおよびＣのデータはそれぞ
れＩｇＧおよびＩｇＡ抗体応答に対する同様の結果を示
す。 第３図は鼻咽頭癌（ＮＰＣ）、シエーグレン症候群（Ｓ
Ｓ）、サイトメガロウィルス（ｃＭＶ）感染を有する患
者および正常提供者の血清を検定するために実施例５の
ポリペプチドＫ ７ ＥＬＩＳＡを用いて得られた結果
を示すヒストグラムである。 ポリペプチドに７と免疫反応した各血清試料中の抗ＥＡ
−Ｄ抗体の量は０Ｄ４９０値として示され、ヒストグラ
ム上の点により示される。 第４図には実施例５に記載されるポリペプチドに７を固
相標的とした抗ＥＡ−Ｄ抗体ＥＬ Ｉ ＳＡを用いて抗
ＥＡ−Ｄ抗体について急性ＩＭを有する４患者の一連の
血清試料を検定した結果を示す２つのグラフパネルが含
まれる。各患者の血清のデータは異なる記号により表わ
され、同一記号は各グラフパネル中の同一患者に使用さ
れる。パネルＡのデータは抗ＥＡ−ＤＩｇＭ抗体を、症
候発症の１週後のＩＭ患者中に検出できることを示す。 パネルＢのデータはロウズ（Ｒｈｏｄｅｓ）ほか、ジャ
ーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ、
） 、１３４．２１１ （１９８５）に記載された抗
ＥＢＮＡ−ＩＥＬ Ｉ ＳＡを用いた血清試料中の抗Ｅ
ＢＮＡ−１抗体の増加の検出による同一患者中のｒＭ診
断の確認の例示である。 第５図には固相標識としてに７を用いた抗ＥＡ−Ｄ
ＩｇＭ抗体ＥＬＩＳＡで得られた結果に対する血清希釈
およびポリペプチド濃度の影響を示す２つのグラフパネ
ルが含まれる。 パネルＡのデータはＩＭ患者（ＩＭ）並びに血清がＥＢ
Ｖカプシドタンパク質抗原に対する抗体を含まなかった
正常個体（ＶＣＡＩおよび血清がこれらの抗原に対する
抗体を有した患者（ＶＣＡＩのそれぞれの血清試料料中
の抗ＥＡ−Ｄ ＩｇＭ抗体を検定する抗ＥＡ−Ｄ抗体
ＥＬ■ＳＡの能力に対するミクロタイタープレートウェ
ルに付着したに７ポリベブチドの量を変える影響を示す
。ミクロタイタープレートウェルは実施例５に記載する
ようにポリペプチドに７でコートしたが、ウェル壁に対
するに７の付着に用いたポリペプチドに７含有溶液の濃
度はミクログラム毎ミリリットル（μｇ／…ｌ）で示し
たように変動させた。試験した血清はすべて用いる前に
１：２０に希釈した。 パネルＢのデータは合成ポリペプチドに７と免疫反応す
るヒトＩｇＭ抗体の検出に対する血清希釈の影響を示す
、ミクロタイタープレートウェル壁は実施例５に記載さ
れるように１０μｇ／ｍβ溶液を用いてに７でコートし
た。ＩＭ、ＮＰＣおよびＳＳを有する患者、並びにＶＣ
Ａ−およびＶＣＡ”正常固体の血清を次に抗Ｅ Ａ −
Ｄ ＥＬＩＳＡで、示した希釈で検定した。 発明の詳細な説明 Ａ、定義 「抗体」という語は抗原と特異的に結合できる免疫グロ
ブリンと称される１群のグリコジル化タンパク質の一員
である分子を示す。 「抗体結合部位」は抗原を特異的に結合する重鎮および
軽鎖可変領域からなる抗体分子の構造部分である。 「抗原」という語は歴史的に抗体により結合されるエン
テイテイーを示すため、また抗体の生成を誘発するエン
テイテイーを示すために用いられた。より最近の用法は
抗原の意味を抗体により結合されるエンテイテイーに制
限し、「免疫原」という語が抗体生成を誘発するエンテ
イテイーに対して使用される。ここに論議するエンテイ
テイーは免疫原および抗原の両方である場合に一般に抗
原と称される。 「抗原決定基」は抗体結合部位により免疫結合される抗
原の真の構造部分を示す。その語はまた「エピトープ」
と同義に使用される。 「抗原関連変異体」という語はここに、少くとも１つの
抗原決定基の一部を共有し、従って免疫的に交差反応性
である全体のアミノ酸残基配列の異なるポリペプチドを
示すために使用される。すなわち、抗原関連変異体のポ
リペプチド配列が異なるが、しかし各変異体に対して生
成された抗体は他と免疫反応する。 「生物活性」という語は、少くとも受容体の適当なりガ
ントを少くとも特異的に結合する能力を示すが、しかし
他の一般またはエフェクター能力もまた存在することが
できる。 用いた「複合体」という語は、特異的結合因子が標的リ
ガンドに結合したときに形成される生成物を示す。典型
的な複合体は免疫反応体、抗体に結合したプロティンＡ
など、である。 用いた「保存的置換」という語は、１アミノ酸残基が他
の生物学的に類似の残基により置換されたことを示す。 保存的置換基の例には１つの疎水性残基例えばイソロイ
シン、バリン、ロイシンまたはメチオニンを他に代える
置換、あるいは１つの極性残基を他に代える、例えばア
ルギニンとリシンとの間、グルタミン酸とアスパラギン
酸との間、またはグルタミンとアスパラギンとの間など
の置換、が含まれる。「保存的置換」という語にはまた
、ポリペプチドに対して生じた抗体もまた非置換アミノ
酸を有する相当するポリペプチドと免疫反応すれば非置
換親アミノ酸の代りに置換アミノ酸を用いることが含ま
れる。 ペプチド配列に関して用いた種々の文法形態における「
相当する」という語は、アミノ末端およびカルボキシ末
端のいずれかまたは両方で３個までのアミノ酸残基を加
えまたは減じた、ボリペブ、チド配列に沿って特定アミ
ノ酸残基中に保存的置換のみを含むペプチドを意味する
。 ｒＥＬＩｓＡＪは固相に結合した抗体または抗原並びに
酵素−抗原または酵素−抗体結合体を用いて試料中に存
在する抗原または抗体の量を検定し定量する酵素結合抗
体免疫吸着検定を示す。 ＥＬＩＳＡ法の説明はランデ・メディカル・パブリケー
シッンズ（Ｌａｎｇｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｕｂｌｉｃ
ａｔｉｏｎｓ。 Ｌｏｓ Ａｌｔｏｓ ｓ ＣＡ ）により１９８２年に
発行されたサイテス（Ｄ、Ｐ、 ５ｉｔｅｓ ）ほかに
よる「基礎および臨床免疫学（Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃ
１１ｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、４版、２２
章、米国特許第３．６５４．０９０号、第３、８５０．
７５２号および第４，０１６，０４３号中に見出され、
それらはすべてここに参照される。 「酵素」は、しばしば特異的である基質中の若干の変化
を触媒作用により促進するかまたは生成することができ
るタンパク質を示す。 「エピトープ」は抗体結合部位により特異的に結合され
て免疫反応体を形成する分子の部分を示す。それはまた
決定基または抗原決定基として示される。 「免疫学的に模擬する」という語は、本発明のポリペプ
チドが、１）自生タンパク質により誘発された抗体によ
り免疫結合されることができ、２）誘発ポリペプチドお
よび自生タンパク質に結合する抗体の生成を誘発できる
ことを意味するために使用される。 種々の形態における「免疫反応する」という語はリガン
ドとしての抗原と、受容体としての抗体結合部位を含む
分子例えば全抗体またはその一部との間の結合を意味す
る。 用いた「免疫反応体」という語は免疫反応の生成物、す
なわちリガンドが受容体分子により免疫結合されるとき
に生ずるエンテイテイーを示す。 「標識手段」、「指示基」または「標識」は同義に使用
され、免疫反応体の存在を示す検出可能なシグナルの生
成に直接または間接に含まれる単個原子または分子が含
まれる。任意の標識手段を受容体に結合または取込ませ
、あるいは個々に使用することができ、それらの原子ま
たは分子は単独または他の試薬とともに使用できる。そ
のような指示基または標識自体は免疫化学においてよく
知られ、それらは他の新規受容体、方法および（または
）系で使用される限り本発明の一部を構成する。 「リガンド」は特異的受容体により結合される構造部分
を含む分子を示す。 「ペプチド」および「ポリペプチド」という語は、ペプ
チド結合により互いに結合した既知配列のアミノ酸残基
と同義に使用される。 用いた「薬学的に許容できる塩」という語は製薬工業に
使用される非毒性アルカリ金属、アルカリ土類金属およ
びアンモニウム塩を示し、よ（知られた方法により製造
されるナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、
マグネシウムおよびアンモニウム塩などが含まれる。そ
の語にはまた、本発明の化合物と適当な有機または無機
酸との反応により一般に製造される非毒性酸付加塩が含
まれる０代表的な塩には塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩
、硫酸水素塩、酢酸塩、シュウ酸塩、吉草酸塩、オレイ
ン酸塩、ラウリン酸塩、ボラート（ｖｏｒａｔｅ ）、
安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、トシラート、クエン酸
塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩
などが含まれる。 「受容体」という語は抗原に（または抗原と）免疫結合
する抗体結合部位からなる生物活性分子を示すために使
用される。そのような結合は典型的には約１０’〜約１
０１０リツトル毎分子の親和性で生じ、抗原のエピトー
プと受容体の抗体結合部位との特異的相互作用である。 受容体分子の生物活性は、免疫反応体を形成する水性媒
体中の混合物で少くとも生理学的１）Ｈ値およびイオン
強度における受容体とその抗原リガンドとの免疫反応に
より立証される。好ましくは、生物活性は生物検定条件
下に生ずる、すなわち、その条件で、本発明の受容体は
約５〜約９のｐＨ値範囲内で、例えば蒸留水ないし約１
モルの塩化“ナトリウムのイオン強度で抗原リガンドに
結合する。 受容体は抗原に特異的に結合できる抗体結合部位からな
る。受容体には抗体のＦａｂ、 Ｆａｂ’、Ｆ （ａｂ
’ ）ｚおよびＦ （Ｖ）ポリペプチド部分、並びに
抗体および実質的な全抗体が含まれる。抗体のＦａｂお
よびＦ（ａｂ’）ｇ部分はよく知られ、よく知られた方
法による実質上無傷の抗体の、それぞれパパインおよび
ペプシンのタンパク質分解反応により製造される、例え
ばセオフロボラウスほか（Ｔｈｅｏｆｉｌｏｐｏｌｏｕ
ｓ ａｎｄ Ｄｉｘｏｎ ）に対する米国特許第４，３
４２，５６６号参照。Ｆａｂ’抗体タンパク質もまたよ
く知られ、Ｆ（ａｂ’）、部分から、次に２重鎮タンパ
ク質を結合するジスルフィド結合の例えばメルカプトエ
タノールにより還元し、次いで生じたタンパク質メルカ
プタンを試薬例えばヨードアセトアミドによりアルキル
化することにより生成される。無傷完全抗体が好ましく
、本発明の単クローン性または他の受容体分子の例とし
て利用される。 「分泌する」および「生成する」という語はしばしば抗
体分子が得られる細胞に関して同義に使用される。しか
し、抗体を生ずる細胞はその環境中へそれらの分子を分
泌しない、関心のハイブリドーマ細胞はそれらの環境中
へ単クローン性抗体を分泌する。しかし、そのような細
胞はしばしば「抗体生成」細胞として示され、それらの
抗体は技術的に利用される語に従って「生成された」と
示される。 用いた「合成」という語はポリペプチド分子またはポリ
ペプチド反復単位が、生物手段により例えば遺伝子工業
技術により製造されるよりむしろ化学的手段すなわち化
学合成により作られたことを意味する。従って、本発明
の態様である合成ポリペプチドは天然存在タンパク質お
よびそのフラグメントを含まない。 Ｂ１合成ポリペプチド 本発明の合成ポリペプチドは、第１図およびベール（Ｂ
ａｅｒ ）ほか、ネーチ＋ −（Ｎａｔｕｒｅ ）、３
１０．２０７ （１９８４）のゲノム配列に帰属される
位置を用いてそのアミノ末端からおよそ位置３５０〜お
よそ位置３６２（７）ＥＢＶ ＥＡ−Ｄタンパク質の
アミノ酸残基配列に相当するアミノ酸残基配列を有する
約６〜約４０個のアミノ酸残基、より好ましくは約１０
〜約２４個の残基から実質的になる。該合成ポリペプチ
ドはＥＡ−Ｄにより誘発された抗体を免疫結合する能力
を有する。 好ましい実施において、ポリペプチドは、結合体として
免疫担体例えばキーホールリンペットヘモシアニン（Ｋ
Ｌ Ｈ）に結合させ、水性希釈剤中で有効量を宿主哺
乳動物例えばラット、マウス、ラビットまたはモルモッ
ト中へ導入すると結合体のポリペプチドと免疫反応する
だけでなく、また変性状態におけるＥＡ−Ｄと免疫反応
する抗体の分泌を誘発できる。より好ましくは、それら
の誘発された抗体は自生状態におけるＥＡ−Ｄと免疫反
応する。従って、好ましい態様において本発明のポリペ
プチドは自生ＥＡ−Ｄタンパク質の免疫原および抗原の
決定基を免疫学的に模擬することができる。 自生状態における典型的なＥＡ−Ｄは体液例えば急性Ｉ
Ｍの患者の血漿中に認められるタンパク質である。変性
状態における典型的なＥＡ−Ｄは、５Ｏ３−ＰＡＧＥお
よびウェスタンプロット分析に使用されるような２−メ
ルカプトエタノールで還元した後のタンパク質である。 好ましいアミノ酸残基配列には左から右へ、アミノ末端
からカルボキシ末端の方向にとって、式％式％ により表わされる配列、その薬学的に許容できる塩、お
よびその抗原関連変異体が含まれる。 アミノ酸残基配列の初めまたは末端におけるダッシュは
それぞれアミノ末端およびカルボキシ末端における基例
えばＨおよびＯＨ，あるいは、さらにポリペプチド鎖中
の合計４０個までのアミノ酸残基の１つまたはそれ以上
のアミノ酸残基の配列に対する結合を示すことが示さら
れる。 さらに、アミノ末端からおよそ位置３５０〜およそ位置
３６２のＥＡ−Ｄタンパク質のアミノ酸残基配列に相当
する少くとも６個のアミノ酸残基配列に加えて、ポリペ
プチド中に存在できるアミノ酸残基の配列が、ＥＡ−Ｄ
により誘発された抗体に対する免疫結合におけるポリペ
プチドの実質的特性が実質的に損なわれなければ無関係
であることができることが示さられる。より好ましくは
、ポリペプチドおよび前記の少くとも変性されたＥＡ−
Ｄと免疫反応する抗体の誘発における特有免疫原性もま
た実質的に損なわれない。 最も好ましくは、ポリペプチドはＥＡ−Ｄタンパク賞分
子の前記位置に等しい１つまたはそれ以上のアミノ酸残
基配列から実質的になる。前記ＥＡ−Ｄの配列に等しい
複数のアミノ酸残基配列を含む最も好ましいポリペプチ
ドはここに「ポリペプチドオリゴマー」として示される
群内にあり、以下に論議される。 殊に好ましいポリペプチドは左から右へ、アミノ末端か
らカルボキシ末端の方向にとって、式、Ｈ−ＰＡＲＰＥ
ＴＰＳＰＡ Ｉ ＰＳ−ＯＨにより表わされる配列、そ
の薬学的に許容できる塩およびその抗原関連変異体に相
当するアミノ酸配列を有する。 第１図を参照することにより知見できるように、前記ポ
リペプチドはベール（Ｂａｅｒ ）ほかのゲノム配列を
基にしたＥＡ−Ｄの位置３５０〜３６２の配列に等しい
アミノ酸残基配列を有する。 本発明のポリペプチドはポリペプチド当業者に知られて
いる任意の技術により合成することができる。そのよう
に利用できる多くの技術の優れた概要はスチュワードほ
か（Ｊ、Ｍ、 Ｓｔｅｗａｒｄ ａｎｄＪ、Ｄ、 Ｙｏ
ｕｎｇ ）、「固相ペプチド合成（５ｏｌｉｄ Ｐｈａ
ｓｅＰｅｐｔｉｄｅ ５ｙｎｔｈｅｓｉｓ ）Ｊ 、Ｗ
、Ｌフリーマン社（Ｗ、）１． Ｆｒｅｅ、ｓ＋ａｎ
Ｃｏ、、 Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ） 、
１９６９ ；固相ペプチド合成に対するマインホーフェ
ル（Ｍｅｉｎｈｏｆｅｒ ）、「ホルモンタンパク賞お
よびペプチド（Ｈｏｒｍｏｎａｌ Ｐｒｏｔｅ’ｉｎｓ
ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ） Ｊ、２巻、４６頁、
アカデミツク・プレス（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓＸ
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ）、１９７３；および古典的溶液合
成に対するシェローダーはか（Ｆ！、 ５ｃｈｒｏｄｅ
ｒａｎｄ Ｋ、 Ｋｕｂｋｅ ） 、ｒペプチド（Ｔｈ
ｅ Ｐｅｐｔｆｄｅｓ ）、１巻、アカデミツク・プレ
ス（八ｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎ６ｗ Ｙｏｒｋ
）、１９６５、に見出すことができる。 一般に、これらの方法は１つまたはそれ以上のアミノ酸
または適当に保護したアミノ酸の成長ペプチド鎖に対す
る逐次的付加を含む０通常、第１アミノ酸残基のアミノ
基またはカルボキシ基は適当な選択的に除去できる保護
基により保護される。 異なる選択的に除去できる保護基が反応性側基を含むア
ミノ酸例えばりシンに利用される。 例として固相合成を用いると、保護または誘導体化した
アミノ酸をその非保護カルボキシルまたはアミノ基によ
り不活性固体支持体に結合させる。 アミノまたはカルボキシル基の保護基を次に選択的に除
去し、適当に保護された相補性（アミノまたはカルボキ
シル）基を配列中に有する次のアミノ酸を混合し、既に
固体支持体に結合した残基とアミド結合の形成に適する
条件下に反応させる。 次いでアミノ基またはカルボキシル基の保護基をこの新
たに加えたアミノ酸残基から除去し、次いで同様に次の
アミノ酸（適当に保護された）を付加させる。所望のア
ミノ酸をすべて適当な配列に結合させた後、残存端およ
び側基保護基（並びに固体支持体）を逐次または同時に
除去すると最終ポリペプチドが得られる。 確認された全アミノ酸残基は天然のし配置にある。標準
ポリペプチド命名法〔ジャーナル・オブ・バイオロジカ
ル・ケミストリー、２４３．３５５７〜５９（１９６９
））に従って、アミノ酸残基に対する略号は次の対応表
に示されるとおりである。 対応表 Ｙ Ｔｙｒ Ｌ−チロシンＧ Ｇ
ｌｙ Ｌ−グリシンＦ Ｐｈｅ
Ｌ−フェニルアラニンＭ Ｍｅｔ Ｌ
−メチオニンＡ Ａｌａ Ｌ−アラニン
Ｓ Ｓｅｒ Ｌ−セリンＩ １
１ｅ Ｌ−インロイシンＬ Ｌｅｕ
Ｌ−ロイシンＴＴｈｒＬ−）レオニン Ｖ Ｖａｌ Ｌ−バリン Ｐ Ｐｒｏ Ｌ−プロリンＫ Ｌ
ｙＳ Ｌ−リシン ＨＨｉｓ Ｌ−ヒスチ゛ジン Ｑ Ｇｌｎ Ｌ−グルタミンＥ
Ｇｌｕ Ｌ−グルタミン酸Ｚ ｃ
ｉｘ Ｌ−グルタミン酸または Ｌ−グルタミン ＷＴｒｐＬ−）リブトファン ＲＡｒｇ Ｌ−アルギニン Ｄ Ａｓｐ Ｌ−アスパラギン酸Ｎ
Ａｓｎ Ｌ−アスパラギンＢ Ａ
ｓｘ Ｌ−アスパラギン酸または Ｌ−アスパラギン ＣＣｙｓ Ｌ−システィン Ｃ，ポリペプチド重合体 本発明はまた、少くとも２つの反復単位が前記本発明の
ポリペプチドである複数の結合した合成ポリペプチド反
復単位を含む合成ポリペプチドオリゴマーを意図する。 そのようなオリゴマーは合計約１２〜約４０個のアミノ
酸残基、より好ましくは約２５〜約４０個の残基を含む
０個々の反復単位は、２つのポリペプチド反復単位が存
在する場合に長さで約６〜約３４残基であることができ
る。前記のように、より好ましくはすべての反復単位が
本発明のポリペプチドであるだけでな（、またアミノ酸
残基配列がＥＡ−Ｄの配列に等しいポリペプチドである
。 本発明のポリペプチドオリゴマーはまたＥＡ−Ｄにより
誘発された抗体に免疫結合する能力を有することに特徴
がある。より好ましくはポリペプチドオリゴマーは、さ
らに免疫原担体例えばｉＨに結合させ、水性希釈組成物
で前記宿主哺乳動物中へ導入するとＥＡ−Ｄに免疫結合
する抗体の分泌を誘発する能力を有することに特徴があ
る。 殊に好ましいポリペプチドオリゴマーは、複数の、左か
ら右へ、アミノ末端からカルボキシ末端の方向に、式、 −ＰＡＲＰＥＴＰＳＰＡＩＰＳ − により表わされるアミノ酸残基配列を有する本発明の殊
に好ましい合成ポリペプチドを含む。 対応表の３文字略号を用いると、上記ポリペプチドはま
た式、 −ＰｒｏＡｌａＡｒｇＰｒｏＧｌｕＴｈｒＰｒｏＳｅｒ
ＰｒｏＡｌａｌｌｅｐｒｏＳｅｒ −により表わすこと
ができる。 従って、本発明のオリゴマーポリペプチドはそれらの成
分ポリペプチドと同様に、ヒト抗ＥＡ−Ｄ抗体に対して
抗原性であり、前記のように、より好ましくは免疫原性
である。従って、それらのオリゴマーポリペプチドは後
記診断法および系に有用である抗ＥＡ−Ｄ抗体の生成の
誘発に使用することができ、また適当な診断法および系
中に抗原として使用することができる。 全オリゴマーポリペプチド中に約３５個より少いアミノ
酸残基を含むオリゴマーは、典型的には免疫原として使
用するために免疫原担体例えばＫＬＨに結合させる。合
計約３５個以上のアミノ酸残基を含むオリゴマーポリペ
プチドは典型的には担体なく使用するのに十分な免疫原
性である。 オリゴマーポリペプチドは前記固相法を用いて頭−尾の
ように合成ポリペプチド単量体を互いに結合させること
により製造することができ、すなわち、１つの完全なポ
リペプチド配列を樹脂上に、次いで１つまたはそれ以上
の同一または異なるポリペプチド配列を合成し、その後
全オリゴマー単位を樹脂から開裂してここに記載したよ
うに用いる。そのような頭−尾ポリベブチド多量体は、
好ましくは約２〜約５個のポリペプチド反復単位を含む
。 あるいは、ポリペプチドオリゴマーを次に詳細に記載す
るように単量体、すなわち反復単位、として用いた合成
ポリペプチドの重合体として製造することができる。そ
のような目的に対する典型的な連鎖停止剤は２−メルカ
プトエタノール、チオグリコール酸およびチオプロピオ
ン酸である。 Ｄ、ポリペプチド重合体 用いた「ポリペプチド重合体」という語は種々の文法形
態で複数の本発明の合成ポリペプチドを反復単位として
含む分子として示される。それらのポリペプチド反復単
位はポリペプチド結合以外により互いに結合され、その
重合体は約１００個以上のアミノ酸残基を含む、従って
、本発明の重合体は、水性組成物中に約５〜約９のｐＨ
値で、好ましくは約６．５〜約７．５のｐＨで分散性で
あれば、約１０．０００またはそれ以上の見掛は分子質
量、Ｍｒｓを存する。ポリペプチド反復単位は同一かま
たは異なることができ、重合体中に存在する他のポリペ
プチドがＥＡ−Ｄにより誘発された抗体と重合体との免
疫反応を実質的に妨害または異なるような抑制をしない
、すなわち重合体の抗原性を妨害しない限り、本発明の
アミノ残基配列以外の１つまたはそれ以上の他の配列を
含むことができる。重合体中の本発明のポリペプチド以
外のポリペプチドの存在もまた、好ましくは重合体の免
疫原性を実質的に抑制しない。 ポリペプチド重合体（合成多量体）は、典型的には高い
免疫原性および抗原性である利点を有する。さらに、重
合体免疫原を用いるとき典型的には担体を必要としない
。異なるポリペプチド単量体を重合体の製造に用いる場
合には、若干のＥＡ−Ｄ抗原決定基に対する抗体と免疫
反応する能力が得られる。なお他の利点は、接種材料中
に用いるとＥＡ−Ｄの若干の抗原決定基と免疫反応する
抗体を誘発する重合体の能力である。 本発明の典型的な重合体はアミノ末端およびカルボキシ
末端の両方に付加したシスティン残基を含む本発明のポ
リペプチド単量体（ジＣｙｓポリペプチド〉を用いて合
成することができる。ジＣｙｓポリペプチド単量体は酸
化操作を用いる分子内、ポリペプチド間システィンジス
ルフィド結合により互いに結合させ、免疫原性、抗原性
重合体を形成させることができる。そのように製造され
たポリペプチド重合体は複数の、本発明の合成ポリペプ
チドを反復単位として含む。それらの反復単位は前記酸
化されたシスティン（シスチン）残基により互いに結合
される。 担体にポリペプチドを結合させる目的、またはポリペプ
チド重合体の製造に対する本発明のポリペプチド中の１
つまたは２つの末端Ｃｙｓ残基の存在は本発明のポリペ
プチドのアミノ酸残基配列を変えるとは解されない。 殊に好ましいポリペプチド重合体は、左から右へ、アミ
ノ末端からカルボキシ末端の方向に、式、−ＰＡＲＰＢ
ＴＰＳＰ＾ＩＰＳ− により表わされるアミノ酸残基配列を有する本発明の殊
に好ましい合成ポリペプチドを複数含む。 従って、本発明の合成多量体ポリペプチドは、それらの
成分ポリペプチドと同様に、ヒト抗ＥＡ−Ｄ抗体に対し
て抗原性であり、前記のように一層好ましい免疫原性で
ある。従って、それらの合成多量体ポリペプチドは、後
に論議する診断法および診断系に有用な抗ＥＡ−Ｄ抗体
の生成の誘発に使用でき、また適当な診断法および診断
系中に抗原として使用できる。 Ｅ、基１隻 もう１つの実施態様に於て、本発明のポリペプチドを薬
剤学的に受容可能な水性希釈剤組成物中で用いて、有効
量で投与するときＥＡ−Ｄと免疫反応する抗体を誘導す
る能力のある接種物を形成する。 種々の文法上の形に於ける“接種物（ｉｎｏｃｕｌｕｍ
）”という用語は、本明細書中ではＥＡ−Ｄに対する抗
体の調製に用いられる活性成分として本発明のポリペプ
チドを含む組成物を記載するために用いられる。ポリペ
プチドを抗体の誘導に用いる場合、ポリペプチドは免疫
原担体に結合させて、あるいは担体なしまたは担体に結
合させたオリゴマーポリペプチドとして、あるいはポリ
ペプチドポリマーとして用いることができるが、表現が
容易なために本明細書中では本発明のポリペプチドの種
々の実施態様を一括的に“ポリペプチド”およびその種
々の文法上の形で呼ぶと理解されるべきである。 約３５個より少ないアミノ酸残基を含むポリペプチドで
は、既述のように抗体産生を誘導するために免疫原担体
を用いることが好ましい。 これまた既述したように、１個以上の追加のアミノ酸残
基を合成ポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末
端へ付加してポリペプチドの担体への結合を助けること
ができる。合成ポリペプチドのアミノ末端またはカルボ
キシ末端に付加されたシスティン残基はジスルフィド結
合によるポリマーの生成に特に有用であることが見いだ
された。 しかし、結合物調製のための技術上公知の他の方法を用
いることもできる。典型的な付加結合方法はミカエル（
Ｍｉｃｈａｅｌ）付加反応生成物、グルタルアルデヒド
のようなジアルデヒドの使用、クリブスタイン（Ｋｌｉ
ｐｓｔｅｉｎ） ら、Ｊ、 Ｉｎｆｅｃ、 Ｄｉｓ、
＋ １４７−。 ３１８３２６ （１９８３）など、あるいは前に論じた
ように複数のポリペプチドを一緒に結合して合成マルチ
マーを生成させるため、免疫原担体ヘアミド結合を生成
するために水溶性カルボジイミドの使用に於けるような
カルボジイミド技術の使用を含む。 有用な免疫原担体は技術上公知であり、一般に蛋白質自
体である。かかる担体の典型例はスカシガイのヘモシア
ニン（ＫＬＨ）、エデスチン、チログロブリン、牛血清
アルブミン（ＢＳＡ）またはヒト血清アルブミン（ＨＳ
Ａ）のようなアルブミン、羊赤血球（ＳＲＢＣ）のよ
うな赤血球、テナヌストキソイド、コレラトキイソイド
ならびにポリ （Ｄ−リシン：Ｄ−グルタミン酸）のよ
うなポリアミノ酸である。 これまた技術上公知であるように、合成ポリペプチドを
中間結合基によってその担体へ結合させることがしばし
ば便利である。しかし、システィンを用いる場合、中間
結合基は本明細書中で用いたように好ましくはｍ−マレ
イミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｍ
ＢＳ）である。 さらに、リウ（Ｌｉｕ） ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｏ、８
０．６９０（１９７９）によって記載されているように
エステル−アミド交換反応によってＭＢＳを最初に担体
へ付加させることができる。その後で、この付加の次に
アレイミドニ重結合にわたってチオール酢酸（ｃＨ，Ｃ
０８Ｈ）のような封鎖メルカプト基の付加を行うことが
できる。アシル封鎖基の分離後、脱封鎖結合基メルカプ
タンと合成ポリペプチドの付加システィン残基のメルカ
プタンとの間にジスルフィド結合を生成させる。 担体の選択は免疫原の抗原決定基部分よりも免疫原の最
終使用の方により依存してふり、本発明に特別に含まれ
てはいない基準に基づいている。 例えば、特別な非ヒト宿主（受容体）動物に不都合な反
応を生じない担体を選ぶべきである。 本発明の接種物は、本発明のポリペプチドの有効免疫原
量を、オリゴマーポリペプチドとして、あるいは酸化さ
れたポリペプチド末端システィン残基によって一緒に結
合された個々のポリペプチドのポリペプチドポリマーと
して、あるいは担体へ結合された結合物として含む、単
位用量当たりのポリペプチドの有効量は、特に、接種さ
れる動物の種、動物の体重および技術上公知のように選
ばれた接種方法に依存する。接種物は１回の接種（Ｎ）
につき約１０μｇ−約５００μｇのポリペプチド濃度を
含む、ここに挙げたポリペプチド量は、担体を用いる場
合には、担体の重量を含まないポリペプチドの重量を意
味する。特別な典型的接種物は、担体＋ポリペプチド（
結合物）の重量が示される下文に記載される。 “単位用量”という用語は動物に対する１回投与量とし
て適当な物理的に別個の単位を意味し、各単位は所望の
治療効果を生ずるように計算された活性物質の所定量を
、所要な希釈剤、すなわち担体またはビヒクルと共に含
む。本発明の新規単位用量の規格は、本明細書中で詳細
に記載したような、かつこれらが本明細書の特徴である
＋ａｌ活性物質の独特な特性および達成されるべき特別
な免疫学的効果と、（ｂｌかかる活性物質を動物に於け
る免疫学的使用のために配合する技術に固有の制限によ
って指令されかつこれらに直接依存する。 接種物は、典型的には乾燥固体ポリペプチド−結合物、
オリゴマーポリペプチドまたはポリペプチドポリマーか
ら、ポリペプチド−結合物またはポリペプチドポリマー
を、公知のように水、食塩水、燐酸塩緩衝食塩水などの
ような生理学的に許容できる（受容可能な）希釈剤中に
分散させて水性組成物を生成させることによって調製さ
れる。 接種物は希釈剤の部分としてアジュバントをも含むこと
ができる。フロイントの完全アジュバン） （ｃＦＡ）
、フロイントの不完全アジュバント（ＩＦＡ）および
明春のようなアジュバントが技術上公知であり、幾つか
の供給源から市販されている。 Ｆ、上」じ乙と二 本発明のポリペプチドによって誘導される（に対して産
生される）抗体および実質的に全部の抗体ならびにかか
る抗体から調製される抗体結合部位は本発明のさらにも
う１つの実施態様を構成する。これらの分子を本明細書
中では一括的にレセプターと称する。レセプターは、上
で説明した接種物を用いる免疫処置によってマウス、ウ
サギ、ヤギ、モルモット、ウマなどのような哺乳類宿主
中で産生される。 モノクローン形の適当なレセプター、典型的には全抗体
は、ナイマン（Ｎｉｍａｎ） ら、Ｐｒｏｃ、 Ｎａ
ｔｌ。 Ｓｃｉ、 Ｕ、Ｓ、Ａ、 、８０．４９４９−４９５３
（１９８３）によって記載（この記載は参照文として
本明細書に含まれるものとする）されたハイブリドーマ
技術を用いて調製することもできる。要するに、モノク
ローンレセプターがそれから産生されるハイブリドーマ
を生成させるために、骨髄腫または他の自己永続性細胞
系を本発明のポリペプチドで過免疫処置された哺乳動物
の肺臓から得られるリンパ球と融合させる。 骨髄腫細胞系はリンパ球と同じ動物種からのものである
ことが好ましい、典型的には、株１２９ｃｉｘ’のマウ
スが好ましい哺乳動物である０本発明に用いるために適
当なマウス骨髄腫はアメリカンタイプカルチャーコレク
ション（ＡｇｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ
Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）、（メリーランド州ロックビル
市）からそれぞれＣＲＬ１５８０およびＣＲＬ１５８１
の名称で入手できるヒポキサンチン−アミノプテリン−
チミジン−感受性（ＨＡＴ）細胞系Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ
８．６５３およびＳｐ２１０−Ａｇ１４を含む。 典型的には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）１５０
０を用いて１Ｉ１１！細胞を骨髄腫細胞と融合させる。 融合したハイブリッドをそのＨＡＴに対する感受性で選
択する０本発明のハイブリドーマ分泌レセプター分子は
本明細書中で説明した酵素結合免疫吸着剤検定（ＥＬ
Ｉ ＳＡ）を用いて同定される。 レセプターとしてのモノクローン抗体はハイブリドーマ
上澄液から得られる必要があるばかりでなく、所望のハ
イブリドーマをその中へ導入しである哺乳動物の腹水か
ら一般により濃厚な形で得ることもできる。腹水を用い
るモノクローン抗体の調製は公知であるので、ここでは
それ以上取り扱わないことにする。 本発明のレセプターはレセプターがそれに対して産生さ
れたポリペプチドへ結合すると共に、本発明のポリペプ
チドが免疫学的に模倣する対応するＥＡ−Ｄ抗原決定部
位にも結合する。かくして、本発明のポリペプチドは免
疫原と抗原との両方であることができる。 本発明のポリペプチドによって誘導され、かつオリゴマ
ーポリペプチドおよびポリペプチドポリマーを含む本発
明のレセプターは、無傷のＥＡ−Ｄによって模倣される
エピトープに比べて比較的少ないエピトープを有する免
疫原（比較的小さいポリペプチド）に対して産生される
ので、天然産多クローン性抗体に比べてオリゴクローン
性テするとして記載することができる。結局、本発明の
レセプターはポリペプチドのエピトープに結合するが、
全ＥＡ−Ｄ分子に対して産生される天然産抗体はＥＡ−
Ｄ分子全体にわたるエピトープに結合し、多クローン性
であると言われる。 本発明の合成ポリペプチドは、血液、血清または血漿の
ような液体試料中の抗ＥＡ−Ｄ抗体の存在および量の検
定のために特にを用である。 １つの実施態様に於て、本発明は下記工程からなる抗Ｅ
Ａ−Ｄ抗体の存在についての体液試料の検定方法を意
図する。 （ａ） 被検定体液試料を提供する工程。典型的には
かかる試料は既知量の血液として、より好ましくは血清
または血漿として提供される。血液、血漿および血清試
料を提供する方法は技術上公知であり、ここではこれ以
上論じない。 （ｂ） Ｅ Ａ −Ｄ蛋白質の約３５０位から約３６
２位までのＥＡ−Ｄ蛋白質のアミノ酸残基配列にほぼ相
当するアミノ酸残基配列を有する本質的に約６−約４０
個のアミノ酸残基からなる合成ポリペプチドであって、
ＥＡ−Ｄによって誘導される抗体によって免疫学的に結
合される能力を有する合成ポリペプチドを提供する工程
。 （ｃ） 該体液試料を該ポリペプチドと混合して免疫
反応混合物を生成する工程。 （ｄｌ 試料中に存在する抗ＥＡ−Ｄ抗体がポリペプ
チドと免疫学的に結合して第１免疫反応体（ｉ ｍｍｕ
ｎｏｒｅａｃ ｔａｎ ｔ）を生成するのに十分な約４
℃−約４５℃の温度に於て約１０分から約１６−２０時
間までのような所定時間生物学的検定条件下で混合物を
保持する工程。 生物学的検定条件とは本発明のポリペプチド分子および
検定しようとする抗ＥＡ−Ｄ抗体の生物活性を保持する
条件であって、約４℃−約４５℃の温度範囲、約５−約
９のｐＨ値範囲および蒸留水から約１モルの塩化ナトリ
ウムまでにわたるイオン強度を含む、かかる条件の最適
化方法は技術上公知である。 （ｅ） 生成された免疫反応体（ｉｍｍｕｎｏｒｅａ
ｃｔａｎｔ）の存在、それによって免疫反応混合物中に
於ける抗ＥＡ−Ｄ抗体の存在を検定する工程。 抗ＥＡ−Ｄ含有免疫反応体の存在の直接または間接的検
定は技術上公知の検定技術で達成される。 例えば米国特許第４．５３６，４７９号、第４．２３３
．４０１号、第４．２３３．４０２号、第３．９９６．
３４５号に記載（これらの記載は参照文として本明細書
に含まれるものとする）されているような均一検定シス
テムを用いることができる。 好ましい実施Ｂ様に於ては、工程（ｅ）による検定のた
めに、工程（ｄ）の第１免疫反応体は下記の工程によっ
てさらに調製される。 （ｉ）第１免疫反応体中に存在するヒト免疫グロブリン
に結合する生物学的に活性な標識された特異結合剤、好
ましくはレセプターを混合して複合体、好ましくは標識
された第２免疫反応体を生成させる工程。より好ましく
は、標識された特異結合剤は免疫グロブリンクラス特異
性であり、すなわち結合剤は以下に説明するように、Ｉ
ｇＧ、ＩｇＭまたはＩｇＡクラスの免疫グロブリンと特
異的に免疫反応する能力がある。標識された特異結合剤
は複合体中の特異結合剤の存在を信号で知らせる能力が
ある。 （ｉｉ）そのようにして生成された標識された特異結合
剤／第１免疫反応体混合物を、標識された特異結合剤が
第１免疫反応体として存在するＥＡ−Ｄ抗体と複合体を
生成するために十分な所定時間の間生物学的検定条件下
に保持する工程。 抗ＥＡ−Ｄ抗体を含む第２免疫反応体の部分として結合
される標識された特異結合剤の存在の検定は試料中の抗
ＥＡ−Ｄ抗体の存在の検定を提供する。好ましい実質態
様に於ては、複合体の部分として結合された標識された
第２特異結合剤の量が測定され、それによって試料中の
抗ＥＡ−Ｄ抗体の量が決意される。その量は零であるこ
とがあり、それによって検知され得る限界内で試料中に
抗ＥＡ−Ｄ抗体が存在しないことを示すことがあり得る
。標識された特異結合剤の存在および量の検定方法は用
いられる標識に依存し、かかる標識および検定方法は技
術上公知である。 全抗体の形のレセプターのような蛋白質特異結合剤の標
識は技術上公知である。例えば、ハイブリドーマによっ
て産生されるレセプターはＩＪＩｍ培地中の成分として
提供される放射性同位体含有アミノ酸の代謝的結合によ
って標識され得る０例えばガルフレ（Ｇａｌｆｒｅ）ら
、Ｍｅｔｈ、 Ｉ！ｎｚ ｗｏｏｌ、 ７３．３−４６
（１９８１）参照。活性化官能基による蛋白質結合（
ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）またはカンプリングの技術は
特に適用可能である。例えば、アウラミーズ（八ｕｒａ
ｍｅａｓ） ら、 ５ｃａｎｄ、 Ｊ、 Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ、 ＶＯｌ、 ８ Ｓ且肚ｈユ、７−２
３ （１９７８）および米国特許第４，４９３，７９５
号（これらの記載は参照文として本明細書に含まれるも
のとする）参照。さらに、標識が第２レセプターとその
標的抗原との免疫反応をほとんど妨害しないように部位
指示カップリング（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｃｏ
ｕｐｌｉｎｇ）反応を行うことができる。例えば、ロッ
ドウェル（Ｒｏｄｗｅｌｌ） ら、Ｂｉｏｔｅｃｈ、
３．８８９−８９４ （１９８５）参照。 標識手段は抗体または抗原にそれらを変性することなく
化学的に結合して有用な免疫螢光トレーサーである螢光
色素（染料）を生成する螢光標識剤であることができる
。適当な螢光標識剤はフルオレッセインイソシアネート
（ＦＩＣ）、フルオレッセインイソチオシアネート（Ｆ
ＩＴＣ）、５−ジメチルアミノ−１−ナフタレンスルホ
ニルクロリド（ＤＡＮＳＣ） 、テトラメチルローダミ
ンイソチオシアネー） （ＴＲＩＴＣ）、リサミン、ロ
ーダミン８２００スルホニルクロ！Ｊ ）’ （ＲＢ２
００ ＳＣ）などのような螢光色素である。免疫螢光分
析技術の説明はマーチャロニス（Ｍａｒｃｈａｌｏｎｉ
ｓ）う編著、アンティボディアズアトウール（Ａｎｔｉ
ｂｏｄｙＡｓ Ａ Ｔｏｏｌ） Ｃジョンウィリーアン
ドサンズ（ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ ＆ ５ｏｎｓ） 、Ｌ
ｔｄ、 、ｐｐｌ ８９−２３１ （１９８２） Ｅ中
のデル力（ＤｅＬｕｃａ）、“免疫螢光分析（Ｉｍｍｕ
ｎｏ−Ｐｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ）
”中に記載されている（この記載は参照文として本明
細書に含まれるものとする）。 好ましい実施態様に於て、指示基はワサビ大根ペルオキ
シダーゼ（ＨＲＰ）、ブドウ糖酸化酵素などのような酵
素である。主指示基がＨＲＰまたはブドウ糖酸化酵素の
ような酵素であるかかる場合には、レセプター−配位子
複合体（免疫反応体）が生成した事実を目に見えるよう
にするため追加試薬が所要である。ＨＲＰ用のかかる追
加試薬には過酸化水素およびジアミノベンジジンのよう
な酸化染料前駆物質が含まれる。ブドウ糖酸化酵素につ
いて有用な追加試薬は２，２′−アジノジー（３−エチ
ルベンズチアゾリンＧ−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）であ
る、放射性元素も有用な標識剤であり、ここで実例的に
用いられる。 典型的な放射性標識剤はγ線放出を生ずる放射性元素で
ある。それ自体がγ線を放出する１！４Ｉ、ｌｔＪ、１
２１１Ｓ１３１１％ ””１％ ”Ｃｒはγ線放出生起
性放射性元素指示基の１つのクラスを示す。 Ｉｔｓ ｌが特に好ましい、有用な標識手段のもう１つ
の群はそれら自体が陽電子を放出するＩＩＣ，ｌ１ｌｐ
、ｌ５Ｏ１１３Ｎのような元素である。そのように放出
された陽電子は動物体内に存在する電子と遭遇するとき
γ線を生成する １１１１ｎまたは！Ｈのようなβ放出
体も有用である。 本発明の検定方法および系は固体担体を形成するための
固体マトリックスに結合された本発明の抗原またはレセ
プターを利用することができる。 抗原またはレセプターは、典型的には水性媒質すら吸着
によって固体マトリックスへ結合されるが、幾つかの吸
着様式ならびに当業者に公知の他の結合様式を用いるこ
とができる。かかる様式の典型例は架橋されたデキスト
ロースまたはセルロースのようなブドウ糖含有マトリッ
クスと臭化シアンとの反応によって生成される反応性カ
ルボキシル官能性とレセプターまたは抗原との反応、ラ
テックス粒子と共に後述するようなグルタルアルデヒド
結合などである。 有用な固体マトリックスは技術上公知である。 かかるマトリックスには、ファーマシアファインケミカ
ルズ（Ｐｈａｒ＋＋＋ａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉ
ｃａｌｓ） （米国二ニーシャーシー州ピスカタウェイ
市）からセファデックス（ＳＥＰＩ（ＡＤＥＸ）の商標
で発売されている架橋デキストラン；アガロース（ａｇ
ｏｒｓｅ） ；米国イリノイス州ノースジカゴのアボッ
トラボラトリーズ（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ）から発売されている直径約１μｍ−約５鶴のポ
リスチレンビーズ；シート、ストリップまたはパドルの
ようなポリ塩化ビニル、ポリスチレン、架橋ポリアクリ
ルアミド、ニトロセルロースまたはナイロン−ベースの
ウェブ；ガラス；あるいはポリスチレンまたはポリ塩化
ビニル製のようなミクロタイタープレートの管、プレー
トまたはウェルが含まれる。 凝集型検定に有用なラテックス粒子も有用な固体マトリ
ックスである。かかる物質は日本合成ゴム会社（Ｊａｐ
ａｎ ５ｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｒｕｂｂｅｒ Ｃｏｍｐａ
ｎｙ ｏｆＴｏｋｙｏ、 Ｊａｐａｎ）から発売されて
おり、陰イオン性石けん中に分散されたカルボキシ官能
性粒子として記載されている。かかる粒子の典型的なロ
フトは０．３０８μｍの平均直径を有し、カルボキシ基
１個につき約１５−約３０Ａ２の平均カルボキシ官能基
分布を有する。 使用する前に、粒子を１．３−ジアミノ−３−プロパツ
ールのようなジアミノと反応させて遊離アミノ基を保持
しながら粒子カルボキシ基と複数のアミド結合を生成さ
せる。その後で、遊離アミノをグルタルアルデヒドのよ
うなジアルデヒドおよびレセプターまたは抗原と反応さ
せてシッフ塩基反応生成物を生成させる。その後で、シ
ッフ塩基反応生成物を硼水素化ナトリウムのような水溶
性還元剤で還元して有用な固体担体を提供する。 本発明で利用することができる数多くの免疫検定法があ
ることを当業者は理解するであろう。しかし、抗ＥＡ−
Ｄ抗体と本発明のポリペプチドとの反応によって与えら
れる信号をもたらすどんな方法でも意図される。さらに
、特に記載した検定システムおよび方法は固相を利用す
るが、本発明はそれに限定されるものではない。これら
の検定方法のおのおのは指示手段が免疫反応、かつそれ
によって検定されるべき抗体と本発明のポリペプチドと
の結合の信号を出すために利用される。模範的な技術は
マギオ（Ｍａｇｇｉｏ）、エンザイムイムノアッセイ（
Ｅｎｚ ｍｅ ｒｎ＋ｍｕｎｏａｓｓａ ） ＣＲＣブ
レス（米国オハイオ州りリープラント市）（１９８１）
、およびゴールドマン（Ｇｏｌｄｍａｎ） 、フルオレ
ッセントアンティボディメソッド（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅ
ｎｔ ＡｎｔｉｂｏｄｙＭｅｔｈｏｄｓ）、アカデミツ
クプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）（米国ショ
ーヨーク州ニューヨーク市） （１９８８）中に説明
されている。 ２、抗ＥＡ−Ｄ抗体を検定するための診断システ本発明
の抗ＥＡ−Ｄ抗体検定法を行うために有用な、好ましく
はキットの形の診断システムは、別個の包装で（ａｌ
Ｅ Ｂ Ａ Ｅ Ａ −Ｄ蛋白質のアミノ末端から約
３５０位から約３６２位までのＥＢＶＥＡ−Ｄ蛋白質の
アミノ酸残基配列に実質的に相当するアミノ酸残基配列
を有する本質的に約６−約４０個のアミノ酸残基からな
る合成ポリペプチドと（ｂｌ該ポリペプチドと抗ＥＡ−
Ｄ抗体の免疫反応の信号を出すための標識された特異結
合剤とを含む。好ましくは、標識された特異結合剤は酵
素に結合したレセプターである。 好ましい実施態様に於ては、システムはポリペプチドが
それに結合して固体支持体を形成する固体マトリックス
をも含む、有用な固体マトリックスは既に記載しである
。しかし、好ましくは、固体マトリックスはミクロタイ
タープレートのウェルである。最も好ましくは、固体支
持体は固体マトリックスに結合した既知量のポリペプチ
ドで提供される。 好ましい実施態様に於ては、陽性の対照として用いるた
めの本発明のポリペプチドに対して産生される抗体をも
含む。 既知量のポリペプチドおよび標識された特異結合剤が提
供される。これらの量は１回の検定を行うために少なく
とも十分な量である。ポリペプチドおよび標識された特
異結合剤は、典型的には、以下に記載されるように、水
、食塩水または緩衝液で所定容量に希釈するように設計
される形および量で提供される。 システムには追加の包装をも含むことができる。 かかる包装は（ｉ）乾燥形または液状の緩衝塩（ｉｉ）
ｏ−フヱニレンジアミノのような酵素基質などを含むこ
とができる。 ３、旦人二旦■挾定 本発明は体試料中に於けるＥＡ−Ｄの存在の検定方法を
も意図している。一般に、アセトンまたはメタノール固
定によって溶解された溶解末梢血液リンパ球（Ｐ Ｂ
Ｌ）のような被検体試料が提供される。試料は本発明の
合成ポリペプチドによって誘導される抗体結合部位を含
むレセプター分子と混合される。混合物は、レセプター
分子が体試料中に存在するＥＡ−Ｄと免疫反応するため
に十分な所定時間生物学的検定条件下に保持される。 次に、免疫反応の量（すなわち生成した免疫反応体のり
を測定して被検体試料中にＥＡ−Ｄ分子が存在していた
か不在だったかを決定する。 ４、ＥＡ−Ｄ ＃ システム 上記検定方法を実施するために有用な好ましくはキット
形の診断システムは、別個の包装で、（ａ）ＥＡ−Ｄと
免疫反応する本発明のレセプターと世）本発明のレセプ
ターとＥＡ−Ｄとの免疫反応を信号で示すための標識さ
れた特異結合剤とを含む。 好ましい実施態様に於ては、キットは、別個の包装で、
レセプターと反応するモルモット補体のような補体、抗
免疫グロブリン抗体またはＳ、アラスレウス（Ｓ、ａｕ
ｒｅｕｓ）コワン（ｃｏｗａｎ）株蛋白質Ａのような増
幅用試薬をも含む。これらの実施態様では、増幅手段が
本発明のレセプターに結合するとき、増幅手段に特異的
に結合する能力がある。 ここで記載した診断システムのレセプター分子と別個の
指示手段ならびに上記増幅用試薬は、溶液で、あるいは
液状分散体として、あるいは実質的に乾燥した粉末、例
えば凍結乾燥形粉末として提供されることができる。指
示手段が増幅用試薬とは別個の分子である場合には、指
示手段を別個に包装することが好ましい。指示手段が酵
素である場合には、酵素の基質もシステムの別個の包装
で提供することができる。前述の顕微鏡スライドのよう
な固体マトリックス、１種以上の緩衝剤、アセトンもこ
の診断検定システムの別個包装要素として含むことがで
きる。 診断システムに関連してここで述べた包装は診断システ
ムに於て通常用いられる包装である。かかる包装はガラ
スおよびプラスチック（例えばポリエチレン、ポリプロ
ピレン、ポリカーボネート）のびん、バイアル、プラス
チックおよびプラスチック箔積層封筒などを含む。 の の ノエ 下記の実施例は本発明を説明するためのものであって、
限定するためのものではない。 ！ＪｌｆＬＬ： ボｉペプチドのＡ ＥＡ−Ｄ遺伝子を位置決定し、その解読枠を決定するた
め、ＥＡ−Ｄ蛋白質のアミノ末端の一部分を親和性精製
ＥＡ−Ｄを用いて順序付け（ｓｅｑｕｅｎｃｅ；した。 かくして得られたアミノ酸残基配列をＢＢＶゲノムの可
能なアミノ酸残基配列翻訳と、そう（りのものが見いだ
されるまで比較し、それによって推定ＥＡ−Ｄおよびそ
の解読枠を同定した。その解読枠に基づいてＥＡ−Ｄ蛋
白質遺伝子の翻訳されたアミノ酸残基配列を、ベール（
Ｂａｅｒ）ら、主−チ＋−（Ｎａｔｕｒｅ）３１０．２
０７ （１９８４）によって利用されたＥＢＶ株に対し
て第１図に示す。 上で得たアミノ酸残基配列を用いて、翻訳された遺伝子
の部分に対応する一連の短い合成ポリペプチドを合成し
、それらの自生のＥＡ−Ｄの抗原決定基を模倣する能力
を試験した。これらのポリペプチドのアミノ酸残基配列
およびＥＡ−Ｄ蛋白質中に於けるアミノ末端からのその
配列の位置を、下記第１表中に、アミノ末端からカルボ
キシ末端への方向に、左から右へ示しである。 １１７ ＰＡＲＰＩ！ＴＰＳＰＡＩＰＳＣ”
３５０−３６２に６ ＲＫＲＴＳＳＩ！
ＡＲＩＫＱＫＣ” ３７９−３９１に５
ＰＫＫＶＫＱＡＦＮＰＬＩＣ” ３９３−４
０４１１８ ＴＶＳＰＳＰＳＰＰＰＰＰＲＴＰ
Ｃ鵞 ３３１−３４５゜Ｋ９ ５ＶＡＡＤＳＬ
ＡＡＡＬＳＬＣ２４２−２５５１ベール（Ｂａｅｒ）ら
、ネーチ＋ −（Ｎａｔｕｒｅ）、３１０２０７ （１
９８４）に報告されているゲノム配列データから翻訳、
推定されたＥＡ−Ｄ分子のアミノ末端からの位置。 ２カツプリングの目的で付加されたカルボキシ末端シス
ティンは同族ＥＡ−Ｄ蛋白質アミノ酸残基配列中には存
在しない。 上の第１表中に示したポリペプチドはメリフィールド（
Ｍｅｒｒｉｆ ｔｅｌｄ）ら、Ｊ、 Ａｍ、 ＣｈｅＩ
Ｉｌ、 Ｓｏｃ、 、８５．２１４９−２１５４ （１
９６３）およびホートン（ｌｏｕｇｈｔｏｎ）ら、Ｉｎ
ｔ、 Ｊ、 Ｐｅ ｔ、 Ｐｒｏｔ、 Ｒｅｓ。 １６．３１１−３２０ （１９８０）中に記載されてい
る固相法によって化学的に合成された。ポリペプチド合
成の固相法はベガバイオテクノロジーズ社（Ｖｅｇａ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、 Ｉｎｃ−＋ Ｔｕ
ｃｓｏｎ＋ Ａｚ）から市販されているベガモデル２５
０Ｃポリペプチドシンセサイザー（Ｖｅｇａ Ｍｏｄｅ
ｌ ２５０ＣＰｏ１ｙｐｅｐｔｉｄｅＳｙｎ ｔｈｅｓ
１ｚｅｒ）を用いて実施され・た。 Ｋ９以外のポリペプチドの場合には、システィン残基を
カルボキシ末端へ付加して下記のように蛋白質担体への
カップリングを助けた。全ポリペプチドの組成はアミノ
酸分析で確認した。 上記固相法で本発明の合成ポリペプチドを製造する場合
、アミノ酸残基をカルボキシ末端残基からエステル結合
によって樹脂（固相）に結合させた。ポリペプチドをＣ
ｙｓ残基によって担体へ結合させようとする場合あるい
は末端Ｃｙｓ残基を経て重合させようとする場合には、
樹脂にエステル結合しているカルボキシ末端残基として
そのＣｙｓ残基を利用するのが便利である。 典型的には各付加アミノ酸のα−アミノ基を第三ブトキ
シカルボニル（ｔ−ＢＯＣ）で保護した後、成長しつつ
あるポリペプチド鎖中へ次のアミノ酸を付加する。次に
、そのｔ−ＢＯＣ基を除去した後、成長しつつあるポリ
ペプチド鎖へ次のアミノ酸を付加する。 ポリペプチドの合成中には、反応性アミノ酸側鎖も保護
した。残りのアミノ酸残基のために次のような通常の側
鎖保護基を用いた。 チロシンのためには０−（ｐ−ブロモベンジルオキシカ
ルボニル）；スレオニン、セリン、アスパラギン酸、グ
ルタミン酸のためにはＯ−ベンジル；システィンのため
にはＳ−メトキシベンジル；ヒスチジンのためにはジニ
トロフェニル；リシンのためには２−クロロベンゾキシ
カルボニル；アルギニンのためにはトシル。 使用する前に、保護されたアミノ酸を適当な溶媒から再
結して薄層クロマトグラフィーで単一スポットとする。 カップリングは、典型的には初期Ｎ−末端アミノ酸のミ
リ当量数より１０倍モル過剰の保護アミノ酸とジシクロ
へキシルカルボジイミドの両方を用いて行われた。両方
の反応剤の２モル過剰も用いることができる。アスパラ
ギンの場合には、等モル量のＮ−ヒドロキシ−ベンゾト
リアゾールを保護アミノ酸へ付加し、ジメチルホルムア
ミドを溶媒として用いた。カップリング反応はすべて、
ギシン（Ｇｉｓｉｎ） 、Ａｎａｌ、 ＣｈｅＩｌｌ、
八ｃｔａ。 ５８．２４Ｂ−２４９（１９７２）のピクリン酸試験に
よって９９％以上完全であった。 所望のポリペプチドの製造後、得られた保護ポリペプチ
ドの一部分（約１ｇ）を２ｗｉのアニソールで処理し、
ドライアイス温度に於ける反応器中へ約２０ｍｊ＋の無
水弗化水素を凝縮させた。得られた混合物を４℃に於て
約１時間攪拌して保護基を分離し、ポリペプチドを樹脂
から除去した。 温度４℃に於て、Ｎ２流で弗化水素を蒸発させた後、残
留物を無水ジエチルエーテルで３回抽出してアニソール
を除去し、残留物を真空乾燥した。 真空乾燥物を５％酢酸水溶液（５０ｍｊ！ ３回）で抽
出して遊離ポリペプチドを樹脂から分離した。 抽出物含有溶液を凍結乾燥してモノマー未酸化ボ゛リベ
ブチドを提供した。 裏施侃叉： オニ」３≧コシ１遣 本発明の合成オリゴマーは、１つのポリペプチドのカル
ボキシ末端残基と第２のポリペプチドのカルボキシル末
端残基との間のアミド結合によって一緒に端一端（頭−
尾）結合される複数の本発明のポリペプチドの固相合成
によって製造することができる。かかる合成オリゴマー
は好ましくは単一の長いポリペプチドオリゴマーとして
合成されるが、個々のポリペプチドとして合成し、これ
らをその個々の合成の後で、１−（３−ジメチルアミノ
プロピル）−３−エチルーカルポジイミド塩酸塩水溶液
のようなカルボジイミド反応剤を用いて一緒に結合させ
ることができる。単一ポリペプチド鎖として製造された
オリゴマー中に含まれるアミノ酸残基の全数は、約６個
までの本発明のポリペプチドが単一のポリペプチドとし
て合成される単一の頭−尾オリゴマー鎖に結合され得る
ように、好ましくは約４０未満である。より好ましくは
合成類−尾オリゴマーは結合した本発明の合成ポリペプ
チド２−約４ブロツクおよび全部で約４０未満のアミノ
酸残基を含む。 大立拠ユニ ヱ茎ヱニ免製遺 本発明のポリペプチドポリマー（合成マルチマー）は、
実施例Ａ記載のようにして、かつアミノ末端とカルボキ
シ末端の両方にシスティン残基を含む本発明のポリペプ
チドを合成して未酸化、還元形の“ジＣｙｓ末端”ポリ
ペプチドを生成することによって製造することができる
。合成後、典型的な実験室製造では、１０ｍｇのジＣｙ
ｓポリペプチド（未酸化形でシスティン残基を含む）を
２５０ｍ１の０．１モル（Ｍ）炭酸アンモニウム緩衝液
に溶解する。この溶解したジＣｙｓ末端ポリペプチドを
、次に、得られた溶液を包囲常温で空気中で約１８時間
おだやかに攪拌することにより、あるいはエルマン（Ｅ
ｌｌｍａｎ）試験〔エルマン（ＥＩＬｍａｎ）。 Ａｒｃｈ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｂｉｏ ｈ ｓ、＋
８２、Ｔｏ−７７（１９５９）。〕で遊離メルカプタン
が検出されなくなるまで空気酸化する。 かくして製造されたポリマーは酸化システィン（シスチ
ン）残基によって一緒に結合された合成ポリペプチド反
復単位を複数個含む。かかるポリマーは、典型的に、頭
−尾方式ならびに頭−頭および尾−尾方式で一緒に結合
したポリペプチド反復単位を含む。すなわち２個のポリ
ペプチド反復単位のアミノ末端は、両ポリペプチド末端
に於ける結合基は等しいので、２個のカルボキシル末端
ができるように単一ジスチン残基によって一緒に結合さ
れることができる。 ！ＪｉｌＪｕ ＝ 旦 へのカップリング合成ポリペ
プチドを、リウ（Ｌｉｕ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、エエ
、６９０ （１９７９）に記載されている方法によっ
て免疫原性担体としてのスカシガイのヘモシアニン（Ｋ
ｅｙｈｏｌｅ Ｌｉｍｐｅｔ Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ（
ＫＬＨ）：ｌにカップリングさせた。要するに、４ｍｇ
の担体を０．５１ｍｇのＴｎ−マレイミドベンゾイル−
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルで活性化し、次
に５ｍｇのポリペプチドとアミノ末端システィンまたは
カルボキシ末端システィンによって反応させて約ｌ〇−
約３５重量％のポリペプチドを含む結合物を提供した。 実施例５： 抗ＥＡ−Ｄ抗体のＥＬＩＳＡ検定種々のＥ
ＢＶ関連臨床症状を有する患者からの血清試料を、下記
のＥＬ Ｉ ＳＡを用いて抗ＥＡ−Ｄ抗体の存在につい
て検定した。被検血清は、臨床的特徴と羊赤血球凝集陽
性（すなわちヘテロフィル）とに基づいて急性伝染性単
核症（ＩＭ、）をもつと診断された患者からのものであ
った。ＩＭ診断を確かめるために、これらの患者からの
回復期血清を抗ＥＢＮＡ−１抗体および抗ＶＣＡ（ＶＣ
Ａ ’）抗体について試験し、これらの抗体を含むこと
を発見した。 異姓性ＶＣＡおよびＥＢＮＡ−１抗原に対して指向され
る抗体が陰性である健康な個人から正常成人血清を得た
。ＶＣＡ陰性（ＶＣＡ−）と呼ぶこの群は多分−次ＥＢ
Ｖ感染を受けていない。健常供給者の第２群は陽性抗Ｖ
ＣＡおよび抗ＥＢＮＡ −１抗体力価をもっていた。こ
の第２対照群はＶＣ＾陽性（ＶＣＡ”）と呼ばれ、多分
以前にＥＢＡ暴露を受けている。 増加した回復期抗ＣＭＶ抗体力価によって決定される急
性サイトメガロウィルス（ｃＭＶ）感染を有する患者か
らの血清も試験した。ショーグレン症候群（Ｓ Ｓ）を
有する患者から試験した血清は乾性角結膜炎、口内乾燥
症、陽性小咄液腺生検（スケールＩ−Ｉ’／で等級■）
、ならびに抗核抗原およびリウマトイド因子を含む上昇
した自己抗体力価を有していた。リウマトイド関節炎（
ＲＡ）を有するが関連したＳＳ症状が無い患者の血清も
評価した。 合成ポリペプチドを、マトリックスとしてミクロタイタ
ープレートウェル（ｍｔｃｒｏｔｉｔｅｒ ｐｌａｔｅ
ｗｅｌｌ） （イムノロン（Ｉｎ＋ｎ＋ｕｎｏｌｏｎ
） Ｉｆ ；ダイナチクラボラトリーズ社（Ｄｙｎａ
ｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、 Ｉｎｃ、。 Ａｌｅｘａｎｄｒｉａ、 ＶＡ） ）の壁に、各ウェル
に１０μｇ／ｍｌのポリペプチドを含む硼酸塩緩衝食塩
水（ＢＢＳ ； ２００ｍＭ硼酸ナトリウム、１６０ｍ
Ｍ ＮａＣ１，ｐｔ（８，０）０．０５０ｓｆｆｉを混
合することによって結合させた。この混合物を４℃に於
て約１６時間保持した。プレートを転倒して振ることに
よって未結合ポリペプチドをウェルから分離した。残留
非特異結合部位を、次に、０．２００ｍ１の封鎖用溶液
〔１０％の正常ヤギ血清（ＮＧＳ）を含むＰＢＳ （１
０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｊ！
、ｐＨ７，３））を各ウェル中で混合することによって
封鎖した。かくして生成した混合物を吸湿チャンバー内
で３７℃に約９０分間保持した。次に、封鎖用溶液を、
ウェルを転倒して振ることによってウェルから除去し、
かくして生成した固体支持体を空気中で３７℃に於て約
１時間乾燥させた。 ポリペプチド被覆ウェル（固体支持体）のおのおのに封
鎖用溶液でｌ：２０に希釈した０、 ２００■ｌの血清
を混合して固−液相免疫反応混合物を形成させた。この
混合物を２５℃に於て約１時間保持した。次に、０．０
５％のトゥイーン（ＴｗＩｅｅｎ）２０ 〔ポリオキシ
エチレン（３０）ソルビタンモノラウレート〕 〔シグ
マ（Ｓｉｇｍａ） ）を含むＢＢＳで３回洗浄すること
によって未結合物をウェルから分離した。 生成した固相結合免疫反応体の量を、１０％ＮＧＳを含
むＢＢＳで１：１０００に希釈したワサビ大根ペルオキ
シダーゼ（ＨＲＰ）に結合したヒト免疫グロブリンクラ
ス特異性抗体０．２００１１１１を混合して第２固−液
相混合物を形成することによって測定した。ＩｇＧ抗体
およびＩｇＭ抗体を検出するため、ＨＲＰ結合マウス抗
ヒトＩｇＧおよびマウス抗ヒトＩｇＭモノクローン抗体
Ｃそれぞれオルトディアグノスティックス社（Ｏｒｔｈ
。 Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ＋ Ｒａｒｉｔａｎ、 ＮＪ）
）を用いた。ＩｇＡ抗体を検出するためには、ＨＲＰ
結合ヤギ抗ヒトＩｇＡ（キレガードアンドベリー社（Ｋ
ｉｒｅｇａａｒｄａｎｄ Ｐｅｒｒｙ、 Ｇａ１ｔｈｅ
ｒｓｂｕｒｙ、 ＭＯ）］を用いた。第２固／液相混合
物を約２５℃に於て約１時間保持した。次に、上記のよ
うにして５回洗浄することによって未結合物を固相結合
サンドインチ（第２）免疫反応体から分離した。 次に、ＨＲＰ標識含有固相結合サンドインチ（第２）免
疫反応体の量を、メーカーの指示に従って新たに調製し
た０、２００ｍ１の０−フェニレンジアミノ（ＯＰＤ、
シグマ）基質溶液を混合することによって検定した。約
２５℃に於て約１５−約３０分間発色させた。次に、０
．０５（１＋１の４Ｎ ＨｔＳＯａを各ウェル中に混
合することによって基質転化反応を停止させた。ダイナ
チクＭＲ６０００（Ｄｙｎａｔｅｃｈ ＭＲ６０００）
（ダイナチクラボラトリーズ社（Ｄｙｎａｔｅｃｈ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、 Ｉｎｃ、）） ミクロ
タイタープレートリーダー（ｓｉｃｒｏｔｉｔｅｒ ｐ
ｌａｔｅｒｅａｄｅｒ）を用いて波長４９０ ｎｍに於
ける混合物の光学密度を測定した。 １Ｍおよび正常血清の抗ＢＡ−Ｄ抗体につい−の結果を
第２図に示しである。固体マトリックスに結合したポリ
ペプチドに７を用いると、正常血清と比べてＩＭ患者の
血清からはＩｇＧＳ ＩｇＡ、ＩｇＭ抗体の明らかに高
い結合が観察された。対照的に、合成ポリペプチドに５
、Ｋ８、Ｋ９は正常血清と比べて１Ｍ血清との増加した
免疫反応性を示さなかった。しかし、幾らかの１Ｍ血清
中にはポリペプチドに６に対する低免疫反応性が存在し
た。 鼻咽頭癌（ＮＰＣ） 、ＥＢＶ関連疾患、ＳＳを有する
患者からの血清も、正常血清と比べてポリペプチドに７
との増加した免疫反応性を示した（第３図）。対照的に
、乾性症状の無いＲＡを有する患者からの血清は明らか
な抗ポリペプチドに７活性を示さなかった。 上記ＥＬ Ｉ ＳＡを用いて時間経過研究も行った。 ４人のＩＭ患者から、患者がＩＭ痛症状かかっている期
間中に得た一連の試料を、ポリペプチドに７およびロー
デス（Ｒｈｏｄｅｓ）ら、Ｊ、 Ｉｓｖ＋ｕｎｏ１．＋
１３４．２１１−１６ （１９８５）のポリペプチドを
それぞれ固体マトリックスに結合させて用い、抗に７抗
体および抗ＥＢＮＡ−１抗体の存在について試験した。 第４図に示したこれらの結果は、抗ＥＡ−Ｄポリペプチ
ド抗体がＥＢＶ感染の開始時に於て抗ＥＢＮＡ−１抗体
よりも高いレベルで生じることを示す。 かくして、本発明の検定方法はＥＢＶ関連疾患を有する
血清患者中に於ける本発明のポリペプチドに免疫学的に
結合する抗体を検出することができる。これらのポリペ
プチド反応性抗体はＥＢＶ感染の結果としてＥＡ−Ｄ蛋
白質の対応する部分によって誘導されと考えられる。 去隻拠亙： ±ユニプ±工濃度 ミクロタイタープレートウェル壁を被覆して固体支持体
を生成させる。ために用いられるポリペプチド含有溶液
の濃度を変える影響を試験した。 ＢＢＳ中に０．１．１．０．１０．１（１０）μｇ／ａ
ｌｌのポリペプチドに７を含む溶液を用いて実施例５記
載のようにウェル壁ヘポリベプチドを結合させた。正常
個人（ＶＣＡ＋およびＶＣＡ−）およびＩＭ患者からの
血清を用い、実施例５に従って抗ＥＡ−ＤＩｇＭ抗体を
検出するためＥＬＩＳＡを行った。血清はすべて１：２
０希釈で用いた。この研究の結果は第５Ａ図に示しであ
る。これらの結果は、試験したポリペプチド濃度の範囲
にわたって各被検血清中で検出された抗ＥＡ−ＤＩｇＭ
抗体の量はほとんど変化しないことを示している。 かくして、０．１μｇ／ｍｌポリペプチドのような低い
濃度のポリペプチド溶液を用いて本発明のポリペプチド
をミクロタイタープレートウェルの内壁へ結合させて固
体支持体を形成することができる。 叉施班工＝ 試料界ｙ 実施例５のＥＬＩＳＡに於ける被検体液試料の希釈の影
響を試験した。正常個人（ＶＣＡ−およびＶＣＡ” ）
ならびにＩＭ、ＮＰＣ，ＳＳを有する患者からの血清を
前述の封鎖用溶液でｌ：５．１：２０、ｌ：５０、ｔ：
ｉｏｏに希釈し、実施例５記載のように検定した。 この研究の結果は第５Ｂ図に示しである。これらの結果
は、試料の希釈度の増加に伴う感度の減少が約１：２０
の試料希釈で横ばいになり始めることを示している。 実施例８： 抗ＥＡ−Ｄの検出 本発明の検定法の試料中に存在する抗ＥＡ−Ｄ免疫グロ
ブリンのクラスを識別する能力を試験した。このことは
、第１表中に示したポリペプチドのおのおのを実施例５
のＥＬＩ ＳＡに於ける固相結合抗原として用いること
によって達成された。 第１表中のポリペプチドを、血清試料中のＩｇＧ。 ＩｇＭ、ＩｇＡ抗体と免疫反応する能力について検定し
た結果を下記第２表に示す。 第２表 種々のポリペプチドへのＩｇＧ、 ＩｇＭ、 ＩｇＡ抗
体の結合１ペプチド２ 試料に５ Ｋ６ Ｋ７ Ｋ８ Ｋ９ｇＧ ＲｌＳ、’ ０．００６ ０．００２ ０．００２
０．０００ ０．０００２２４１’ ０．００２
０．０２４ ０，２０７ ０．０２５ ０．０１２Ａ
、１１．’ ０．０００ ０．０００ ０．０００
０．０００ ０．００３Ｒ１Ｒ，’ ０．０００
０．００５ ０．００８ ０．００３ ０．０２０口
１Ｍ、’ ０．０００ ０．０１６
０．００４ ０．０００ ０．００８−」ヱ ＲｏＳ、０．０６０ ０．０５７ ０．０５２ ０．０
４１ ０．０４２２２４１ ０．３５７ ０．２９８
０．５４０ ０．５５８ ０．３１４Ａ、Ｗ、０．１
０７ ０．１６７ ０．１０１ ０．１００ ０．０８
ＯＲ０Ｒ，０，１４４０，０８３０，０７００，０８１
０，０４７０、Ｍ、 ０．４０５ ０
．５６６ ０Ｊ３０ ０，３０８ ０．２
９５ユ盈Δ ＲｏＳ、 ０．００２ ０．００９ ０．０００
０．０００ ０．００７２２４１ ０．０１５ ０
．０１８ ０．２９６ ０．０２１ ０．０２１Ａ、Ｗ
、０．０００ ０．０５１ ０．０００ ０．００３
０．００６Ｒ，Ｒ，０，０１８０，０３４０，００ロ
０．００２ ０．０２５Ｄ８Ｍ、 ０．
００７ ０．０２０ ０．０００ ０．０００ ０．０
０３１示した値は４９０ｎｍの光の波長に於けるＢＢＳ
に対する光学密度の単位である。 クポリペプチドに５、Ｋ６、Ｋ７＝ Ｋ８、Ｋ９は第１
表に示したアミノ酸残基配列を有する。 ３臨床的に正常な個人からの血清で、以前にＥＢＶに暴
露されていない（ＶＣＡ−）。 ４臨床的に急性ＥＢＶ感染を有する患者からの血清（Ｉ
Ｍ）。 ｓ前にＥＢＶに暴露された臨床的に正常な個人からの血
清（ＶＣＡＩ。 ６前にＥＢＶに暴露されている（ＶＣＡ” ）が上昇し
た抗ＥＡ ＩｇＭレベルを有する（偽陽性）臨床的に
正常な個人からの血清。 上記の結果は、固体マトリックスに結合（吸着などによ
り）して固体支持体を形成するポリペプチドに７は急性
ＥＢＶ感染を有する患者（＃２２４１）の血清中のＩｇ
Ｇ、ｒｇＭ、ＩｇＡ抗体と免疫反応する能力があること
を示す、さらに、ＥＢＶカプシド抗原に対する抗体を含
む（ＶＣＡ’）２人の臨床的に正常な個人からの血清は
に７と免疫反応せず、またＥＢＶに対する前取ての検出
可能な暴露が無い（ＶＣＡ−）臨床的に正常な個人から
の血清もに７と免疫反応しなかった。 特殊な実施態様および実施例を含む以上の明細書は本発
明の説明のためのものであって、限定と取られるべきで
はない。本発明の真の精神および範囲から逸脱すること
なく数多くの他の種々の変化や変更を行うことが可能で
ある。
Ｄ遺伝子核酸配列〔ベール（Ｂａｅｒ）ほか、ネーチ＋
−（Ｎａｔｕｒｅ）、３１０，２０７（１９８４）に
より公表されたＥＢＶゲノム核酸残基７９８９９〜８１
１１０）から翻訳し、１文字アミノ酸残基路号を用いて
、左から右へ、アミノ末端からカルボキシ末端の方向に
ＥＡ−Ｄタンパク質の完全なアミノ酸残基配列を示す。 この研究に用いたポリペプチドのアミノ酸残基配列の位
置は配列の下の破線により示され、末端残基は末端残基
の直下の「＋」記号により示される。破線は表示に５、
Ｋ６、Ｋ７、Ｋ８およびに９により中断され、それらの
表示がそれらのポリペプチドの参照に利用される。 第２図には、実施例５に記載されるポリペプチドに７を
面相標的とした抗ＥＡ−Ｄ抗体ＢＬＩＳＡを用いた正常
個体（正常）および感染性単核症患者（急性ＩＭ）の血
清中の、それぞれ抗ＥＡ−ＤＩｇＭ、ＩｇＧおよびＩｇ
Ａ抗体に対する検定の結果を示す３つのグラフが含まれ
る。血清試料は急性ＩＭを有する４４患者（実バー）お
よびＥＢＶに対する先行暴露を有しない４０個体を含む
１９４健康正常個体（白抜きバー）から得た。検定中に
各試料により生じた４９０ナノメートル（ｎｍ）におけ
る光学濃度（ＯＤ４９０）は最も近い１７１０単位に丸
められ、各グラフの横軸であある。各バーは示した０Ｄ
４９０を生じた試料の数を表わす。 パネルＡのデータはポリペプチドに７により模擬された
Ｅ Ａ−Ｄエピトープに免疫結合する（免疫反応体形成
）ＩｇＭ抗体の頻度が正常個体中より急性ＩＭ患者中で
大きいことを示す。パネルＢおよびＣのデータはそれぞ
れＩｇＧおよびＩｇＡ抗体応答に対する同様の結果を示
す。 第３図は鼻咽頭癌（ＮＰＣ）、シエーグレン症候群（Ｓ
Ｓ）、サイトメガロウィルス（ｃＭＶ）感染を有する患
者および正常提供者の血清を検定するために実施例５の
ポリペプチドＫ ７ ＥＬＩＳＡを用いて得られた結果
を示すヒストグラムである。 ポリペプチドに７と免疫反応した各血清試料中の抗ＥＡ
−Ｄ抗体の量は０Ｄ４９０値として示され、ヒストグラ
ム上の点により示される。 第４図には実施例５に記載されるポリペプチドに７を固
相標的とした抗ＥＡ−Ｄ抗体ＥＬ Ｉ ＳＡを用いて抗
ＥＡ−Ｄ抗体について急性ＩＭを有する４患者の一連の
血清試料を検定した結果を示す２つのグラフパネルが含
まれる。各患者の血清のデータは異なる記号により表わ
され、同一記号は各グラフパネル中の同一患者に使用さ
れる。パネルＡのデータは抗ＥＡ−ＤＩｇＭ抗体を、症
候発症の１週後のＩＭ患者中に検出できることを示す。 パネルＢのデータはロウズ（Ｒｈｏｄｅｓ）ほか、ジャ
ーナル・オブ・イムノロジー（Ｊ、 Ｉｍｍｕｎｏｌ、
） 、１３４．２１１ （１９８５）に記載された抗
ＥＢＮＡ−ＩＥＬ Ｉ ＳＡを用いた血清試料中の抗Ｅ
ＢＮＡ−１抗体の増加の検出による同一患者中のｒＭ診
断の確認の例示である。 第５図には固相標識としてに７を用いた抗ＥＡ−Ｄ
ＩｇＭ抗体ＥＬＩＳＡで得られた結果に対する血清希釈
およびポリペプチド濃度の影響を示す２つのグラフパネ
ルが含まれる。 パネルＡのデータはＩＭ患者（ＩＭ）並びに血清がＥＢ
Ｖカプシドタンパク質抗原に対する抗体を含まなかった
正常個体（ＶＣＡＩおよび血清がこれらの抗原に対する
抗体を有した患者（ＶＣＡＩのそれぞれの血清試料料中
の抗ＥＡ−Ｄ ＩｇＭ抗体を検定する抗ＥＡ−Ｄ抗体
ＥＬ■ＳＡの能力に対するミクロタイタープレートウェ
ルに付着したに７ポリベブチドの量を変える影響を示す
。ミクロタイタープレートウェルは実施例５に記載する
ようにポリペプチドに７でコートしたが、ウェル壁に対
するに７の付着に用いたポリペプチドに７含有溶液の濃
度はミクログラム毎ミリリットル（μｇ／…ｌ）で示し
たように変動させた。試験した血清はすべて用いる前に
１：２０に希釈した。 パネルＢのデータは合成ポリペプチドに７と免疫反応す
るヒトＩｇＭ抗体の検出に対する血清希釈の影響を示す
、ミクロタイタープレートウェル壁は実施例５に記載さ
れるように１０μｇ／ｍβ溶液を用いてに７でコートし
た。ＩＭ、ＮＰＣおよびＳＳを有する患者、並びにＶＣ
Ａ−およびＶＣＡ”正常固体の血清を次に抗Ｅ Ａ −
Ｄ ＥＬＩＳＡで、示した希釈で検定した。 発明の詳細な説明 Ａ、定義 「抗体」という語は抗原と特異的に結合できる免疫グロ
ブリンと称される１群のグリコジル化タンパク質の一員
である分子を示す。 「抗体結合部位」は抗原を特異的に結合する重鎮および
軽鎖可変領域からなる抗体分子の構造部分である。 「抗原」という語は歴史的に抗体により結合されるエン
テイテイーを示すため、また抗体の生成を誘発するエン
テイテイーを示すために用いられた。より最近の用法は
抗原の意味を抗体により結合されるエンテイテイーに制
限し、「免疫原」という語が抗体生成を誘発するエンテ
イテイーに対して使用される。ここに論議するエンテイ
テイーは免疫原および抗原の両方である場合に一般に抗
原と称される。 「抗原決定基」は抗体結合部位により免疫結合される抗
原の真の構造部分を示す。その語はまた「エピトープ」
と同義に使用される。 「抗原関連変異体」という語はここに、少くとも１つの
抗原決定基の一部を共有し、従って免疫的に交差反応性
である全体のアミノ酸残基配列の異なるポリペプチドを
示すために使用される。すなわち、抗原関連変異体のポ
リペプチド配列が異なるが、しかし各変異体に対して生
成された抗体は他と免疫反応する。 「生物活性」という語は、少くとも受容体の適当なりガ
ントを少くとも特異的に結合する能力を示すが、しかし
他の一般またはエフェクター能力もまた存在することが
できる。 用いた「複合体」という語は、特異的結合因子が標的リ
ガンドに結合したときに形成される生成物を示す。典型
的な複合体は免疫反応体、抗体に結合したプロティンＡ
など、である。 用いた「保存的置換」という語は、１アミノ酸残基が他
の生物学的に類似の残基により置換されたことを示す。 保存的置換基の例には１つの疎水性残基例えばイソロイ
シン、バリン、ロイシンまたはメチオニンを他に代える
置換、あるいは１つの極性残基を他に代える、例えばア
ルギニンとリシンとの間、グルタミン酸とアスパラギン
酸との間、またはグルタミンとアスパラギンとの間など
の置換、が含まれる。「保存的置換」という語にはまた
、ポリペプチドに対して生じた抗体もまた非置換アミノ
酸を有する相当するポリペプチドと免疫反応すれば非置
換親アミノ酸の代りに置換アミノ酸を用いることが含ま
れる。 ペプチド配列に関して用いた種々の文法形態における「
相当する」という語は、アミノ末端およびカルボキシ末
端のいずれかまたは両方で３個までのアミノ酸残基を加
えまたは減じた、ボリペブ、チド配列に沿って特定アミ
ノ酸残基中に保存的置換のみを含むペプチドを意味する
。 ｒＥＬＩｓＡＪは固相に結合した抗体または抗原並びに
酵素−抗原または酵素−抗体結合体を用いて試料中に存
在する抗原または抗体の量を検定し定量する酵素結合抗
体免疫吸着検定を示す。 ＥＬＩＳＡ法の説明はランデ・メディカル・パブリケー
シッンズ（Ｌａｎｇｅ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｐｕｂｌｉｃ
ａｔｉｏｎｓ。 Ｌｏｓ Ａｌｔｏｓ ｓ ＣＡ ）により１９８２年に
発行されたサイテス（Ｄ、Ｐ、 ５ｉｔｅｓ ）ほかに
よる「基礎および臨床免疫学（Ｂａｓｉｃ ａｎｄ Ｃ
１１ｎｉｃａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）、４版、２２
章、米国特許第３．６５４．０９０号、第３、８５０．
７５２号および第４，０１６，０４３号中に見出され、
それらはすべてここに参照される。 「酵素」は、しばしば特異的である基質中の若干の変化
を触媒作用により促進するかまたは生成することができ
るタンパク質を示す。 「エピトープ」は抗体結合部位により特異的に結合され
て免疫反応体を形成する分子の部分を示す。それはまた
決定基または抗原決定基として示される。 「免疫学的に模擬する」という語は、本発明のポリペプ
チドが、１）自生タンパク質により誘発された抗体によ
り免疫結合されることができ、２）誘発ポリペプチドお
よび自生タンパク質に結合する抗体の生成を誘発できる
ことを意味するために使用される。 種々の形態における「免疫反応する」という語はリガン
ドとしての抗原と、受容体としての抗体結合部位を含む
分子例えば全抗体またはその一部との間の結合を意味す
る。 用いた「免疫反応体」という語は免疫反応の生成物、す
なわちリガンドが受容体分子により免疫結合されるとき
に生ずるエンテイテイーを示す。 「標識手段」、「指示基」または「標識」は同義に使用
され、免疫反応体の存在を示す検出可能なシグナルの生
成に直接または間接に含まれる単個原子または分子が含
まれる。任意の標識手段を受容体に結合または取込ませ
、あるいは個々に使用することができ、それらの原子ま
たは分子は単独または他の試薬とともに使用できる。そ
のような指示基または標識自体は免疫化学においてよく
知られ、それらは他の新規受容体、方法および（または
）系で使用される限り本発明の一部を構成する。 「リガンド」は特異的受容体により結合される構造部分
を含む分子を示す。 「ペプチド」および「ポリペプチド」という語は、ペプ
チド結合により互いに結合した既知配列のアミノ酸残基
と同義に使用される。 用いた「薬学的に許容できる塩」という語は製薬工業に
使用される非毒性アルカリ金属、アルカリ土類金属およ
びアンモニウム塩を示し、よ（知られた方法により製造
されるナトリウム、カリウム、リチウム、カルシウム、
マグネシウムおよびアンモニウム塩などが含まれる。そ
の語にはまた、本発明の化合物と適当な有機または無機
酸との反応により一般に製造される非毒性酸付加塩が含
まれる０代表的な塩には塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩
、硫酸水素塩、酢酸塩、シュウ酸塩、吉草酸塩、オレイ
ン酸塩、ラウリン酸塩、ボラート（ｖｏｒａｔｅ ）、
安息香酸塩、乳酸塩、リン酸塩、トシラート、クエン酸
塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、コハク酸塩、酒石酸塩
などが含まれる。 「受容体」という語は抗原に（または抗原と）免疫結合
する抗体結合部位からなる生物活性分子を示すために使
用される。そのような結合は典型的には約１０’〜約１
０１０リツトル毎分子の親和性で生じ、抗原のエピトー
プと受容体の抗体結合部位との特異的相互作用である。 受容体分子の生物活性は、免疫反応体を形成する水性媒
体中の混合物で少くとも生理学的１）Ｈ値およびイオン
強度における受容体とその抗原リガンドとの免疫反応に
より立証される。好ましくは、生物活性は生物検定条件
下に生ずる、すなわち、その条件で、本発明の受容体は
約５〜約９のｐＨ値範囲内で、例えば蒸留水ないし約１
モルの塩化“ナトリウムのイオン強度で抗原リガンドに
結合する。 受容体は抗原に特異的に結合できる抗体結合部位からな
る。受容体には抗体のＦａｂ、 Ｆａｂ’、Ｆ （ａｂ
’ ）ｚおよびＦ （Ｖ）ポリペプチド部分、並びに
抗体および実質的な全抗体が含まれる。抗体のＦａｂお
よびＦ（ａｂ’）ｇ部分はよく知られ、よく知られた方
法による実質上無傷の抗体の、それぞれパパインおよび
ペプシンのタンパク質分解反応により製造される、例え
ばセオフロボラウスほか（Ｔｈｅｏｆｉｌｏｐｏｌｏｕ
ｓ ａｎｄ Ｄｉｘｏｎ ）に対する米国特許第４，３
４２，５６６号参照。Ｆａｂ’抗体タンパク質もまたよ
く知られ、Ｆ（ａｂ’）、部分から、次に２重鎮タンパ
ク質を結合するジスルフィド結合の例えばメルカプトエ
タノールにより還元し、次いで生じたタンパク質メルカ
プタンを試薬例えばヨードアセトアミドによりアルキル
化することにより生成される。無傷完全抗体が好ましく
、本発明の単クローン性または他の受容体分子の例とし
て利用される。 「分泌する」および「生成する」という語はしばしば抗
体分子が得られる細胞に関して同義に使用される。しか
し、抗体を生ずる細胞はその環境中へそれらの分子を分
泌しない、関心のハイブリドーマ細胞はそれらの環境中
へ単クローン性抗体を分泌する。しかし、そのような細
胞はしばしば「抗体生成」細胞として示され、それらの
抗体は技術的に利用される語に従って「生成された」と
示される。 用いた「合成」という語はポリペプチド分子またはポリ
ペプチド反復単位が、生物手段により例えば遺伝子工業
技術により製造されるよりむしろ化学的手段すなわち化
学合成により作られたことを意味する。従って、本発明
の態様である合成ポリペプチドは天然存在タンパク質お
よびそのフラグメントを含まない。 Ｂ１合成ポリペプチド 本発明の合成ポリペプチドは、第１図およびベール（Ｂ
ａｅｒ ）ほか、ネーチ＋ −（Ｎａｔｕｒｅ ）、３
１０．２０７ （１９８４）のゲノム配列に帰属される
位置を用いてそのアミノ末端からおよそ位置３５０〜お
よそ位置３６２（７）ＥＢＶ ＥＡ−Ｄタンパク質の
アミノ酸残基配列に相当するアミノ酸残基配列を有する
約６〜約４０個のアミノ酸残基、より好ましくは約１０
〜約２４個の残基から実質的になる。該合成ポリペプチ
ドはＥＡ−Ｄにより誘発された抗体を免疫結合する能力
を有する。 好ましい実施において、ポリペプチドは、結合体として
免疫担体例えばキーホールリンペットヘモシアニン（Ｋ
Ｌ Ｈ）に結合させ、水性希釈剤中で有効量を宿主哺
乳動物例えばラット、マウス、ラビットまたはモルモッ
ト中へ導入すると結合体のポリペプチドと免疫反応する
だけでなく、また変性状態におけるＥＡ−Ｄと免疫反応
する抗体の分泌を誘発できる。より好ましくは、それら
の誘発された抗体は自生状態におけるＥＡ−Ｄと免疫反
応する。従って、好ましい態様において本発明のポリペ
プチドは自生ＥＡ−Ｄタンパク質の免疫原および抗原の
決定基を免疫学的に模擬することができる。 自生状態における典型的なＥＡ−Ｄは体液例えば急性Ｉ
Ｍの患者の血漿中に認められるタンパク質である。変性
状態における典型的なＥＡ−Ｄは、５Ｏ３−ＰＡＧＥお
よびウェスタンプロット分析に使用されるような２−メ
ルカプトエタノールで還元した後のタンパク質である。 好ましいアミノ酸残基配列には左から右へ、アミノ末端
からカルボキシ末端の方向にとって、式％式％ により表わされる配列、その薬学的に許容できる塩、お
よびその抗原関連変異体が含まれる。 アミノ酸残基配列の初めまたは末端におけるダッシュは
それぞれアミノ末端およびカルボキシ末端における基例
えばＨおよびＯＨ，あるいは、さらにポリペプチド鎖中
の合計４０個までのアミノ酸残基の１つまたはそれ以上
のアミノ酸残基の配列に対する結合を示すことが示さら
れる。 さらに、アミノ末端からおよそ位置３５０〜およそ位置
３６２のＥＡ−Ｄタンパク質のアミノ酸残基配列に相当
する少くとも６個のアミノ酸残基配列に加えて、ポリペ
プチド中に存在できるアミノ酸残基の配列が、ＥＡ−Ｄ
により誘発された抗体に対する免疫結合におけるポリペ
プチドの実質的特性が実質的に損なわれなければ無関係
であることができることが示さられる。より好ましくは
、ポリペプチドおよび前記の少くとも変性されたＥＡ−
Ｄと免疫反応する抗体の誘発における特有免疫原性もま
た実質的に損なわれない。 最も好ましくは、ポリペプチドはＥＡ−Ｄタンパク賞分
子の前記位置に等しい１つまたはそれ以上のアミノ酸残
基配列から実質的になる。前記ＥＡ−Ｄの配列に等しい
複数のアミノ酸残基配列を含む最も好ましいポリペプチ
ドはここに「ポリペプチドオリゴマー」として示される
群内にあり、以下に論議される。 殊に好ましいポリペプチドは左から右へ、アミノ末端か
らカルボキシ末端の方向にとって、式、Ｈ−ＰＡＲＰＥ
ＴＰＳＰＡ Ｉ ＰＳ−ＯＨにより表わされる配列、そ
の薬学的に許容できる塩およびその抗原関連変異体に相
当するアミノ酸配列を有する。 第１図を参照することにより知見できるように、前記ポ
リペプチドはベール（Ｂａｅｒ ）ほかのゲノム配列を
基にしたＥＡ−Ｄの位置３５０〜３６２の配列に等しい
アミノ酸残基配列を有する。 本発明のポリペプチドはポリペプチド当業者に知られて
いる任意の技術により合成することができる。そのよう
に利用できる多くの技術の優れた概要はスチュワードほ
か（Ｊ、Ｍ、 Ｓｔｅｗａｒｄ ａｎｄＪ、Ｄ、 Ｙｏ
ｕｎｇ ）、「固相ペプチド合成（５ｏｌｉｄ Ｐｈａ
ｓｅＰｅｐｔｉｄｅ ５ｙｎｔｈｅｓｉｓ ）Ｊ 、Ｗ
、Ｌフリーマン社（Ｗ、）１． Ｆｒｅｅ、ｓ＋ａｎ
Ｃｏ、、 Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ ） 、
１９６９ ；固相ペプチド合成に対するマインホーフェ
ル（Ｍｅｉｎｈｏｆｅｒ ）、「ホルモンタンパク賞お
よびペプチド（Ｈｏｒｍｏｎａｌ Ｐｒｏｔｅ’ｉｎｓ
ａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ ） Ｊ、２巻、４６頁、
アカデミツク・プレス（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓＸ
Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ ）、１９７３；および古典的溶液合
成に対するシェローダーはか（Ｆ！、 ５ｃｈｒｏｄｅ
ｒａｎｄ Ｋ、 Ｋｕｂｋｅ ） 、ｒペプチド（Ｔｈ
ｅ Ｐｅｐｔｆｄｅｓ ）、１巻、アカデミツク・プレ
ス（八ｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎ６ｗ Ｙｏｒｋ
）、１９６５、に見出すことができる。 一般に、これらの方法は１つまたはそれ以上のアミノ酸
または適当に保護したアミノ酸の成長ペプチド鎖に対す
る逐次的付加を含む０通常、第１アミノ酸残基のアミノ
基またはカルボキシ基は適当な選択的に除去できる保護
基により保護される。 異なる選択的に除去できる保護基が反応性側基を含むア
ミノ酸例えばりシンに利用される。 例として固相合成を用いると、保護または誘導体化した
アミノ酸をその非保護カルボキシルまたはアミノ基によ
り不活性固体支持体に結合させる。 アミノまたはカルボキシル基の保護基を次に選択的に除
去し、適当に保護された相補性（アミノまたはカルボキ
シル）基を配列中に有する次のアミノ酸を混合し、既に
固体支持体に結合した残基とアミド結合の形成に適する
条件下に反応させる。 次いでアミノ基またはカルボキシル基の保護基をこの新
たに加えたアミノ酸残基から除去し、次いで同様に次の
アミノ酸（適当に保護された）を付加させる。所望のア
ミノ酸をすべて適当な配列に結合させた後、残存端およ
び側基保護基（並びに固体支持体）を逐次または同時に
除去すると最終ポリペプチドが得られる。 確認された全アミノ酸残基は天然のし配置にある。標準
ポリペプチド命名法〔ジャーナル・オブ・バイオロジカ
ル・ケミストリー、２４３．３５５７〜５９（１９６９
））に従って、アミノ酸残基に対する略号は次の対応表
に示されるとおりである。 対応表 Ｙ Ｔｙｒ Ｌ−チロシンＧ Ｇ
ｌｙ Ｌ−グリシンＦ Ｐｈｅ
Ｌ−フェニルアラニンＭ Ｍｅｔ Ｌ
−メチオニンＡ Ａｌａ Ｌ−アラニン
Ｓ Ｓｅｒ Ｌ−セリンＩ １
１ｅ Ｌ−インロイシンＬ Ｌｅｕ
Ｌ−ロイシンＴＴｈｒＬ−）レオニン Ｖ Ｖａｌ Ｌ−バリン Ｐ Ｐｒｏ Ｌ−プロリンＫ Ｌ
ｙＳ Ｌ−リシン ＨＨｉｓ Ｌ−ヒスチ゛ジン Ｑ Ｇｌｎ Ｌ−グルタミンＥ
Ｇｌｕ Ｌ−グルタミン酸Ｚ ｃ
ｉｘ Ｌ−グルタミン酸または Ｌ−グルタミン ＷＴｒｐＬ−）リブトファン ＲＡｒｇ Ｌ−アルギニン Ｄ Ａｓｐ Ｌ−アスパラギン酸Ｎ
Ａｓｎ Ｌ−アスパラギンＢ Ａ
ｓｘ Ｌ−アスパラギン酸または Ｌ−アスパラギン ＣＣｙｓ Ｌ−システィン Ｃ，ポリペプチド重合体 本発明はまた、少くとも２つの反復単位が前記本発明の
ポリペプチドである複数の結合した合成ポリペプチド反
復単位を含む合成ポリペプチドオリゴマーを意図する。 そのようなオリゴマーは合計約１２〜約４０個のアミノ
酸残基、より好ましくは約２５〜約４０個の残基を含む
０個々の反復単位は、２つのポリペプチド反復単位が存
在する場合に長さで約６〜約３４残基であることができ
る。前記のように、より好ましくはすべての反復単位が
本発明のポリペプチドであるだけでな（、またアミノ酸
残基配列がＥＡ−Ｄの配列に等しいポリペプチドである
。 本発明のポリペプチドオリゴマーはまたＥＡ−Ｄにより
誘発された抗体に免疫結合する能力を有することに特徴
がある。より好ましくはポリペプチドオリゴマーは、さ
らに免疫原担体例えばｉＨに結合させ、水性希釈組成物
で前記宿主哺乳動物中へ導入するとＥＡ−Ｄに免疫結合
する抗体の分泌を誘発する能力を有することに特徴があ
る。 殊に好ましいポリペプチドオリゴマーは、複数の、左か
ら右へ、アミノ末端からカルボキシ末端の方向に、式、 −ＰＡＲＰＥＴＰＳＰＡＩＰＳ − により表わされるアミノ酸残基配列を有する本発明の殊
に好ましい合成ポリペプチドを含む。 対応表の３文字略号を用いると、上記ポリペプチドはま
た式、 −ＰｒｏＡｌａＡｒｇＰｒｏＧｌｕＴｈｒＰｒｏＳｅｒ
ＰｒｏＡｌａｌｌｅｐｒｏＳｅｒ −により表わすこと
ができる。 従って、本発明のオリゴマーポリペプチドはそれらの成
分ポリペプチドと同様に、ヒト抗ＥＡ−Ｄ抗体に対して
抗原性であり、前記のように、より好ましくは免疫原性
である。従って、それらのオリゴマーポリペプチドは後
記診断法および系に有用である抗ＥＡ−Ｄ抗体の生成の
誘発に使用することができ、また適当な診断法および系
中に抗原として使用することができる。 全オリゴマーポリペプチド中に約３５個より少いアミノ
酸残基を含むオリゴマーは、典型的には免疫原として使
用するために免疫原担体例えばＫＬＨに結合させる。合
計約３５個以上のアミノ酸残基を含むオリゴマーポリペ
プチドは典型的には担体なく使用するのに十分な免疫原
性である。 オリゴマーポリペプチドは前記固相法を用いて頭−尾の
ように合成ポリペプチド単量体を互いに結合させること
により製造することができ、すなわち、１つの完全なポ
リペプチド配列を樹脂上に、次いで１つまたはそれ以上
の同一または異なるポリペプチド配列を合成し、その後
全オリゴマー単位を樹脂から開裂してここに記載したよ
うに用いる。そのような頭−尾ポリベブチド多量体は、
好ましくは約２〜約５個のポリペプチド反復単位を含む
。 あるいは、ポリペプチドオリゴマーを次に詳細に記載す
るように単量体、すなわち反復単位、として用いた合成
ポリペプチドの重合体として製造することができる。そ
のような目的に対する典型的な連鎖停止剤は２−メルカ
プトエタノール、チオグリコール酸およびチオプロピオ
ン酸である。 Ｄ、ポリペプチド重合体 用いた「ポリペプチド重合体」という語は種々の文法形
態で複数の本発明の合成ポリペプチドを反復単位として
含む分子として示される。それらのポリペプチド反復単
位はポリペプチド結合以外により互いに結合され、その
重合体は約１００個以上のアミノ酸残基を含む、従って
、本発明の重合体は、水性組成物中に約５〜約９のｐＨ
値で、好ましくは約６．５〜約７．５のｐＨで分散性で
あれば、約１０．０００またはそれ以上の見掛は分子質
量、Ｍｒｓを存する。ポリペプチド反復単位は同一かま
たは異なることができ、重合体中に存在する他のポリペ
プチドがＥＡ−Ｄにより誘発された抗体と重合体との免
疫反応を実質的に妨害または異なるような抑制をしない
、すなわち重合体の抗原性を妨害しない限り、本発明の
アミノ残基配列以外の１つまたはそれ以上の他の配列を
含むことができる。重合体中の本発明のポリペプチド以
外のポリペプチドの存在もまた、好ましくは重合体の免
疫原性を実質的に抑制しない。 ポリペプチド重合体（合成多量体）は、典型的には高い
免疫原性および抗原性である利点を有する。さらに、重
合体免疫原を用いるとき典型的には担体を必要としない
。異なるポリペプチド単量体を重合体の製造に用いる場
合には、若干のＥＡ−Ｄ抗原決定基に対する抗体と免疫
反応する能力が得られる。なお他の利点は、接種材料中
に用いるとＥＡ−Ｄの若干の抗原決定基と免疫反応する
抗体を誘発する重合体の能力である。 本発明の典型的な重合体はアミノ末端およびカルボキシ
末端の両方に付加したシスティン残基を含む本発明のポ
リペプチド単量体（ジＣｙｓポリペプチド〉を用いて合
成することができる。ジＣｙｓポリペプチド単量体は酸
化操作を用いる分子内、ポリペプチド間システィンジス
ルフィド結合により互いに結合させ、免疫原性、抗原性
重合体を形成させることができる。そのように製造され
たポリペプチド重合体は複数の、本発明の合成ポリペプ
チドを反復単位として含む。それらの反復単位は前記酸
化されたシスティン（シスチン）残基により互いに結合
される。 担体にポリペプチドを結合させる目的、またはポリペプ
チド重合体の製造に対する本発明のポリペプチド中の１
つまたは２つの末端Ｃｙｓ残基の存在は本発明のポリペ
プチドのアミノ酸残基配列を変えるとは解されない。 殊に好ましいポリペプチド重合体は、左から右へ、アミ
ノ末端からカルボキシ末端の方向に、式、−ＰＡＲＰＢ
ＴＰＳＰ＾ＩＰＳ− により表わされるアミノ酸残基配列を有する本発明の殊
に好ましい合成ポリペプチドを複数含む。 従って、本発明の合成多量体ポリペプチドは、それらの
成分ポリペプチドと同様に、ヒト抗ＥＡ−Ｄ抗体に対し
て抗原性であり、前記のように一層好ましい免疫原性で
ある。従って、それらの合成多量体ポリペプチドは、後
に論議する診断法および診断系に有用な抗ＥＡ−Ｄ抗体
の生成の誘発に使用でき、また適当な診断法および診断
系中に抗原として使用できる。 Ｅ、基１隻 もう１つの実施態様に於て、本発明のポリペプチドを薬
剤学的に受容可能な水性希釈剤組成物中で用いて、有効
量で投与するときＥＡ−Ｄと免疫反応する抗体を誘導す
る能力のある接種物を形成する。 種々の文法上の形に於ける“接種物（ｉｎｏｃｕｌｕｍ
）”という用語は、本明細書中ではＥＡ−Ｄに対する抗
体の調製に用いられる活性成分として本発明のポリペプ
チドを含む組成物を記載するために用いられる。ポリペ
プチドを抗体の誘導に用いる場合、ポリペプチドは免疫
原担体に結合させて、あるいは担体なしまたは担体に結
合させたオリゴマーポリペプチドとして、あるいはポリ
ペプチドポリマーとして用いることができるが、表現が
容易なために本明細書中では本発明のポリペプチドの種
々の実施態様を一括的に“ポリペプチド”およびその種
々の文法上の形で呼ぶと理解されるべきである。 約３５個より少ないアミノ酸残基を含むポリペプチドで
は、既述のように抗体産生を誘導するために免疫原担体
を用いることが好ましい。 これまた既述したように、１個以上の追加のアミノ酸残
基を合成ポリペプチドのアミノ末端またはカルボキシ末
端へ付加してポリペプチドの担体への結合を助けること
ができる。合成ポリペプチドのアミノ末端またはカルボ
キシ末端に付加されたシスティン残基はジスルフィド結
合によるポリマーの生成に特に有用であることが見いだ
された。 しかし、結合物調製のための技術上公知の他の方法を用
いることもできる。典型的な付加結合方法はミカエル（
Ｍｉｃｈａｅｌ）付加反応生成物、グルタルアルデヒド
のようなジアルデヒドの使用、クリブスタイン（Ｋｌｉ
ｐｓｔｅｉｎ） ら、Ｊ、 Ｉｎｆｅｃ、 Ｄｉｓ、
＋ １４７−。 ３１８３２６ （１９８３）など、あるいは前に論じた
ように複数のポリペプチドを一緒に結合して合成マルチ
マーを生成させるため、免疫原担体ヘアミド結合を生成
するために水溶性カルボジイミドの使用に於けるような
カルボジイミド技術の使用を含む。 有用な免疫原担体は技術上公知であり、一般に蛋白質自
体である。かかる担体の典型例はスカシガイのヘモシア
ニン（ＫＬＨ）、エデスチン、チログロブリン、牛血清
アルブミン（ＢＳＡ）またはヒト血清アルブミン（ＨＳ
Ａ）のようなアルブミン、羊赤血球（ＳＲＢＣ）のよ
うな赤血球、テナヌストキソイド、コレラトキイソイド
ならびにポリ （Ｄ−リシン：Ｄ−グルタミン酸）のよ
うなポリアミノ酸である。 これまた技術上公知であるように、合成ポリペプチドを
中間結合基によってその担体へ結合させることがしばし
ば便利である。しかし、システィンを用いる場合、中間
結合基は本明細書中で用いたように好ましくはｍ−マレ
イミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（Ｍ
ＢＳ）である。 さらに、リウ（Ｌｉｕ） ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｏ、８
０．６９０（１９７９）によって記載されているように
エステル−アミド交換反応によってＭＢＳを最初に担体
へ付加させることができる。その後で、この付加の次に
アレイミドニ重結合にわたってチオール酢酸（ｃＨ，Ｃ
０８Ｈ）のような封鎖メルカプト基の付加を行うことが
できる。アシル封鎖基の分離後、脱封鎖結合基メルカプ
タンと合成ポリペプチドの付加システィン残基のメルカ
プタンとの間にジスルフィド結合を生成させる。 担体の選択は免疫原の抗原決定基部分よりも免疫原の最
終使用の方により依存してふり、本発明に特別に含まれ
てはいない基準に基づいている。 例えば、特別な非ヒト宿主（受容体）動物に不都合な反
応を生じない担体を選ぶべきである。 本発明の接種物は、本発明のポリペプチドの有効免疫原
量を、オリゴマーポリペプチドとして、あるいは酸化さ
れたポリペプチド末端システィン残基によって一緒に結
合された個々のポリペプチドのポリペプチドポリマーと
して、あるいは担体へ結合された結合物として含む、単
位用量当たりのポリペプチドの有効量は、特に、接種さ
れる動物の種、動物の体重および技術上公知のように選
ばれた接種方法に依存する。接種物は１回の接種（Ｎ）
につき約１０μｇ−約５００μｇのポリペプチド濃度を
含む、ここに挙げたポリペプチド量は、担体を用いる場
合には、担体の重量を含まないポリペプチドの重量を意
味する。特別な典型的接種物は、担体＋ポリペプチド（
結合物）の重量が示される下文に記載される。 “単位用量”という用語は動物に対する１回投与量とし
て適当な物理的に別個の単位を意味し、各単位は所望の
治療効果を生ずるように計算された活性物質の所定量を
、所要な希釈剤、すなわち担体またはビヒクルと共に含
む。本発明の新規単位用量の規格は、本明細書中で詳細
に記載したような、かつこれらが本明細書の特徴である
＋ａｌ活性物質の独特な特性および達成されるべき特別
な免疫学的効果と、（ｂｌかかる活性物質を動物に於け
る免疫学的使用のために配合する技術に固有の制限によ
って指令されかつこれらに直接依存する。 接種物は、典型的には乾燥固体ポリペプチド−結合物、
オリゴマーポリペプチドまたはポリペプチドポリマーか
ら、ポリペプチド−結合物またはポリペプチドポリマー
を、公知のように水、食塩水、燐酸塩緩衝食塩水などの
ような生理学的に許容できる（受容可能な）希釈剤中に
分散させて水性組成物を生成させることによって調製さ
れる。 接種物は希釈剤の部分としてアジュバントをも含むこと
ができる。フロイントの完全アジュバン） （ｃＦＡ）
、フロイントの不完全アジュバント（ＩＦＡ）および
明春のようなアジュバントが技術上公知であり、幾つか
の供給源から市販されている。 Ｆ、上」じ乙と二 本発明のポリペプチドによって誘導される（に対して産
生される）抗体および実質的に全部の抗体ならびにかか
る抗体から調製される抗体結合部位は本発明のさらにも
う１つの実施態様を構成する。これらの分子を本明細書
中では一括的にレセプターと称する。レセプターは、上
で説明した接種物を用いる免疫処置によってマウス、ウ
サギ、ヤギ、モルモット、ウマなどのような哺乳類宿主
中で産生される。 モノクローン形の適当なレセプター、典型的には全抗体
は、ナイマン（Ｎｉｍａｎ） ら、Ｐｒｏｃ、 Ｎａ
ｔｌ。 Ｓｃｉ、 Ｕ、Ｓ、Ａ、 、８０．４９４９−４９５３
（１９８３）によって記載（この記載は参照文として
本明細書に含まれるものとする）されたハイブリドーマ
技術を用いて調製することもできる。要するに、モノク
ローンレセプターがそれから産生されるハイブリドーマ
を生成させるために、骨髄腫または他の自己永続性細胞
系を本発明のポリペプチドで過免疫処置された哺乳動物
の肺臓から得られるリンパ球と融合させる。 骨髄腫細胞系はリンパ球と同じ動物種からのものである
ことが好ましい、典型的には、株１２９ｃｉｘ’のマウ
スが好ましい哺乳動物である０本発明に用いるために適
当なマウス骨髄腫はアメリカンタイプカルチャーコレク
ション（ＡｇｅｒｉｃａｎＴｙｐｅ Ｃｕ１ｔｕｒｅ
Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）、（メリーランド州ロックビル
市）からそれぞれＣＲＬ１５８０およびＣＲＬ１５８１
の名称で入手できるヒポキサンチン−アミノプテリン−
チミジン−感受性（ＨＡＴ）細胞系Ｐ３Ｘ６３−Ａｇ
８．６５３およびＳｐ２１０−Ａｇ１４を含む。 典型的には、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）１５０
０を用いて１Ｉ１１！細胞を骨髄腫細胞と融合させる。 融合したハイブリッドをそのＨＡＴに対する感受性で選
択する０本発明のハイブリドーマ分泌レセプター分子は
本明細書中で説明した酵素結合免疫吸着剤検定（ＥＬ
Ｉ ＳＡ）を用いて同定される。 レセプターとしてのモノクローン抗体はハイブリドーマ
上澄液から得られる必要があるばかりでなく、所望のハ
イブリドーマをその中へ導入しである哺乳動物の腹水か
ら一般により濃厚な形で得ることもできる。腹水を用い
るモノクローン抗体の調製は公知であるので、ここでは
それ以上取り扱わないことにする。 本発明のレセプターはレセプターがそれに対して産生さ
れたポリペプチドへ結合すると共に、本発明のポリペプ
チドが免疫学的に模倣する対応するＥＡ−Ｄ抗原決定部
位にも結合する。かくして、本発明のポリペプチドは免
疫原と抗原との両方であることができる。 本発明のポリペプチドによって誘導され、かつオリゴマ
ーポリペプチドおよびポリペプチドポリマーを含む本発
明のレセプターは、無傷のＥＡ−Ｄによって模倣される
エピトープに比べて比較的少ないエピトープを有する免
疫原（比較的小さいポリペプチド）に対して産生される
ので、天然産多クローン性抗体に比べてオリゴクローン
性テするとして記載することができる。結局、本発明の
レセプターはポリペプチドのエピトープに結合するが、
全ＥＡ−Ｄ分子に対して産生される天然産抗体はＥＡ−
Ｄ分子全体にわたるエピトープに結合し、多クローン性
であると言われる。 本発明の合成ポリペプチドは、血液、血清または血漿の
ような液体試料中の抗ＥＡ−Ｄ抗体の存在および量の検
定のために特にを用である。 １つの実施態様に於て、本発明は下記工程からなる抗Ｅ
Ａ−Ｄ抗体の存在についての体液試料の検定方法を意
図する。 （ａ） 被検定体液試料を提供する工程。典型的には
かかる試料は既知量の血液として、より好ましくは血清
または血漿として提供される。血液、血漿および血清試
料を提供する方法は技術上公知であり、ここではこれ以
上論じない。 （ｂ） Ｅ Ａ −Ｄ蛋白質の約３５０位から約３６
２位までのＥＡ−Ｄ蛋白質のアミノ酸残基配列にほぼ相
当するアミノ酸残基配列を有する本質的に約６−約４０
個のアミノ酸残基からなる合成ポリペプチドであって、
ＥＡ−Ｄによって誘導される抗体によって免疫学的に結
合される能力を有する合成ポリペプチドを提供する工程
。 （ｃ） 該体液試料を該ポリペプチドと混合して免疫
反応混合物を生成する工程。 （ｄｌ 試料中に存在する抗ＥＡ−Ｄ抗体がポリペプ
チドと免疫学的に結合して第１免疫反応体（ｉ ｍｍｕ
ｎｏｒｅａｃ ｔａｎ ｔ）を生成するのに十分な約４
℃−約４５℃の温度に於て約１０分から約１６−２０時
間までのような所定時間生物学的検定条件下で混合物を
保持する工程。 生物学的検定条件とは本発明のポリペプチド分子および
検定しようとする抗ＥＡ−Ｄ抗体の生物活性を保持する
条件であって、約４℃−約４５℃の温度範囲、約５−約
９のｐＨ値範囲および蒸留水から約１モルの塩化ナトリ
ウムまでにわたるイオン強度を含む、かかる条件の最適
化方法は技術上公知である。 （ｅ） 生成された免疫反応体（ｉｍｍｕｎｏｒｅａ
ｃｔａｎｔ）の存在、それによって免疫反応混合物中に
於ける抗ＥＡ−Ｄ抗体の存在を検定する工程。 抗ＥＡ−Ｄ含有免疫反応体の存在の直接または間接的検
定は技術上公知の検定技術で達成される。 例えば米国特許第４．５３６，４７９号、第４．２３３
．４０１号、第４．２３３．４０２号、第３．９９６．
３４５号に記載（これらの記載は参照文として本明細書
に含まれるものとする）されているような均一検定シス
テムを用いることができる。 好ましい実施Ｂ様に於ては、工程（ｅ）による検定のた
めに、工程（ｄ）の第１免疫反応体は下記の工程によっ
てさらに調製される。 （ｉ）第１免疫反応体中に存在するヒト免疫グロブリン
に結合する生物学的に活性な標識された特異結合剤、好
ましくはレセプターを混合して複合体、好ましくは標識
された第２免疫反応体を生成させる工程。より好ましく
は、標識された特異結合剤は免疫グロブリンクラス特異
性であり、すなわち結合剤は以下に説明するように、Ｉ
ｇＧ、ＩｇＭまたはＩｇＡクラスの免疫グロブリンと特
異的に免疫反応する能力がある。標識された特異結合剤
は複合体中の特異結合剤の存在を信号で知らせる能力が
ある。 （ｉｉ）そのようにして生成された標識された特異結合
剤／第１免疫反応体混合物を、標識された特異結合剤が
第１免疫反応体として存在するＥＡ−Ｄ抗体と複合体を
生成するために十分な所定時間の間生物学的検定条件下
に保持する工程。 抗ＥＡ−Ｄ抗体を含む第２免疫反応体の部分として結合
される標識された特異結合剤の存在の検定は試料中の抗
ＥＡ−Ｄ抗体の存在の検定を提供する。好ましい実質態
様に於ては、複合体の部分として結合された標識された
第２特異結合剤の量が測定され、それによって試料中の
抗ＥＡ−Ｄ抗体の量が決意される。その量は零であるこ
とがあり、それによって検知され得る限界内で試料中に
抗ＥＡ−Ｄ抗体が存在しないことを示すことがあり得る
。標識された特異結合剤の存在および量の検定方法は用
いられる標識に依存し、かかる標識および検定方法は技
術上公知である。 全抗体の形のレセプターのような蛋白質特異結合剤の標
識は技術上公知である。例えば、ハイブリドーマによっ
て産生されるレセプターはＩＪＩｍ培地中の成分として
提供される放射性同位体含有アミノ酸の代謝的結合によ
って標識され得る０例えばガルフレ（Ｇａｌｆｒｅ）ら
、Ｍｅｔｈ、 Ｉ！ｎｚ ｗｏｏｌ、 ７３．３−４６
（１９８１）参照。活性化官能基による蛋白質結合（
ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）またはカンプリングの技術は
特に適用可能である。例えば、アウラミーズ（八ｕｒａ
ｍｅａｓ） ら、 ５ｃａｎｄ、 Ｊ、 Ｉｍｍｕ
ｎｏｌ、 ＶＯｌ、 ８ Ｓ且肚ｈユ、７−２
３ （１９７８）および米国特許第４，４９３，７９５
号（これらの記載は参照文として本明細書に含まれるも
のとする）参照。さらに、標識が第２レセプターとその
標的抗原との免疫反応をほとんど妨害しないように部位
指示カップリング（ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｃｏ
ｕｐｌｉｎｇ）反応を行うことができる。例えば、ロッ
ドウェル（Ｒｏｄｗｅｌｌ） ら、Ｂｉｏｔｅｃｈ、
３．８８９−８９４ （１９８５）参照。 標識手段は抗体または抗原にそれらを変性することなく
化学的に結合して有用な免疫螢光トレーサーである螢光
色素（染料）を生成する螢光標識剤であることができる
。適当な螢光標識剤はフルオレッセインイソシアネート
（ＦＩＣ）、フルオレッセインイソチオシアネート（Ｆ
ＩＴＣ）、５−ジメチルアミノ−１−ナフタレンスルホ
ニルクロリド（ＤＡＮＳＣ） 、テトラメチルローダミ
ンイソチオシアネー） （ＴＲＩＴＣ）、リサミン、ロ
ーダミン８２００スルホニルクロ！Ｊ ）’ （ＲＢ２
００ ＳＣ）などのような螢光色素である。免疫螢光分
析技術の説明はマーチャロニス（Ｍａｒｃｈａｌｏｎｉ
ｓ）う編著、アンティボディアズアトウール（Ａｎｔｉ
ｂｏｄｙＡｓ Ａ Ｔｏｏｌ） Ｃジョンウィリーアン
ドサンズ（ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ ＆ ５ｏｎｓ） 、Ｌ
ｔｄ、 、ｐｐｌ ８９−２３１ （１９８２） Ｅ中
のデル力（ＤｅＬｕｃａ）、“免疫螢光分析（Ｉｍｍｕ
ｎｏ−Ｐｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ Ａｎａｌｙｓｉｓ）
”中に記載されている（この記載は参照文として本明
細書に含まれるものとする）。 好ましい実施態様に於て、指示基はワサビ大根ペルオキ
シダーゼ（ＨＲＰ）、ブドウ糖酸化酵素などのような酵
素である。主指示基がＨＲＰまたはブドウ糖酸化酵素の
ような酵素であるかかる場合には、レセプター−配位子
複合体（免疫反応体）が生成した事実を目に見えるよう
にするため追加試薬が所要である。ＨＲＰ用のかかる追
加試薬には過酸化水素およびジアミノベンジジンのよう
な酸化染料前駆物質が含まれる。ブドウ糖酸化酵素につ
いて有用な追加試薬は２，２′−アジノジー（３−エチ
ルベンズチアゾリンＧ−スルホン酸）（ＡＢＴＳ）であ
る、放射性元素も有用な標識剤であり、ここで実例的に
用いられる。 典型的な放射性標識剤はγ線放出を生ずる放射性元素で
ある。それ自体がγ線を放出する１！４Ｉ、ｌｔＪ、１
２１１Ｓ１３１１％ ””１％ ”Ｃｒはγ線放出生起
性放射性元素指示基の１つのクラスを示す。 Ｉｔｓ ｌが特に好ましい、有用な標識手段のもう１つ
の群はそれら自体が陽電子を放出するＩＩＣ，ｌ１ｌｐ
、ｌ５Ｏ１１３Ｎのような元素である。そのように放出
された陽電子は動物体内に存在する電子と遭遇するとき
γ線を生成する １１１１ｎまたは！Ｈのようなβ放出
体も有用である。 本発明の検定方法および系は固体担体を形成するための
固体マトリックスに結合された本発明の抗原またはレセ
プターを利用することができる。 抗原またはレセプターは、典型的には水性媒質すら吸着
によって固体マトリックスへ結合されるが、幾つかの吸
着様式ならびに当業者に公知の他の結合様式を用いるこ
とができる。かかる様式の典型例は架橋されたデキスト
ロースまたはセルロースのようなブドウ糖含有マトリッ
クスと臭化シアンとの反応によって生成される反応性カ
ルボキシル官能性とレセプターまたは抗原との反応、ラ
テックス粒子と共に後述するようなグルタルアルデヒド
結合などである。 有用な固体マトリックスは技術上公知である。 かかるマトリックスには、ファーマシアファインケミカ
ルズ（Ｐｈａｒ＋＋＋ａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉ
ｃａｌｓ） （米国二ニーシャーシー州ピスカタウェイ
市）からセファデックス（ＳＥＰＩ（ＡＤＥＸ）の商標
で発売されている架橋デキストラン；アガロース（ａｇ
ｏｒｓｅ） ；米国イリノイス州ノースジカゴのアボッ
トラボラトリーズ（Ａｂｂｏｔｔ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ
ｉｅｓ）から発売されている直径約１μｍ−約５鶴のポ
リスチレンビーズ；シート、ストリップまたはパドルの
ようなポリ塩化ビニル、ポリスチレン、架橋ポリアクリ
ルアミド、ニトロセルロースまたはナイロン−ベースの
ウェブ；ガラス；あるいはポリスチレンまたはポリ塩化
ビニル製のようなミクロタイタープレートの管、プレー
トまたはウェルが含まれる。 凝集型検定に有用なラテックス粒子も有用な固体マトリ
ックスである。かかる物質は日本合成ゴム会社（Ｊａｐ
ａｎ ５ｙｎｔｈｅｔｉｃ Ｒｕｂｂｅｒ Ｃｏｍｐａ
ｎｙ ｏｆＴｏｋｙｏ、 Ｊａｐａｎ）から発売されて
おり、陰イオン性石けん中に分散されたカルボキシ官能
性粒子として記載されている。かかる粒子の典型的なロ
フトは０．３０８μｍの平均直径を有し、カルボキシ基
１個につき約１５−約３０Ａ２の平均カルボキシ官能基
分布を有する。 使用する前に、粒子を１．３−ジアミノ−３−プロパツ
ールのようなジアミノと反応させて遊離アミノ基を保持
しながら粒子カルボキシ基と複数のアミド結合を生成さ
せる。その後で、遊離アミノをグルタルアルデヒドのよ
うなジアルデヒドおよびレセプターまたは抗原と反応さ
せてシッフ塩基反応生成物を生成させる。その後で、シ
ッフ塩基反応生成物を硼水素化ナトリウムのような水溶
性還元剤で還元して有用な固体担体を提供する。 本発明で利用することができる数多くの免疫検定法があ
ることを当業者は理解するであろう。しかし、抗ＥＡ−
Ｄ抗体と本発明のポリペプチドとの反応によって与えら
れる信号をもたらすどんな方法でも意図される。さらに
、特に記載した検定システムおよび方法は固相を利用す
るが、本発明はそれに限定されるものではない。これら
の検定方法のおのおのは指示手段が免疫反応、かつそれ
によって検定されるべき抗体と本発明のポリペプチドと
の結合の信号を出すために利用される。模範的な技術は
マギオ（Ｍａｇｇｉｏ）、エンザイムイムノアッセイ（
Ｅｎｚ ｍｅ ｒｎ＋ｍｕｎｏａｓｓａ ） ＣＲＣブ
レス（米国オハイオ州りリープラント市）（１９８１）
、およびゴールドマン（Ｇｏｌｄｍａｎ） 、フルオレ
ッセントアンティボディメソッド（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅ
ｎｔ ＡｎｔｉｂｏｄｙＭｅｔｈｏｄｓ）、アカデミツ
クプレス（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ）（米国ショ
ーヨーク州ニューヨーク市） （１９８８）中に説明
されている。 ２、抗ＥＡ−Ｄ抗体を検定するための診断システ本発明
の抗ＥＡ−Ｄ抗体検定法を行うために有用な、好ましく
はキットの形の診断システムは、別個の包装で（ａｌ
Ｅ Ｂ Ａ Ｅ Ａ −Ｄ蛋白質のアミノ末端から約
３５０位から約３６２位までのＥＢＶＥＡ−Ｄ蛋白質の
アミノ酸残基配列に実質的に相当するアミノ酸残基配列
を有する本質的に約６−約４０個のアミノ酸残基からな
る合成ポリペプチドと（ｂｌ該ポリペプチドと抗ＥＡ−
Ｄ抗体の免疫反応の信号を出すための標識された特異結
合剤とを含む。好ましくは、標識された特異結合剤は酵
素に結合したレセプターである。 好ましい実施態様に於ては、システムはポリペプチドが
それに結合して固体支持体を形成する固体マトリックス
をも含む、有用な固体マトリックスは既に記載しである
。しかし、好ましくは、固体マトリックスはミクロタイ
タープレートのウェルである。最も好ましくは、固体支
持体は固体マトリックスに結合した既知量のポリペプチ
ドで提供される。 好ましい実施態様に於ては、陽性の対照として用いるた
めの本発明のポリペプチドに対して産生される抗体をも
含む。 既知量のポリペプチドおよび標識された特異結合剤が提
供される。これらの量は１回の検定を行うために少なく
とも十分な量である。ポリペプチドおよび標識された特
異結合剤は、典型的には、以下に記載されるように、水
、食塩水または緩衝液で所定容量に希釈するように設計
される形および量で提供される。 システムには追加の包装をも含むことができる。 かかる包装は（ｉ）乾燥形または液状の緩衝塩（ｉｉ）
ｏ−フヱニレンジアミノのような酵素基質などを含むこ
とができる。 ３、旦人二旦■挾定 本発明は体試料中に於けるＥＡ−Ｄの存在の検定方法を
も意図している。一般に、アセトンまたはメタノール固
定によって溶解された溶解末梢血液リンパ球（Ｐ Ｂ
Ｌ）のような被検体試料が提供される。試料は本発明の
合成ポリペプチドによって誘導される抗体結合部位を含
むレセプター分子と混合される。混合物は、レセプター
分子が体試料中に存在するＥＡ−Ｄと免疫反応するため
に十分な所定時間生物学的検定条件下に保持される。 次に、免疫反応の量（すなわち生成した免疫反応体のり
を測定して被検体試料中にＥＡ−Ｄ分子が存在していた
か不在だったかを決定する。 ４、ＥＡ−Ｄ ＃ システム 上記検定方法を実施するために有用な好ましくはキット
形の診断システムは、別個の包装で、（ａ）ＥＡ−Ｄと
免疫反応する本発明のレセプターと世）本発明のレセプ
ターとＥＡ−Ｄとの免疫反応を信号で示すための標識さ
れた特異結合剤とを含む。 好ましい実施態様に於ては、キットは、別個の包装で、
レセプターと反応するモルモット補体のような補体、抗
免疫グロブリン抗体またはＳ、アラスレウス（Ｓ、ａｕ
ｒｅｕｓ）コワン（ｃｏｗａｎ）株蛋白質Ａのような増
幅用試薬をも含む。これらの実施態様では、増幅手段が
本発明のレセプターに結合するとき、増幅手段に特異的
に結合する能力がある。 ここで記載した診断システムのレセプター分子と別個の
指示手段ならびに上記増幅用試薬は、溶液で、あるいは
液状分散体として、あるいは実質的に乾燥した粉末、例
えば凍結乾燥形粉末として提供されることができる。指
示手段が増幅用試薬とは別個の分子である場合には、指
示手段を別個に包装することが好ましい。指示手段が酵
素である場合には、酵素の基質もシステムの別個の包装
で提供することができる。前述の顕微鏡スライドのよう
な固体マトリックス、１種以上の緩衝剤、アセトンもこ
の診断検定システムの別個包装要素として含むことがで
きる。 診断システムに関連してここで述べた包装は診断システ
ムに於て通常用いられる包装である。かかる包装はガラ
スおよびプラスチック（例えばポリエチレン、ポリプロ
ピレン、ポリカーボネート）のびん、バイアル、プラス
チックおよびプラスチック箔積層封筒などを含む。 の の ノエ 下記の実施例は本発明を説明するためのものであって、
限定するためのものではない。 ！ＪｌｆＬＬ： ボｉペプチドのＡ ＥＡ−Ｄ遺伝子を位置決定し、その解読枠を決定するた
め、ＥＡ−Ｄ蛋白質のアミノ末端の一部分を親和性精製
ＥＡ−Ｄを用いて順序付け（ｓｅｑｕｅｎｃｅ；した。 かくして得られたアミノ酸残基配列をＢＢＶゲノムの可
能なアミノ酸残基配列翻訳と、そう（りのものが見いだ
されるまで比較し、それによって推定ＥＡ−Ｄおよびそ
の解読枠を同定した。その解読枠に基づいてＥＡ−Ｄ蛋
白質遺伝子の翻訳されたアミノ酸残基配列を、ベール（
Ｂａｅｒ）ら、主−チ＋−（Ｎａｔｕｒｅ）３１０．２
０７ （１９８４）によって利用されたＥＢＶ株に対し
て第１図に示す。 上で得たアミノ酸残基配列を用いて、翻訳された遺伝子
の部分に対応する一連の短い合成ポリペプチドを合成し
、それらの自生のＥＡ−Ｄの抗原決定基を模倣する能力
を試験した。これらのポリペプチドのアミノ酸残基配列
およびＥＡ−Ｄ蛋白質中に於けるアミノ末端からのその
配列の位置を、下記第１表中に、アミノ末端からカルボ
キシ末端への方向に、左から右へ示しである。 １１７ ＰＡＲＰＩ！ＴＰＳＰＡＩＰＳＣ”
３５０−３６２に６ ＲＫＲＴＳＳＩ！
ＡＲＩＫＱＫＣ” ３７９−３９１に５
ＰＫＫＶＫＱＡＦＮＰＬＩＣ” ３９３−４
０４１１８ ＴＶＳＰＳＰＳＰＰＰＰＰＲＴＰ
Ｃ鵞 ３３１−３４５゜Ｋ９ ５ＶＡＡＤＳＬ
ＡＡＡＬＳＬＣ２４２−２５５１ベール（Ｂａｅｒ）ら
、ネーチ＋ −（Ｎａｔｕｒｅ）、３１０２０７ （１
９８４）に報告されているゲノム配列データから翻訳、
推定されたＥＡ−Ｄ分子のアミノ末端からの位置。 ２カツプリングの目的で付加されたカルボキシ末端シス
ティンは同族ＥＡ−Ｄ蛋白質アミノ酸残基配列中には存
在しない。 上の第１表中に示したポリペプチドはメリフィールド（
Ｍｅｒｒｉｆ ｔｅｌｄ）ら、Ｊ、 Ａｍ、 ＣｈｅＩ
Ｉｌ、 Ｓｏｃ、 、８５．２１４９−２１５４ （１
９６３）およびホートン（ｌｏｕｇｈｔｏｎ）ら、Ｉｎ
ｔ、 Ｊ、 Ｐｅ ｔ、 Ｐｒｏｔ、 Ｒｅｓ。 １６．３１１−３２０ （１９８０）中に記載されてい
る固相法によって化学的に合成された。ポリペプチド合
成の固相法はベガバイオテクノロジーズ社（Ｖｅｇａ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、 Ｉｎｃ−＋ Ｔｕ
ｃｓｏｎ＋ Ａｚ）から市販されているベガモデル２５
０Ｃポリペプチドシンセサイザー（Ｖｅｇａ Ｍｏｄｅ
ｌ ２５０ＣＰｏ１ｙｐｅｐｔｉｄｅＳｙｎ ｔｈｅｓ
１ｚｅｒ）を用いて実施され・た。 Ｋ９以外のポリペプチドの場合には、システィン残基を
カルボキシ末端へ付加して下記のように蛋白質担体への
カップリングを助けた。全ポリペプチドの組成はアミノ
酸分析で確認した。 上記固相法で本発明の合成ポリペプチドを製造する場合
、アミノ酸残基をカルボキシ末端残基からエステル結合
によって樹脂（固相）に結合させた。ポリペプチドをＣ
ｙｓ残基によって担体へ結合させようとする場合あるい
は末端Ｃｙｓ残基を経て重合させようとする場合には、
樹脂にエステル結合しているカルボキシ末端残基として
そのＣｙｓ残基を利用するのが便利である。 典型的には各付加アミノ酸のα−アミノ基を第三ブトキ
シカルボニル（ｔ−ＢＯＣ）で保護した後、成長しつつ
あるポリペプチド鎖中へ次のアミノ酸を付加する。次に
、そのｔ−ＢＯＣ基を除去した後、成長しつつあるポリ
ペプチド鎖へ次のアミノ酸を付加する。 ポリペプチドの合成中には、反応性アミノ酸側鎖も保護
した。残りのアミノ酸残基のために次のような通常の側
鎖保護基を用いた。 チロシンのためには０−（ｐ−ブロモベンジルオキシカ
ルボニル）；スレオニン、セリン、アスパラギン酸、グ
ルタミン酸のためにはＯ−ベンジル；システィンのため
にはＳ−メトキシベンジル；ヒスチジンのためにはジニ
トロフェニル；リシンのためには２−クロロベンゾキシ
カルボニル；アルギニンのためにはトシル。 使用する前に、保護されたアミノ酸を適当な溶媒から再
結して薄層クロマトグラフィーで単一スポットとする。 カップリングは、典型的には初期Ｎ−末端アミノ酸のミ
リ当量数より１０倍モル過剰の保護アミノ酸とジシクロ
へキシルカルボジイミドの両方を用いて行われた。両方
の反応剤の２モル過剰も用いることができる。アスパラ
ギンの場合には、等モル量のＮ−ヒドロキシ−ベンゾト
リアゾールを保護アミノ酸へ付加し、ジメチルホルムア
ミドを溶媒として用いた。カップリング反応はすべて、
ギシン（Ｇｉｓｉｎ） 、Ａｎａｌ、 ＣｈｅＩｌｌ、
八ｃｔａ。 ５８．２４Ｂ−２４９（１９７２）のピクリン酸試験に
よって９９％以上完全であった。 所望のポリペプチドの製造後、得られた保護ポリペプチ
ドの一部分（約１ｇ）を２ｗｉのアニソールで処理し、
ドライアイス温度に於ける反応器中へ約２０ｍｊ＋の無
水弗化水素を凝縮させた。得られた混合物を４℃に於て
約１時間攪拌して保護基を分離し、ポリペプチドを樹脂
から除去した。 温度４℃に於て、Ｎ２流で弗化水素を蒸発させた後、残
留物を無水ジエチルエーテルで３回抽出してアニソール
を除去し、残留物を真空乾燥した。 真空乾燥物を５％酢酸水溶液（５０ｍｊ！ ３回）で抽
出して遊離ポリペプチドを樹脂から分離した。 抽出物含有溶液を凍結乾燥してモノマー未酸化ボ゛リベ
ブチドを提供した。 裏施侃叉： オニ」３≧コシ１遣 本発明の合成オリゴマーは、１つのポリペプチドのカル
ボキシ末端残基と第２のポリペプチドのカルボキシル末
端残基との間のアミド結合によって一緒に端一端（頭−
尾）結合される複数の本発明のポリペプチドの固相合成
によって製造することができる。かかる合成オリゴマー
は好ましくは単一の長いポリペプチドオリゴマーとして
合成されるが、個々のポリペプチドとして合成し、これ
らをその個々の合成の後で、１−（３−ジメチルアミノ
プロピル）−３−エチルーカルポジイミド塩酸塩水溶液
のようなカルボジイミド反応剤を用いて一緒に結合させ
ることができる。単一ポリペプチド鎖として製造された
オリゴマー中に含まれるアミノ酸残基の全数は、約６個
までの本発明のポリペプチドが単一のポリペプチドとし
て合成される単一の頭−尾オリゴマー鎖に結合され得る
ように、好ましくは約４０未満である。より好ましくは
合成類−尾オリゴマーは結合した本発明の合成ポリペプ
チド２−約４ブロツクおよび全部で約４０未満のアミノ
酸残基を含む。 大立拠ユニ ヱ茎ヱニ免製遺 本発明のポリペプチドポリマー（合成マルチマー）は、
実施例Ａ記載のようにして、かつアミノ末端とカルボキ
シ末端の両方にシスティン残基を含む本発明のポリペプ
チドを合成して未酸化、還元形の“ジＣｙｓ末端”ポリ
ペプチドを生成することによって製造することができる
。合成後、典型的な実験室製造では、１０ｍｇのジＣｙ
ｓポリペプチド（未酸化形でシスティン残基を含む）を
２５０ｍ１の０．１モル（Ｍ）炭酸アンモニウム緩衝液
に溶解する。この溶解したジＣｙｓ末端ポリペプチドを
、次に、得られた溶液を包囲常温で空気中で約１８時間
おだやかに攪拌することにより、あるいはエルマン（Ｅ
ｌｌｍａｎ）試験〔エルマン（ＥＩＬｍａｎ）。 Ａｒｃｈ、 Ｂｉｏｃｈｅｍ、 Ｂｉｏ ｈ ｓ、＋
８２、Ｔｏ−７７（１９５９）。〕で遊離メルカプタン
が検出されなくなるまで空気酸化する。 かくして製造されたポリマーは酸化システィン（シスチ
ン）残基によって一緒に結合された合成ポリペプチド反
復単位を複数個含む。かかるポリマーは、典型的に、頭
−尾方式ならびに頭−頭および尾−尾方式で一緒に結合
したポリペプチド反復単位を含む。すなわち２個のポリ
ペプチド反復単位のアミノ末端は、両ポリペプチド末端
に於ける結合基は等しいので、２個のカルボキシル末端
ができるように単一ジスチン残基によって一緒に結合さ
れることができる。 ！ＪｉｌＪｕ ＝ 旦 へのカップリング合成ポリペ
プチドを、リウ（Ｌｉｕ）ら、Ｂｉｏｃｈｅｍ、、エエ
、６９０ （１９７９）に記載されている方法によっ
て免疫原性担体としてのスカシガイのヘモシアニン（Ｋ
ｅｙｈｏｌｅ Ｌｉｍｐｅｔ Ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ（
ＫＬＨ）：ｌにカップリングさせた。要するに、４ｍｇ
の担体を０．５１ｍｇのＴｎ−マレイミドベンゾイル−
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステルで活性化し、次
に５ｍｇのポリペプチドとアミノ末端システィンまたは
カルボキシ末端システィンによって反応させて約ｌ〇−
約３５重量％のポリペプチドを含む結合物を提供した。 実施例５： 抗ＥＡ−Ｄ抗体のＥＬＩＳＡ検定種々のＥ
ＢＶ関連臨床症状を有する患者からの血清試料を、下記
のＥＬ Ｉ ＳＡを用いて抗ＥＡ−Ｄ抗体の存在につい
て検定した。被検血清は、臨床的特徴と羊赤血球凝集陽
性（すなわちヘテロフィル）とに基づいて急性伝染性単
核症（ＩＭ、）をもつと診断された患者からのものであ
った。ＩＭ診断を確かめるために、これらの患者からの
回復期血清を抗ＥＢＮＡ−１抗体および抗ＶＣＡ（ＶＣ
Ａ ’）抗体について試験し、これらの抗体を含むこと
を発見した。 異姓性ＶＣＡおよびＥＢＮＡ−１抗原に対して指向され
る抗体が陰性である健康な個人から正常成人血清を得た
。ＶＣＡ陰性（ＶＣＡ−）と呼ぶこの群は多分−次ＥＢ
Ｖ感染を受けていない。健常供給者の第２群は陽性抗Ｖ
ＣＡおよび抗ＥＢＮＡ −１抗体力価をもっていた。こ
の第２対照群はＶＣ＾陽性（ＶＣＡ”）と呼ばれ、多分
以前にＥＢＡ暴露を受けている。 増加した回復期抗ＣＭＶ抗体力価によって決定される急
性サイトメガロウィルス（ｃＭＶ）感染を有する患者か
らの血清も試験した。ショーグレン症候群（Ｓ Ｓ）を
有する患者から試験した血清は乾性角結膜炎、口内乾燥
症、陽性小咄液腺生検（スケールＩ−Ｉ’／で等級■）
、ならびに抗核抗原およびリウマトイド因子を含む上昇
した自己抗体力価を有していた。リウマトイド関節炎（
ＲＡ）を有するが関連したＳＳ症状が無い患者の血清も
評価した。 合成ポリペプチドを、マトリックスとしてミクロタイタ
ープレートウェル（ｍｔｃｒｏｔｉｔｅｒ ｐｌａｔｅ
ｗｅｌｌ） （イムノロン（Ｉｎ＋ｎ＋ｕｎｏｌｏｎ
） Ｉｆ ；ダイナチクラボラトリーズ社（Ｄｙｎａ
ｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、 Ｉｎｃ、。 Ａｌｅｘａｎｄｒｉａ、 ＶＡ） ）の壁に、各ウェル
に１０μｇ／ｍｌのポリペプチドを含む硼酸塩緩衝食塩
水（ＢＢＳ ； ２００ｍＭ硼酸ナトリウム、１６０ｍ
Ｍ ＮａＣ１，ｐｔ（８，０）０．０５０ｓｆｆｉを混
合することによって結合させた。この混合物を４℃に於
て約１６時間保持した。プレートを転倒して振ることに
よって未結合ポリペプチドをウェルから分離した。残留
非特異結合部位を、次に、０．２００ｍ１の封鎖用溶液
〔１０％の正常ヤギ血清（ＮＧＳ）を含むＰＢＳ （１
０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｊ！
、ｐＨ７，３））を各ウェル中で混合することによって
封鎖した。かくして生成した混合物を吸湿チャンバー内
で３７℃に約９０分間保持した。次に、封鎖用溶液を、
ウェルを転倒して振ることによってウェルから除去し、
かくして生成した固体支持体を空気中で３７℃に於て約
１時間乾燥させた。 ポリペプチド被覆ウェル（固体支持体）のおのおのに封
鎖用溶液でｌ：２０に希釈した０、 ２００■ｌの血清
を混合して固−液相免疫反応混合物を形成させた。この
混合物を２５℃に於て約１時間保持した。次に、０．０
５％のトゥイーン（ＴｗＩｅｅｎ）２０ 〔ポリオキシ
エチレン（３０）ソルビタンモノラウレート〕 〔シグ
マ（Ｓｉｇｍａ） ）を含むＢＢＳで３回洗浄すること
によって未結合物をウェルから分離した。 生成した固相結合免疫反応体の量を、１０％ＮＧＳを含
むＢＢＳで１：１０００に希釈したワサビ大根ペルオキ
シダーゼ（ＨＲＰ）に結合したヒト免疫グロブリンクラ
ス特異性抗体０．２００１１１１を混合して第２固−液
相混合物を形成することによって測定した。ＩｇＧ抗体
およびＩｇＭ抗体を検出するため、ＨＲＰ結合マウス抗
ヒトＩｇＧおよびマウス抗ヒトＩｇＭモノクローン抗体
Ｃそれぞれオルトディアグノスティックス社（Ｏｒｔｈ
。 Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ＋ Ｒａｒｉｔａｎ、 ＮＪ）
）を用いた。ＩｇＡ抗体を検出するためには、ＨＲＰ
結合ヤギ抗ヒトＩｇＡ（キレガードアンドベリー社（Ｋ
ｉｒｅｇａａｒｄａｎｄ Ｐｅｒｒｙ、 Ｇａ１ｔｈｅ
ｒｓｂｕｒｙ、 ＭＯ）］を用いた。第２固／液相混合
物を約２５℃に於て約１時間保持した。次に、上記のよ
うにして５回洗浄することによって未結合物を固相結合
サンドインチ（第２）免疫反応体から分離した。 次に、ＨＲＰ標識含有固相結合サンドインチ（第２）免
疫反応体の量を、メーカーの指示に従って新たに調製し
た０、２００ｍ１の０−フェニレンジアミノ（ＯＰＤ、
シグマ）基質溶液を混合することによって検定した。約
２５℃に於て約１５−約３０分間発色させた。次に、０
．０５（１＋１の４Ｎ ＨｔＳＯａを各ウェル中に混
合することによって基質転化反応を停止させた。ダイナ
チクＭＲ６０００（Ｄｙｎａｔｅｃｈ ＭＲ６０００）
（ダイナチクラボラトリーズ社（Ｄｙｎａｔｅｃｈ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、 Ｉｎｃ、）） ミクロ
タイタープレートリーダー（ｓｉｃｒｏｔｉｔｅｒ ｐ
ｌａｔｅｒｅａｄｅｒ）を用いて波長４９０ ｎｍに於
ける混合物の光学密度を測定した。 １Ｍおよび正常血清の抗ＢＡ−Ｄ抗体につい−の結果を
第２図に示しである。固体マトリックスに結合したポリ
ペプチドに７を用いると、正常血清と比べてＩＭ患者の
血清からはＩｇＧＳ ＩｇＡ、ＩｇＭ抗体の明らかに高
い結合が観察された。対照的に、合成ポリペプチドに５
、Ｋ８、Ｋ９は正常血清と比べて１Ｍ血清との増加した
免疫反応性を示さなかった。しかし、幾らかの１Ｍ血清
中にはポリペプチドに６に対する低免疫反応性が存在し
た。 鼻咽頭癌（ＮＰＣ） 、ＥＢＶ関連疾患、ＳＳを有する
患者からの血清も、正常血清と比べてポリペプチドに７
との増加した免疫反応性を示した（第３図）。対照的に
、乾性症状の無いＲＡを有する患者からの血清は明らか
な抗ポリペプチドに７活性を示さなかった。 上記ＥＬ Ｉ ＳＡを用いて時間経過研究も行った。 ４人のＩＭ患者から、患者がＩＭ痛症状かかっている期
間中に得た一連の試料を、ポリペプチドに７およびロー
デス（Ｒｈｏｄｅｓ）ら、Ｊ、 Ｉｓｖ＋ｕｎｏ１．＋
１３４．２１１−１６ （１９８５）のポリペプチドを
それぞれ固体マトリックスに結合させて用い、抗に７抗
体および抗ＥＢＮＡ−１抗体の存在について試験した。 第４図に示したこれらの結果は、抗ＥＡ−Ｄポリペプチ
ド抗体がＥＢＶ感染の開始時に於て抗ＥＢＮＡ−１抗体
よりも高いレベルで生じることを示す。 かくして、本発明の検定方法はＥＢＶ関連疾患を有する
血清患者中に於ける本発明のポリペプチドに免疫学的に
結合する抗体を検出することができる。これらのポリペ
プチド反応性抗体はＥＢＶ感染の結果としてＥＡ−Ｄ蛋
白質の対応する部分によって誘導されと考えられる。 去隻拠亙： ±ユニプ±工濃度 ミクロタイタープレートウェル壁を被覆して固体支持体
を生成させる。ために用いられるポリペプチド含有溶液
の濃度を変える影響を試験した。 ＢＢＳ中に０．１．１．０．１０．１（１０）μｇ／ａ
ｌｌのポリペプチドに７を含む溶液を用いて実施例５記
載のようにウェル壁ヘポリベプチドを結合させた。正常
個人（ＶＣＡ＋およびＶＣＡ−）およびＩＭ患者からの
血清を用い、実施例５に従って抗ＥＡ−ＤＩｇＭ抗体を
検出するためＥＬＩＳＡを行った。血清はすべて１：２
０希釈で用いた。この研究の結果は第５Ａ図に示しであ
る。これらの結果は、試験したポリペプチド濃度の範囲
にわたって各被検血清中で検出された抗ＥＡ−ＤＩｇＭ
抗体の量はほとんど変化しないことを示している。 かくして、０．１μｇ／ｍｌポリペプチドのような低い
濃度のポリペプチド溶液を用いて本発明のポリペプチド
をミクロタイタープレートウェルの内壁へ結合させて固
体支持体を形成することができる。 叉施班工＝ 試料界ｙ 実施例５のＥＬＩＳＡに於ける被検体液試料の希釈の影
響を試験した。正常個人（ＶＣＡ−およびＶＣＡ” ）
ならびにＩＭ、ＮＰＣ，ＳＳを有する患者からの血清を
前述の封鎖用溶液でｌ：５．１：２０、ｌ：５０、ｔ：
ｉｏｏに希釈し、実施例５記載のように検定した。 この研究の結果は第５Ｂ図に示しである。これらの結果
は、試料の希釈度の増加に伴う感度の減少が約１：２０
の試料希釈で横ばいになり始めることを示している。 実施例８： 抗ＥＡ−Ｄの検出 本発明の検定法の試料中に存在する抗ＥＡ−Ｄ免疫グロ
ブリンのクラスを識別する能力を試験した。このことは
、第１表中に示したポリペプチドのおのおのを実施例５
のＥＬＩ ＳＡに於ける固相結合抗原として用いること
によって達成された。 第１表中のポリペプチドを、血清試料中のＩｇＧ。 ＩｇＭ、ＩｇＡ抗体と免疫反応する能力について検定し
た結果を下記第２表に示す。 第２表 種々のポリペプチドへのＩｇＧ、 ＩｇＭ、 ＩｇＡ抗
体の結合１ペプチド２ 試料に５ Ｋ６ Ｋ７ Ｋ８ Ｋ９ｇＧ ＲｌＳ、’ ０．００６ ０．００２ ０．００２
０．０００ ０．０００２２４１’ ０．００２
０．０２４ ０，２０７ ０．０２５ ０．０１２Ａ
、１１．’ ０．０００ ０．０００ ０．０００
０．０００ ０．００３Ｒ１Ｒ，’ ０．０００
０．００５ ０．００８ ０．００３ ０．０２０口
１Ｍ、’ ０．０００ ０．０１６
０．００４ ０．０００ ０．００８−」ヱ ＲｏＳ、０．０６０ ０．０５７ ０．０５２ ０．０
４１ ０．０４２２２４１ ０．３５７ ０．２９８
０．５４０ ０．５５８ ０．３１４Ａ、Ｗ、０．１
０７ ０．１６７ ０．１０１ ０．１００ ０．０８
ＯＲ０Ｒ，０，１４４０，０８３０，０７００，０８１
０，０４７０、Ｍ、 ０．４０５ ０
．５６６ ０Ｊ３０ ０，３０８ ０．２
９５ユ盈Δ ＲｏＳ、 ０．００２ ０．００９ ０．０００
０．０００ ０．００７２２４１ ０．０１５ ０
．０１８ ０．２９６ ０．０２１ ０．０２１Ａ、Ｗ
、０．０００ ０．０５１ ０．０００ ０．００３
０．００６Ｒ，Ｒ，０，０１８０，０３４０，００ロ
０．００２ ０．０２５Ｄ８Ｍ、 ０．
００７ ０．０２０ ０．０００ ０．０００ ０．０
０３１示した値は４９０ｎｍの光の波長に於けるＢＢＳ
に対する光学密度の単位である。 クポリペプチドに５、Ｋ６、Ｋ７＝ Ｋ８、Ｋ９は第１
表に示したアミノ酸残基配列を有する。 ３臨床的に正常な個人からの血清で、以前にＥＢＶに暴
露されていない（ＶＣＡ−）。 ４臨床的に急性ＥＢＶ感染を有する患者からの血清（Ｉ
Ｍ）。 ｓ前にＥＢＶに暴露された臨床的に正常な個人からの血
清（ＶＣＡＩ。 ６前にＥＢＶに暴露されている（ＶＣＡ” ）が上昇し
た抗ＥＡ ＩｇＭレベルを有する（偽陽性）臨床的に
正常な個人からの血清。 上記の結果は、固体マトリックスに結合（吸着などによ
り）して固体支持体を形成するポリペプチドに７は急性
ＥＢＶ感染を有する患者（＃２２４１）の血清中のＩｇ
Ｇ、ｒｇＭ、ＩｇＡ抗体と免疫反応する能力があること
を示す、さらに、ＥＢＶカプシド抗原に対する抗体を含
む（ＶＣＡ’）２人の臨床的に正常な個人からの血清は
に７と免疫反応せず、またＥＢＶに対する前取ての検出
可能な暴露が無い（ＶＣＡ−）臨床的に正常な個人から
の血清もに７と免疫反応しなかった。 特殊な実施態様および実施例を含む以上の明細書は本発
明の説明のためのものであって、限定と取られるべきで
はない。本発明の真の精神および範囲から逸脱すること
なく数多くの他の種々の変化や変更を行うことが可能で
ある。
【図面の簡単な説明】
第１図は公表されたＥＡ−Ｄ遺伝子配列から１文字アミ
ノ酸残基略号を用いて、左から右へ、アミノ末端からカ
ルボキシ末端の方向にとったＥＡ−Ｄタンパク質の完全
なアミノ酸残基配列を示す図であり、 第２図は実施例５に記載されるポリペプチドに７を固相
標的とした抗ＥＡ−Ｄ抗体ＥＬＩＳＡを用いた正常固体
（正常）および感染性単核患者（急性ＩＭ）の血清中の
、それぞれ抗ＥＡ−ＤＩｇＭ、ＩｇＧおよびＩｇＡ抗体
に対する検定の結果を、各試料により光学濃度（ＯＤ４
９０）を生じた試料の数を抗体応答の頻度として示すグ
ラフであり、 第３図は鼻咽頭癌（ＮＰＣ）、シェーグレン症候群（Ｓ
Ｓ）、サイトメガロウィルス（ｃＭＶ）感染患者および
正常提供者の血清の検定に実施例５のポリペプチドに７
ＥＬＩＳＡを用いて得られた結果を示すヒストグラムで
あり、 第４図は急性ＩＭ患者の血清試料をＥＬＩＳＡを用いて
検定した結果を示すグラフであり、Ａは抗ＥＡ−Ｄ抗体
ＥＬＩＳＡを用い、Ｂは抗ＥＢＮＡ −Ｉ ＥＬＩＳ
Ａを用いた結果を示し、第５図は抗ＥＡ−Ｄ ＩｇＭ
抗体ＥＬ Ｉ ＳＡにおける血清希釈およびポリペプチ
ド濃度の影響を示すグラフであり、Ａはペプチドに７の
濃度、Ｂは血清希釈、のそれぞれの影響を示す。 Ｓ！０２５２０２５３０ １ ＭＥＴＴＱＴＬＲＦＫＴに＾ＬＡＶＬＳＫＣＹ
ＤＨＡＱＴＨＬＫ（ｉ３！ ＣＶＬＱＶＮＬＬＳＶ
ＮＹＣＣＰＲＬＡＡＶＡＮＡ（ｉＴＡｃＬＩｓ６１
ＦＥＶＳＰＤＡＶＡＥＷＱＮＨＱＳＰＥＥＡＰＡＡＶ
５ＦＲＮＬ＾９１ ＹＣＲＴＣＶＬＣＫＥＬＦ（ｉ
ｓＡＶＥＱＡｓＬＱＦＹＫＲＰＱｃｃ１２１ Ｓ
ＲＰＥＦＶＫＬＴＩＪＥＹＤＤＫＶＳＫＳＨＨＴＣＡＬ
ＭＰＹＩＪＰ１！ｌ Ｐ Ａ Ｓ Ｄ ＲＬ ＲＮ
Ｅ Ｑ ＆Ｉ Ｉ ＣＱ Ｖ Ｌ Ｌ Ｍ Ｐ Ｋ
Ｔ Ａ Ｓ Ｓ Ｌ Ｑ Ｋ Ｗ Ａ Ｒ１８１Ｑ Ｑ
Ｇ Ｓ ＣＣＶ Ｋ Ｖ Ｔ Ｌ Ｎ Ｐ Ｄ Ｌ
Ｙ Ｖ Ｔ Ｔ Ｙ Ｔ Ｓ ＣＥＡＣＬＴＬＤ２１３
Ｙ Ｋ Ｐ Ｌ Ｓ Ｖ ＣＰ Ｙ Ｅ Ａ Ｆ
Ｔ ＣＰ Ｖ Ａ Ｋ Ａ Ｑ Ｄ Ｖ ＣＡ Ｖ
Ｅ Ａ ＨＶ Ｖ２７１ ＣＩＩＡＶＶＡＣＬＬ
ＴＳＡＣＤＬＰＬＯＬＳＶＩＬＦＮＨＡＳＥ）Ｏｌ
ε ＡＡＡＳＴＡＳＥＰＥ ロ に ５ＰＲ
ＶＱＰＬ（ｉＴｃＬＱＱＲＰＲＨ３６１Ｐ Ｓ ＨＳ
Ｓ Ｎ Ｔ Ａ Ｌ Ｅ ＲＰ Ｌ Ａ Ｖ Ｑ Ｌ
Ａ ＲＫ ＲＴ Ｓ Ｓ Ｅ Ａ ＲＱ Ｋ Ｑ＋−ｍ
−φ−−−−−−−−−− Ｒ６＋＋＋＋＋＋＋＋ＦＩ
Ｇ、２ 叩、。 ＦＩＧ、３ ＃７’１． ＥＡＤ （００４ｎ１ ０．０．４９０ ｎｍ
ノ酸残基略号を用いて、左から右へ、アミノ末端からカ
ルボキシ末端の方向にとったＥＡ−Ｄタンパク質の完全
なアミノ酸残基配列を示す図であり、 第２図は実施例５に記載されるポリペプチドに７を固相
標的とした抗ＥＡ−Ｄ抗体ＥＬＩＳＡを用いた正常固体
（正常）および感染性単核患者（急性ＩＭ）の血清中の
、それぞれ抗ＥＡ−ＤＩｇＭ、ＩｇＧおよびＩｇＡ抗体
に対する検定の結果を、各試料により光学濃度（ＯＤ４
９０）を生じた試料の数を抗体応答の頻度として示すグ
ラフであり、 第３図は鼻咽頭癌（ＮＰＣ）、シェーグレン症候群（Ｓ
Ｓ）、サイトメガロウィルス（ｃＭＶ）感染患者および
正常提供者の血清の検定に実施例５のポリペプチドに７
ＥＬＩＳＡを用いて得られた結果を示すヒストグラムで
あり、 第４図は急性ＩＭ患者の血清試料をＥＬＩＳＡを用いて
検定した結果を示すグラフであり、Ａは抗ＥＡ−Ｄ抗体
ＥＬＩＳＡを用い、Ｂは抗ＥＢＮＡ −Ｉ ＥＬＩＳ
Ａを用いた結果を示し、第５図は抗ＥＡ−Ｄ ＩｇＭ
抗体ＥＬ Ｉ ＳＡにおける血清希釈およびポリペプチ
ド濃度の影響を示すグラフであり、Ａはペプチドに７の
濃度、Ｂは血清希釈、のそれぞれの影響を示す。 Ｓ！０２５２０２５３０ １ ＭＥＴＴＱＴＬＲＦＫＴに＾ＬＡＶＬＳＫＣＹ
ＤＨＡＱＴＨＬＫ（ｉ３！ ＣＶＬＱＶＮＬＬＳＶ
ＮＹＣＣＰＲＬＡＡＶＡＮＡ（ｉＴＡｃＬＩｓ６１
ＦＥＶＳＰＤＡＶＡＥＷＱＮＨＱＳＰＥＥＡＰＡＡＶ
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−φ−−−−−−−−−− Ｒ６＋＋＋＋＋＋＋＋ＦＩ
Ｇ、２ 叩、。 ＦＩＧ、３ ＃７’１． ＥＡＤ （００４ｎ１ ０．０．４９０ ｎｍ
Claims (16)
- （１）ＥＢＶ ＥＡ−Ｄタンパク質の、そのアミノ末端
からおよそ位置３５０〜およそ位置３６２のアミノ酸残
基配列に相当するアミノ酸残基配列を有する約６〜約４
０個のアミノ酸残基から実質的になる合成ポリペプチド
であって、ＥＡ−Ｄに対し生成される抗体に免疫結合す
る能力を有する合成ポリペプチド。 - （２）約１０〜約２５個のアミノ酸残基を含み、左から
右へ、アミノ末端からカルボキシ末端の方向にとって、
式： −ＰＡＲＰＥＴＰＳＰＡＩＰＳ− により表わされるアミノ酸残基配列を含む、特許請求の
範囲第（１）項記載の合成ポリペプチド。 - （３）ポリペプチドのアミノ酸残基配列が、左から右へ
、アミノ末端からカルボキシ末端の方向にとって式、 Ｈ−ＰＡＲＰＥＴＰＳＰＡＩＰＳ−ＯＨ により表わされる配列に相当する、特許請求の範囲第（
１）項記載の合成ポリペプチド。 - （４）合計約１２〜約４０個のアミノ酸残基を含み、複
数の結合した、特許請求の範囲第（１）項記載のポリペ
プチドから実質的になる合成ポリペプチド反復単位を含
む合成ポリペプチドオリゴマーであって、ＥＡ−Ｄによ
り誘発された抗体を結合する能力を有するオリゴマー。 - （５）ポリペプチド結合以外により互いに結合された複
数の合成ポリペプチド反復単位を含み、約１００個以上
のアミノ酸残基を含み、前記単位がＥＢＶ ＥＡ−Ｄタ
ンパク質の、そのアミノ末端からおよそ位置３５０〜お
よそ位置３６２のアミノ酸残基配列に相当する配列を有
する約６〜約４０個のアミノ酸残基から実質的になる合
成ポリペプチド重合体であって、約５〜約９のｐＨ値で
水分散性であり、ＥＡ−Ｄにより誘発された抗体と免疫
反応する能力を有する重合体。 - （６）体液試料をＥＡ−Ｄに対する抗体の存在について
検定する方法であって、 （ａ）検定する体液試料を準備する段階、 （ｂ）ＥＢＶ ＥＡ−Ｄタンパク質の、そのアミノ末端
からおよそ位置３５０〜およそ位置 ３６２のアミノ酸残基配列に相当するアミノ酸残基配列
を有する約６〜約４０個のアミノ酸残基を含む合成ポリ
ペプチドであって、 ＥＡ−Ｄにより誘発された抗体に免疫結合する能力を有
する合成ポリペプチドを準備する段階、 （ｃ）体液試料とポリペプチドとを混合して第１免疫反
応混合物を形成する段階、 （ｄ）混合物を生物検定条件下に、試料中に存在する抗
ＥＡ−Ｄ抗体がポリペプチドに免疫結合して第１免疫反
応体を形成する十分な予定時間維持する段階、および （ｅ）前記混合物中に形成された第１免疫反応体の存在
について検定する段階、 を含む方法。 - （７）体液試料が血清または血漿である、特許請求の範
囲第（６）項記載の方法。 - （８）ポリペプチドが固体マトリックスに固体支持体と
して付着され、さらに第１免疫反応体を、段階（ｅ）に
よる検定のために、 （ａ）第１免疫反応体中に存在するヒト免疫グロブリン
に結合して標識された第２免疫反応体を形成する生物活
性標識受容体であって、前記第２免疫反応体中の前記標
識受容体の存在をシグナルできる標識受容体を混合し、 （ｂ）そのように形成された混合物を生物検定条件下に
、前記標識受容体が第１免疫反応体として存在する抗Ｅ
Ａ−Ｄ抗体と第２免疫反応体を形成する十分な予定時間
維持する、 ことにより調製する、特許請求の範囲第（７）項記載の
方法。 - （９）体液試料中の抗ＥＡ−Ｄ抗体の存在について検定
する診断系であって、 （ａ）ＥＢＶ ＥＡ−Ｄタンパク質の、そのアミノ末端
からおよそ位置３５０〜およそ位置 ３６２のアミノ酸残基配列に実質的に相当するアミノ酸
残基配列を有する約６〜約４０個のアミノ酸残基から実
質的になる合成ポリペプチドであって、ＥＡ−Ｄにより
誘発された抗体により免疫結合される能力を有するポリ
ペプチド、および （ｄ）抗ＥＡ−Ｄ抗体とポリペプチドとの免疫反応をシ
グナルする標識された特異結合剤、 を個々のパッケージ中に含む診断系。 - （１０）ポリペプチドを固体マトリックスに付着させて
固体支持体を形成させ、また標識された特異結合剤が酵
素標識受容体である、特許請求の範囲第（９）項記載の
診断系。 - （１１）標識された受容体がヒト免疫グロブリンクラス
特異性である、特許請求の範囲第（１０）項記載の診断
系。 - （１２）ＥＢＶ ＥＡ−Ｄタンパク質の、そのアミノ末
端からおよそ位置３５０〜およそ位置３６２のアミノ酸
残基配列に相当する配列を有する約６〜約４０個のアミ
ノ酸残基から実質的になる合成ポリペプチドであって、
担体に結合され、生理学的に許容できる希釈剤中に分散
されたポリペプチドの有効量により構成された接種材料
。 - （１３）ＥＢＶ ＥＡ−Ｄタンパク質の、そのアミノ末
端からおよそ位置３５０〜およそ位置３６２のアミノ酸
残基配列に相当する配列を有する約６〜約４０個のアミ
ノ酸残基から実質的になる合成ポリペプチドに対して生
成され、ＥＡ−Ｄタンパク質と免疫反応できる受容体。 - （１４）溶解末梢血リンパ球から実質的になる体試料中
のＥＡ−Ｄの存在について検定する方法であって、 （ａ）試料を、ＥＢＶ ＥＡ−Ｄタンパク質の、そのア
ミノ末端からおよそ位置３５０〜およそ位置３６２のア
ミノ酸残基配列に相当する配列を有する約６〜約４０個
のアミノ酸残基から実質的になる合成ポリペプチドに対
して生成された受容体と混合して免疫反応混合物を形成
する段階、 （ｂ）混合物を生物検定条件下に、試料中に存在するＥ
Ａ−Ｄが免疫反応体を形成する十分な予定時間維持する
段階、および （ｃ）前記混合物中に形成された免疫反応体の存在につ
いて検定する段階、 を含む方法。 - （１５）体試料中のＥＡ−Ｄの存在について検定する診
断系であって、 （ａ）ＥＢＶ ＥＡ−Ｄタンパク質の、そのアミノ末端
からおよそ位置３５０〜およそ位置 ３６２のアミノ酸残基配列に相当する配列を有する約６
〜約４０個のアミノ酸残基から実質的になる合成ポリペ
プチドに対して生成された受容体であって、ＥＡ−Ｄタ
ンパク質と免疫反応できる受容体、 （ｂ）受容体とＥＡ−Ｄタンパク質との免疫反応をシグ
ナルする標識された特異結合剤、 を個々のパッケージ中に含む診断系。 - （１６）ヒト体液試料をＥＡ−Ｄに対するＩｇＡ、Ｉｇ
ＭまたはＩｇＧ抗体の量について検定する方法であって
、 （ａ）検定する血清または血漿試料を準備する段階、 （ｂ）左から右へ、アミノ末端からカルボキシ末端の方
向にとって、式、 Ｈ−ＰＡＲＰＥＴＰＳＰＡＩＰＳ−ＯＨ により表わされるアミノ酸残基配列を有する合成ポリペ
プチドを付着した固体マトリックスを含む固体支持体を
準備する段階、 （ｃ）体液試料と固体支持体とを混合して第１免疫反応
混合物を形成する段階、 （ｄ）前記免疫反応混合物を生物検定条件下に、試料中
に存在する抗ＥＡ−Ｄ抗体が固体支持体のポリペプチド
に免疫結合して第１免疫反応体を形成する十分な予定時
間維持する段階、（ｅ）その後前記固体支持体を前記体
液試料から分離する段階、 （ｆ）前記分離した固体支持体を、生物活性標識受容体
であって免疫グロブリンクラス特異性であって第１免疫
反応体として存在するクラスＩｇＡ、ＩｇＭまたはＩｇ
Ｇのヒト免疫グロブリンに結合してその存在をシグナル
できる標識受容体と混合して第２免疫反応混合物を形成
する段階、 （ｇ）形成された第２免疫反応混合物を生物検定条件下
に、前記標識受容体が第１免疫反応体として存在するＥ
Ａ−Ｄに対するＩｇＡ、ＩｇＭ、またはＩｇＧ抗体と第
２免疫反応体を形成する十分な予定時間維持する段階、 （ｈ）固体支持体を、第２免疫反応体として結合しない
標識受容体から分離する段階、および（ｉ）第２免疫反
応体として存在する標識受容体の量、それにより前記体
液試料中に存在するＩｇＡ、ＩｇＭ、またはＩｇＧ抗体
の量を検定する段階、 を含む方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US938643 | 1986-12-05 | ||
| US06/938,643 US4879213A (en) | 1986-12-05 | 1986-12-05 | Synthetic polypeptides and antibodies related to Epstein-Barr virus early antigen-diffuse |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6281648A Division JP2682959B2 (ja) | 1986-12-05 | 1994-11-16 | エプスタイン・バーウィルス初期抗原（拡散）に関連する合成ポリペプチドおよび抗体 |
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|---|---|
| JPS63225398A true JPS63225398A (ja) | 1988-09-20 |
| JP2624973B2 JP2624973B2 (ja) | 1997-06-25 |
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Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62307353A Expired - Lifetime JP2624973B2 (ja) | 1986-12-05 | 1987-12-04 | エプスタイン・バーウイルス初期抗原（拡散）に関連する合成ポリペプチドおよび抗体 |
| JP6281648A Expired - Lifetime JP2682959B2 (ja) | 1986-12-05 | 1994-11-16 | エプスタイン・バーウィルス初期抗原（拡散）に関連する合成ポリペプチドおよび抗体 |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP6281648A Expired - Lifetime JP2682959B2 (ja) | 1986-12-05 | 1994-11-16 | エプスタイン・バーウィルス初期抗原（拡散）に関連する合成ポリペプチドおよび抗体 |
Country Status (13)
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|---|---|
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| EP (1) | EP0280813B1 (ja) |
| JP (2) | JP2624973B2 (ja) |
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| AU (1) | AU610099B2 (ja) |
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| NZ (1) | NZ222794A (ja) |
| ZA (1) | ZA879025B (ja) |
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